Rastreamento de Sinalização Hipóxico dentro agregados celulares Encapsulated

Resumo

Um método para a foto de encapsulamento de células em um hidrogel reticulado PEG é descrito. Sinalização hipóxico dentro insulinoma murino encapsulado (MIN6) agregados é monitorado usando um sistema de marcador fluorescente. Este sistema permite o exame de série de células dentro de um hidrogel andaime e correlação de sinalização hipóxico com as mudanças no fenótipo celular.

Resumo

Em Diabetes mellitus tipo 1, a destruição auto-imune do pâncreas β-células resulta em perda de produção de insulina e hiperglicemia potencialmente letal. Como uma alternativa ao tratamento com injeção de insulina exógena, o transplante de tecido pancreático funcional tem sido explorado ^1,2. Esta abordagem oferece a promessa de uma forma mais natural, a restauração a longo prazo de normoglicemia. Proteção do tecido do doador a partir do sistema imune do hospedeiro é necessário para evitar a rejeição e encapsulamento é um método usado para ajudar a atingir este objectivo.

Materiais biologicamente derivados, como o alginato de agarose ³ e ^4, têm sido a escolha tradicional para a construção da cápsula, mas pode induzir inflamação ou fibrose overgrowth ^5, que podem impedir o transporte de nutrientes e oxigênio. Alternativamente, sintético poli (etileno glicol) (PEG) com base em hidrogéis são não-degradante, facilmente funcionalizados, disponível em alta pureza,têm tamanho dos poros controlável, e são extremamente biocompatível, ^6,7,8. Como um benefício adicional, hidrogéis PEG pode ser formado rapidamente em uma reação de reticulação foto simples que não requer a aplicação de não-fisiológicos temperaturas ^6,7. Tal procedimento é descrito aqui. Na reação de reticulação, degradação UV do fotoiniciador, 1 - [4 - (2-hidroxietoxi)-fenil]-2-hidroxi-2-metil-1-propano-1-one (IRGACURE 2959), produz radicais livres que atacam o vinil ligações carbono-carbono dupla de dimethacrylated crosslinking induzindo PEG (PEGDM) na cadeia termina. Reticulação pode ser alcançado em 10 minutos. Hidrogéis PEG construída de tal forma têm se mostrado favoráveis ​​de células ^7,9, ea concentração fotoiniciador baixa e uma breve exposição à radiação UV não é prejudicial à viabilidade e função do tecido encapsulado ^10. Enquanto nós metacrilato nosso PEG com o método descrito abaixo, PEGDM também pode ser dirrectamente comprado de fornecedores como a Sigma.

Uma conseqüência do encapsulamento é o isolamento das células de uma rede vascular. Fornecimento de nutrientes, nomeadamente de oxigênio, é reduzida e limitada por difusão. Esta disponibilidade de oxigênio reduzida pode especialmente impacto β-células, cuja função secretora de insulina é altamente dependente de oxigênio ^11-13. Composição da cápsula e geometria também terá impacto taxas de difusão e comprimentos de oxigênio. Portanto, nós também descrevem uma técnica para identificar as células hipóxicas dentro de cápsulas nosso PEG. Infecção das células com um adenovírus recombinante permite um sinal fluorescente a ser produzido quando intracelular fator induzível por hipóxia (HIF) vias são ativadas ^14. Como HIFs são os principais reguladores da resposta transcricional a hipóxia, eles representam um marcador de alvo ideal para a detecção de hipóxia sinalização ^15. Esta abordagem permite a detecção mais fácil e rápida de hypoxic células. Resumidamente, o adenovírus tem a seqüência de uma proteína fluorescente vermelha (Red Ds DR de Clontech) sob o controle de um elemento de hipóxia-responsivos (HRE) trímero. Estabilização do HIF-1 por condições de baixo oxigênio irá conduzir a transcrição da proteína fluorescente (Figura 1). Detalhes adicionais sobre a construção desse vírus têm sido publicados anteriormente ^15. O vírus é armazenado em glicerol 10% a -80 ° C como muitos 150 mL alíquotas em 1,5 mL tubos de centrífuga em uma concentração de 3,4 x ¹⁰ 10 PFU / mL.

Estudos anteriores em nosso laboratório mostraram que MIN6 células encapsuladas como agregados manter a sua viabilidade ao longo de 4 semanas de cultura em 20% de oxigênio. MIN6 agregados cultivadas em 2 ou 1% de oxigênio mostrou dois sinais de células necróticas (ainda cerca de 85-90% viável) através da coloração com brometo de etídio, bem como alterações morfológicas em relação às células de oxigênio 20%. A forma lisa esférica dos agregados exibido em 20% foi lost e agregados apareceu mais como grupos desorganizados de células. Enquanto a tensão de oxigênio não causar uma queda acentuada da viabilidade, é claramente impactando MIN6 agregação e funcionar como medida pela glicose estimulada a secreção de insulina ^15. Ocidental blot de células encapsuladas em 20% e 1% de oxigênio também mostrou um aumento significativo na HIF-1α em células cultivadas em condições de baixo oxigênio que se correlaciona com a expressão da proteína DsRed DR.

Protocolo

1. PEGDM síntese e fotoativo PEGDM preparação da solução macrômero

1. Pesar 2 g de PEG (linear, 10.000 Da) em um frasco de vidro 40mL com tampa de plástico duro.
2. Adicionar aproximadamente 308μL de anidrido metacrílico e vagamente tampa do frasco.
3. Microondas o frasco em alta por 2 minutos no microondas doméstico padrão. Uso de luvas resistentes ao calor, completamente vortex do frasco, em seguida, microondas em alta por mais 5 minutos.
4. Brevemente permitir que o frasco para resfriar o suficiente para ser manuseado com luvas. Uncap-lo e adicionar lentamente o cloreto de metileno enquanto agita o frasco. Adicionar o suficiente para que a solução aparece clara e homogênea, vórtex da amostra, conforme necessário. O volume total de cloreto de metileno usado deve ser 1,5-2 mL.
5. PEGDM precipitado em 200 mL de frio, agitado éter etílico, adicionando a solução gota a gota.
6. Recolher o PEGDM por filtração a vácuo e deixe-a secar.
7. Dissolver o PEGDM em uma quantidade adequadade água deionizada (tipicamente 100 -150 mL).
8. A solução diálise contra água deionizada por 5 dias em tubo de diálise com um peso molecular de corte de 1.000 Da. Substitua a água uma vez por dia.
9. Alíquota da solução em recipientes adequados e congelar a -80 ° C durante a noite. Lyophilize a solução para quatro dias para produzir um pó purificado PEGDM branco. Armazenar o pó a 4 ° C quando não estiver em uso.
10. Para preparar uma solução PEGDM fotoativo, primeiro prepare um peso 0,5 por cento solução estoque, dissolvendo fotoiniciador IRGACURE 2959 em água deionizada. Vortex da solução e armazená-lo no escuro.
11. Prepare a 10% em peso PEGDM e 0,025% em peso IRGACURE 2959 solução em solução salina balanceada de Hank (HBSS). Vortex cuidadosamente para garantir a dissolução da PEGDM. Normalmente, preparar 1mL desta solução de cada vez.
12. Esterilizar a solução filtrando-a através de um filtro de seringa de 0,2 m em um tubo de microcentrífuga 1,8 mL. Enrole o tubo em papel alumínioe armazenar a 4 ° C

2. Cultura, infecção, e agregação de células MIN6

1. MIN6 células são cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS, glicose 7mm, 100 unidades / mL de penicilina / estreptomicina e 0,5 mcg / mL amphotercin B em um ambiente umidificado a 37 ° C e 5% CO _2.
2. Para liberar as células da superfície tratada cultura frasco, aspire o meio, lavar as células com 37 ° C de cálcio / magnésio livre de HBSS, aspirar o HBSS, em seguida, adicione 2 mL da solução 37 ° C tripsina-EDTA e permitir que as células incubar por 3 minutos.
3. Jar firmemente do lado do frasco para bater as células livres, em seguida, adicione 8 mL de 37 ° C médio e vigorosamente pipeta suspensão de células cima e para baixo com cuidado para não introduzir bolhas.
4. Pipeta as células em um tubo de centrifugação estéril 15 mL e realizar uma contagem de células usando um hemocitômetro ou outra célula contagem procedimento.
5. Na preparação para infectar as células com o fabricantevírus, primeiro determine o número total de células a serem infectadas e calcular o volume de suspensão de vírus necessários para atingir a multiplicidade desejado de infecção (MOI) (50 a 100 partículas infecciosas por célula).
6. Diluir o vírus em HBSS com cuidado pipetar a quantidade adequada de suspensão de vírus em um volume pré-alíquotas de HBSS em um tubo de microcentrífuga de 1,8 mL. 50 mL de HBSS por poço de células agregando é apropriado.
7. Dispersar as células por pipetagem-los cima e para baixo em seu tubo, em seguida, pipetar o volume necessário para atingir 400 mil células por poço em poços de uma placa de cultura de 6 bem suspensão.
8. Adicionar o volume apropriado de vírus diluído em cada poço para alcançar o desejado MOI.
9. Adicionar média a cada poço para trazer o volume total até 1,7 mL.
10. Coloque a placa em um agitador orbital no interior da incubadora. Definir o agitador em um nível baixo de modo que o meio lava delicadamente ao redor dos poços (~ 100 rpm). Permitir que as células a agregaçãote para 24-36 horas. Agregados com um diâmetro aproximado de 75-175 mM deve ser formado.

3. Encapsulamento de células em PEGDM

1. Células podem ser encapsulados como uma dispersão (passo 2.4) ou agregação seguinte (passo 2.10). Desde o hidrogel solução PEGDM precursor é um líquido, as células tendem a resolver antes de reticulação e formação de hidrogel. Se a liquidação está prevista para ocorrer rapidamente, como com os agregados maiores, ela pode ser benéfica para produzir o hidrogel em duas etapas para que as células liquidar a um plano central do gel. A um passo procedimento de síntese de hidrogel apropriada para células dispersas é mostrada (Figura 2) e do procedimento em duas etapas também é mostrado (Figura 3) e detalhado abaixo (3,2-3,9).
2. Criar uma embarcação em que o hidrogel será formado por cortar a ponta afilada fora de uma seringa de 1 mL de plástico e colocá-lo aberto acabar em um rack.
3. Pipete 20 de PEGDM fotoativo assimlução na extremidade aberta da seringa para o êmbolo certificando-se o volume de cobre a superfície de êmbolo inteiro. Ajustar o êmbolo em pequenos incrementos para alcançar uma superfície plana de fluido.
4. Coloque a pipeta no rack e posição do rack debaixo de uma lâmpada UV (365nm, ~ 7 mW / cm ²⁾ por aproximadamente 8 minutos para permitir crosslinking hidrogel. Durante este tempo, a preparação das células pode ser iniciada
5. Volume de uma pipeta contendo o número desejado de células / agregados em um tubo de microcentrífuga 1,8 mL tampão, e centrifugar o tubo a 130 g por 5 minutos.
6. Usando uma micropipeta, remova cuidadosamente os meios de comunicação, sem perturbar o pellet celular na ponta do tubo. Como a cabeça media se aproxima do pellet, pode ser útil usar um mais fino, 10 mL ponta da pipeta.
7. Delicadamente ressuspender o pellet celular em 20 mL de solução fotoativo PEGDM (use a ponta da pipeta de boca larga, se trabalhar com agregados) e adicione a suspensão de células para a seringa em cima do diae anteriormente reticulado parte hidrogel.
8. Expor a seringa a um adicional de 8 minutos de luz UV para completar a construção do hidrogel. Quando terminar, as células devem ser totalmente encapsulados dentro do hidrogel cilíndrico (Figura 3).
9. Ejetar o hidrogel da seringa e em 1 mL de HBSS no poço de uma placa de 24 poços brevemente lavar o gel. Transferir o gel para 1 mL da mídia no poço de uma placa de 24 poços e da cultura nas condições desejadas.

4. Rastreamento de hipóxia

1. Em qualquer ponto durante a cultura da imagem, as células por microscopia de fluorescência para acompanhar o início da sinalização hipóxica. Dependendo do que está sendo fotografada você pode imagem na placa multi-bem ou transferir o gel para uma lâmina de microscópio antes da colocação no palco microscópio. Pico de excitação Ds Vermelho é alcançado a 556nm e de emissão de pico ocorre em 586nm. Emissão é bastante intensa e, portanto, fotodegradação não foi observáveled a ser problemático. Intervalo de tempo entre o início da produção de proteínas e detecção primeiro sinal é de aproximadamente 12 horas. Sinal é específico o suficiente para identificar as células individuais de sinalização, mas a resolução pode ser inadequado para determinar a localização do sinal intracelular. Em células de sinalização, o sinal é tipicamente observada uniformemente por todo o citoplasma. Intensidade do sinal também pode aumentar com a exposição prolongada à hipóxia, embora ainda não totalmente determinado, se isto é devido ao aumento da expressão da proteína, o acúmulo de proteína total, proteína ou maturação atrasada.

5. Resultados representativos

Um exemplo representativo de MIN6 agregados encapsulados em um hidrogel PEG é mostrado na Figura 4. O gel reticulado será sólida por toda parte, tomando a forma do navio em que a reação foi realizada. Um gel com superfícies lisas exterior é preferível para o implante para auxiliar na prevenção de uma re corpo estranhosponse. Dentro do gel, agregados celulares deve ser totalmente fechado na matriz e homogeneamente distribuída para permitir a melhoria do transporte de nutrientes.

Imagens representativas de sinalização hipóxica em MIN6 agregados são apresentados na Figura 5. Idêntica MIN6 agregados infectados com o vírus marcador foram cultivadas em ambos os 20% O ₂ (5-A) ou 1% O ₂ (5-B) por 44 horas antes da captura da imagem.

Figura 1. Esquemática da atividade do nosso sistema de marcador de hipóxia. Inserção adenoviral do gene DR Red Ds e promotor a montante HRE permite induzida por hipóxia produção da proteína fluorescente sob o controle do HIF-1.

Figura 2. Fluxograma processual para o encapsulamento de uma etapa de dispersão MIN6 células em uma crosslinked hidrogel PEGDM. Para cada gel, as células dispersas são suspensas em 40μL da solução macrômero fotoativo PEGDM. Este é colocado em uma seringa de 1ml e decapitado o hidrogel é formado sob luz UV 365 nm, após 10-12 minutos. Após a conclusão, o disco de hidrogel é removido da seringa, lavados e colocados em uma placa de médio encheu bem para incubação.

Figura 3. Fluxograma processual para o encapsulamento dual-passo de agregados MIN6 células em um hidrogel reticulado PEGDM. Para cada gel, gel-meia é o primeiro formado por reticulação UV de 20μL da solução macrômero fotoativo PEGDM por 8 minutos. MIN6 agregados são cuidadosamente suspensas em uma solução de 20μL adicional de fotoativo macrômero que é adicionado no topo do pré-formada meia-gel. O gel completo é formado por um adicional de 8 minutos de exposição UV com agregados totalmente encapsulado no medialplano do gel.

Figura 4. Imagem de um hidrogel 40μL em 20X ampliação. MIN6 agregados (~ 400.000 células total) são claramente vistos dentro do gel. Hidrogel diâmetro é de cerca de 6mm (bar = 1 mm).

Figura 5. Hipóxia Fluorescente sinalização em agregados MIN6 células em um hidrogel PEGDM. Células que foram encapsulados e, em seguida, colocado em incubação a 20% O ₂ por 44 horas não apresentam sinalização hipóxia (a), enquanto as células que foram encapsulados, em seguida, incubadas em 2% O ₂ por 44 horas exibição de sinal, claro onipresente. (Barra = 100μm) (b).

Discussão

O método aqui apresentado oferece uma técnica rápida e simples para encapsulamento de células em um hidrogel PEG com uso mínimo de condições não fisiológicas. PEG representa um material de encapsulação muito útil para a sua biocompatibilidade e facilidade de modificação. Simples variação de porcentagem de PEG na solução fotoativo, por exemplo, pode ser usado para ajustar as propriedades mecânicas, como módulo de compressão, e propriedades de transporte através do tamanho dos poros. Além disso, PEG é facilmente modificado pela adição de cadeias laterais. Hidrogéis PEG, portanto, representar tanto um dispositivo promissor clínica e uma plataforma flexível para investigação in vitro

Um método para rastreamento de hipóxia em PEG-encapsulado células também tem sido apresentado. Este método é útil para a simplicidade da detecção de hipóxia e para evitar a necessidade de sacrificar as células de interesse. A técnica pode ser aplicada a uma variedade de tipos de células em uma variedade de condições de fazer a sua nosefulness amplo. Por exemplo, a hipóxia como uma dica para a diferenciação de células-tronco podem ser controladas em culturas de células-tronco Micromass. No entanto, este método só pode ser aplicada para dispersar sistemas de célula ou sistema no qual as células são dispersos depois agregadas. Além disso, a detecção do sinal fluorescente pode ser difícil em tecidos maiores ou mais densas.

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comments (opcional
PEG	Sigma-Aldrich	309028-500G
Anidrido metacrílico	Sigma-Aldrich	276685-100ML
Microonda	Emerson	MW8784SB
Vortexer	Scientific Industries	SI-A236
Cloreto de metileno	Sigma-Aldrich	D65100-1L
Éter etílico	Sigma-Aldrich	346136-1L
Tubulação de diálise	Espectro	132640
	Laboratórios
Congelador
Liofilizador	Labconco	7670521
Bomba de vácuo	Ludibriar	8917Z-01
IRGACURE 2959	Ciba-Geigy	029891301PS04
HBSS	Mediatech	21-022-CV
Filtro de seringa	VWR	28145-477
RPMI 1640	Mediatech	*	* Formulação personalizada
FBS	PAA Laboratories	A15-351
Penicilina-estreptomicina	Mediatech	30-002-CI
Anfotericina B	Mediatech	30-003-CF
Incubadora	Thermo Scientific	3597	Napco Series 8000 WJ supressão w / O2
Tripsina EDTA	Mediatech	25-052-CI
Orbital Shaker	VWR	12620-926
Lâmpada UV	Sanyo Denri	FLR40SBLB / M	Detém dois 40W, 365nm blacklight lâmpadas UV azul
Centrifugador	Eppendorf	5811 000.010 *	* Número de ordem. Modelo 5810 R
Microscópio	Nikon	TI-ND6-PFS	Com filterset para excitação 556nm / 586nm de emissão