Protocole amélioré pour la microdissection laser d'îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux

Résumé

Microdissection laser est une technique qui permet la récupération des cellules sélectionnées à partir des quantités infimes de parenchyme. Nous décrivons ici un protocole pour l'acquisition des îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux être utilisés pour les études transcriptomiques. Notre protocole améliore l'autofluorescence intrinsèque des cellules bêta humaines, facilitant ainsi leur collection.

Résumé

Microdissection laser (LMD) est une technique qui permet la récupération des cellules et des tissus sélectionnés à partir des quantités infimes de ^1,2 parenchyme. Les cellules disséqués peut être utilisé pour une variété d'enquêtes, telles que les études de transcriptomique ou la protéomique, l'évaluation de l'ADN ou l'analyse chromosomique ^2,3. Une application particulièrement difficile du LMD est l'analyse du transcriptome, qui, en raison de la labilité de l'ARN ^4, peut être particulièrement importante lorsque les cellules sont disséqués à partir de tissus qui sont riches de RNases, comme le pancréas. Un protocole de microdissection qui permet une identification rapide et la collecte de cellules cibles est essentielle dans ce cadre afin de raccourcir le temps de traitement des tissus et, par conséquent, d'assurer la conservation d'ARN.

Nous décrivons ici un protocole pour l'acquisition des cellules bêta pancréatiques à partir de spécimens chirurgicaux être utilisés pour les études transcriptomiques ^5. De petits morceaux de pancréas de environ 0,5-1 cm ³ ont été découpés à partir des marges saines apparaissant de spécimens du pancréas réséqués, noyés dans du Tissue-Tek OCT, composé immédiatement congelés dans réfrigéré 2-méthylbutane, et conservés à -80 ° C jusqu'à ce que la coupe. Quarante coupes sériées de 10 um d'épaisseur ont été coupées au cryostat dans un cadre de -20 ° C, transférés individuellement dans des lames de verre, séché à l'intérieur du cryostat pendant 1-2 min, et conservés à -80 ° C.

Immédiatement avant la procédure de microdissection laser, coupes ont été fixées dans le froid de la glace, fraîchement préparé l'éthanol à 70% pendant 30 sec, lavé par 5-6 plonge dans la glace froide eau traitée au DEPC, et déshydratée par deux incubations d'une minute dans la glace froide 100% l'éthanol suivie par le xylène (qui est utilisé pour la déshydratation des tissus) pendant 4 min; coupes de tissus ont ensuite été séchés à l'air pendant 3-5 min après. Surtout, toutes les mesures, à l'exception de l'incubation dans du xylène, ont été effectuées à l'aide glacées réactifs - une modification sur un protocole décrit précédemment ^6. Utahilization de réactifs glacées entraîné une augmentation marquée de l'autofluorescence intrinsèque des cellules bêta, et de faciliter leur reconnaissance. Pour microdissection, quatre sections ont été déshydratées à chaque fois: deux ont été placés dans une feuille gainé de tube de 50 ml, pour protéger le tissu de l'humidité et de blanchiment, les deux autres ont été immédiatement microdisséqué. Cette procédure a été réalisée à l'aide d'un instrument PALM MicroBeam (Zeiss) en utilisant la pression Laser automatique Ejection (AutoLPC) mode. L'achèvement de la cellule bêta / dissection îlot de quatre cryosections requis ne dépasse pas 40-60 min. Les cellules ont été rassemblés dans un AdhesiveCap et lysées avec 10 ul de tampon de lyse. Chaque échantillon d'ARN unique pour l'analyse du transcriptome a été obtenue en combinant des échantillons de 10 cellules par microdissection, suivie d'une extraction d'ARN en utilisant le Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Ce protocole améliore l'autofluorescence intrinsèque des cellules bêta humaines, facilitant ainsi leur reconnaissance rapide et exacte, et collection. Poursuite de l'amélioration de cette procédure pourrait permettre la dissection des cellules bêta phénotypiquement différentes, avec des implications possibles pour mieux comprendre les changements liés à diabète de type 2.

Protocole

1. La congélation des tissus pancréatiques humaines

1. Retirer le tissu adipeux, les vaisseaux sanguins, les nerfs et les tissus parenchymateux non avec un scalpel et pince à épiler, et couper le tissu pancréatique en morceaux (~ 0,5 à 1 cm cubes).
2. Placez un morceau de tissu pancréatique dans le centre d'une Cryomold, et le couvrir complètement avec le froid Tissue-Tek composé octobre Mettez le Cryomold dans un bocal dont le fond est recouvert de pré-refroidi 2-méthylbutane et snap-gel dans de l'azote liquide. Conserver l'échantillon congelé à -80 ° C.

2. Préparation des sections congelées

1. Porter des gants pendant toutes les mesures nécessaires pour éviter la dénaturation de l'ARN.
2. Nettoyez le couteau cryostat, porte-échantillon et le pinceau avec de l'éthanol 100% froid et RNase Away. Placez le tissu congelé à l'intérieur du cryostat.
3. Attendez jusqu'à ce que le tissu, le couteau et pinceau atteindre -20 ° C. Étiquetez le SuperFrost Plus diapositives de pré-refroidir eux à l'intérieur de la chambre de cryostat en attendantpour atteindre le tissu à -20 ° C.
4. Appliquer le Tissue-Tek OCT composés sur le porte-échantillon et placer le tissu congelé sur le dessus.
5. Une fois que le composé Tissue-Tek OCT est gelé couper le cryoblock et enlever tout excès de composé Tissue-Tek OCT avec une lame de rasoir.
6. Couper un total de 40 um 10 tranches consécutives à partir du bloc de tissu pancréatique. En outre, nous recommandons de couper une tranche prénom et d'être sauvés pour plans d'ensemble de la section du pancréas qui peut faciliter l'identification des îlots à l'intérieur des tranches au cours du processus de microdissection.
7. Transférer les sections de la lame de couteau au centre d'un SuperFrost Plus diaporama en appuyant sur l'arrière de la lame avec votre doigt (recouvert d'un gant) pour se réchauffer que la région à laquelle la section doit se conformer.
8. Sécher le min articles 1-2 à l'intérieur du cryostat à -20 ° C, après quoi vous les mettez dans une boîte à lames placés sur de la glace sèche. Stocker les sectionsà -80 ° C.
9. Si nécessaire, nettoyer la lame du couteau avec du papier absorbant et froid d'éthanol à 100%.

3. Déshydratation des sections congelées

1. Préparer les réactifs: versez 30 ml fraîchement préparée éthanol à 70%, 30 ml eau traitée au DEPC, 2x30 ml d'éthanol à 100% et 30 ml de xylène dans des tubes de 50 ml (CELLSTAR Falcons); froid et de conserver tous les réactifs (sauf le xylène) sur la glace.
2. Nettoyez l'espace de travail sous le capot avec de l'éthanol à 100% et RNaseZAP.
3. Processus en deux cryosections comme suit: fixer dans la glace froide d'éthanol à 70% pendant 30 sec, laver avec 5-6 trempettes dans la glace froide eau traitée au DEPC, déshydrater deux fois pendant 1 min dans la glace 100% d'éthanol froid, incuber pendant 4 min dans le xylène à la température ambiante (25 ° C), et de l'air sec pendant 3-5 min. Répétez cette étape avec une autre paire de cryosections.
4. Insérez deux cryosections séchées dos à dos dans un tube de 50 ml Cellstar enveloppé d'une feuille d'aluminium pour les protéger de la lumière et de l'humidité.

4. La microdissection laser de bêta-cellules avec PALM MicroBeam, Zeiss

1. Nettoyer le microscope avec RNaseZAP et montez le Cap adhésif dans le RoboMover.
2. Définissez les paramètres suivants: Définir le filtre 09 (excitation: 450-490 nm, émission> 515 nm), AutoLPC mode, l'énergie du laser de 50%, 65% focalisation du laser, laser vitesse de 100%, une distance de 5 um entre les prises AutoLPC, une distance de 6 um à la ligne, hauteur de travail: -10.100.
3. Insérer une diapositive dans le stade.
4. Repérez les cellules bêta autofluorescentes sous visualisation microscopique (objectif 5x ou 10x).
5. Passez à l'objectif 40x, sélectionnez les cellules bêta avec l'outil "main levée" de sélection et les microdissect utilisant le laser.
6. Capturez le tissu de quatre cryosections déshydratés dans un AdhesiveCap.
   Remarque 1: le temps de disséquer les cellules bêta d'un cryosection déshydraté ne doit pas être plus long que 10-20 min pour éviter la réhydratation des coupes de tissus qui se traduirait parDégradation de l'ARN.
   Commentaire 2: vérifier procédé de microdissection succès par inspection visuelle après le déplacement de la scène au point de contrôle.

5. La lyse des cellules bêta des tissus microdisséqués enrichi

1. Retirez le AdhesiveCap de la RoboMover.
2. Pipeter 10 ul de tampon d'extraction (XB, PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus) dans le couvercle de la AdhesiveCap et incuber à l'envers à 42 ° C pendant 30 min.
3. Centrifuger à 10000 xg et mettre le lysat sur glace sèche. Stocker à -80 ° C jusqu'à l'extraction d'ARN est réalisée.
4. Répétez les étapes 3.) À 5.) Avec toutes les autres sections.

6. Extraction de l'ARN

1. Mélanger tous les 10 dix lysats pi
2. Procéder à l'isolement de l'ARN en travaillant à la température ambiante selon le protocole du kit PicoPure RNA Isolation, Arcturus, à l'aide d'un tampon d'extraction 01h01 ratio (XB) à l'éthanol 70% (y compris le traitement DNase).

7. Analyse des ARN

1. Utilisez 1 ul d'ARN pour l'analyse de la qualité et de la quantité à l'aide d'un Agilent 2100 Bioanalyser (picoChip). L'évaluation quantitative est faite en référence à un ARN standard chargées en parallèle sur la puce.

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Résultats

Comme le montre la figure 1, le protocole modifié déshydratation conduit à une amélioration de l'autofluorescence des cellules bêta par rapport à la précédente protocole publié ^6. En appliquant le protocole décrit, chacun des 39 spécimens chirurgicaux pancréatiques a été utilisé pour produire 40 cryosections série pour une moyenne de ³ um 31'544'704 tissu / pancréas spécimen (plage: 8'742'390 - 81'522'153 um ³⁾ comme le montr...

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Discussion

Nous décrivons une approche fiable pour la microdissection laser (LMD) des îlots pancréatiques humains à partir spécimen chirurgical. À condition qu'un microscope LMD est disponible, cette procédure pourrait être appliquée à tout établissement de recherche effectuant pancréatectomies partielles, augmentant ainsi l'accès au matériel îlots humains à partir de deux 2 non-diabétiques et les sujets diabétiques de type. Ceci est particulièrement pertinent étant donné la rareté de pancréas offert...

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matériels

Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-méthylbutane (isopentane)	ROTH	3927.1
AdhesiveCap (opaque, 500 pi)	ZEISS	415190-9201-000
Cellstar Tubes (50 ml)	Greiner Bio-One	210 261	avec jupe soutien
Cellstar Tubes (50 ml)	Greiner Bio-One	227,261
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	SIGMA	D 5758
La glace sèche
L'éthanol absolu	VWR	20821.310
L'azote liquide
Pinceau
PALM MicroBeam	ZEISS
Intégration Peel-a-Way moules (tronquée), 12 x 12 mm	ProSciTech	RR12	Top mm intérieur 22x22, profondeur 21 mm
Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit	Applied Biosystems	KIT 0204
Pince en plastique
Rasoir
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254
RNaseZAP	SIGMA	2020 R
Scalpel /Lame chirurgicale	Couper Techno	2800111
SuperFrost Plus microscope diapositives d'adhésion	Thermo Scientific	J1800AMNZ	25x75x1.0 mm
Tissue-Tek composé OCT	Sakura	4583 ou 0807000022
Pince à épiler	BRAUN	BD168R
Xylène	VWR	28975.291