Улучшенный протокол для лазерных микродиссекции человека панкреатических островков от хирургических образцах

Dorothée Sturm; Lorella Marselli; Florian Ehehalt; Daniela Richter; Marius Distler; Stephan Kersting; Robert Grützmann; Krister Bokvist; Philippe Froguel; Robin Liechti; Anne Jörns; Paolo Meda; Gustavo Bruno Baretton; Hans-Detlev Saeger; Anke M. Schulte; Piero Marchetti; Michele Solimena

doi:10.3791/50231

АВТОРЫ

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

Резюме
Аннотация
протокол
Результаты
Обсуждение
Раскрытие информации
Благодарности
Материалы
Ссылки
Перепечатки и разрешения

Резюме

Лазерная микродиссекции является метод, который позволяет восстановление выделенных ячеек незначительное количество паренхимы. Здесь мы опишем протокол для приобретения человеческих панкреатических островков из операционного материала, который будет использоваться для транскриптомных исследований. Наш протокол улучшает внутреннее аутофлюоресценции человека бета-клетки, способствуя тем самым их коллекции.

Аннотация

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma ^1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis ^2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA ⁴, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation.

Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies ⁵. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm³ were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 °C until sectioning. Forty serial sections of 10 μm thickness were cut on a cryostat under a -20 °C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 °C.

Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol ⁶. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 μl lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

протокол

1. Замораживание человеческих тканей поджелудочной железы

Удалить жировой ткани, кровеносные сосуды, нервы и не паренхиматозной ткани с помощью скальпеля и пинцета, и сократить ткани поджелудочной железы на куски (~ 0.5-1 кубов см).
Поместите один кусок ткани поджелудочной железы в центре Cryomold, и покроют его полностью с холодным Tissue-Tek соединение октября Положить Cryomold в банку, дно которой покрыто предварительно охлажденный 2-метилбутан и оснастки замораживание в жидком азоте. Хранить замороженные образцы при -80 ° C.

2. Подготовка замороженных срезов

Надевайте перчатки во все меры, чтобы избежать денатурации РНК.
Очистите криостата нож, держатель образца и кисть с холодными 100% этанола и РНКазы в гостях. Поместите замороженные ткани внутри криостата.
Подождите, пока ткань, нож и щеточка достигают -20 ° C. Этикетка SuperFrost Plus слайдов и предварительно охладить их внутри криостата камере в ожиданиидля тканей достичь -20 ° C.
Применить Tissue-Tek октября Соединение на держатель образца и поместить замороженной ткани на вершине.
После того, Tissue-Tek октября Соединение заморожен обрезать cryoblock и удалите излишки Tissue-Tek соединение октября с лезвием бритвы.
Вырезать в общей сложности 40 последовательных 10 мкм кусочки от блока ткани поджелудочной железы. Кроме того, мы рекомендуем резки начального и среднего среза должны быть сохранены для обзора рисунков поджелудочной железы раздел, который может способствовать выявлению островки в пределах ломтики во время микродиссекции процесса.
Передача секций от лезвия ножа в центре SuperFrost Plus слайдов, нажав на обратной стороне слайда пальцем (покрытые перчатки), чтобы разогреться только региона, к которому разделе будем придерживаться.
Высушите разделах 1-2 мин внутри криостата при температуре -20 ° C, после чего положить их в коробку слайдов размещены на сухом льду. Хранить разделахпри -80 ° C.
Если необходимо, протрите лезвие ножа с бумажными полотенцами и холодным 100% этанола.

3. Обезвоживание замороженных срезов

Подготовка реагентов: налить 30 мл свежеприготовленного 70% этанола, 30 мл DEPC обработанной воды, 2x30 мл 100% этанола и 30 мл ксилола в 50 мл пробирки Cellstar (Соколов); холод и держать все реагенты (за исключением ксилола) на льду.
Очистите рабочее пространство под капотом со 100% этанола и RNaseZAP.
Процесс две cryosections следующим образом: закрепить в ледяной 70% этанола в течение 30 сек, промыть 5-6 быстрых провалов в ледяную DEPC обработанной воды, обезвоживают в два раза в течение 1 мин в ледяной 100% этанола, инкубировать в течение 4 мин в ксилоле при комнатной температуре (25 ° C), и сухой воздух в течение 3-5 мин. Повторите этот шаг с другой парой cryosections.
Вставьте две сушеные cryosections спина к спине в 50 мл Cellstar трубка обернута алюминиевой фольгой, чтобы защитить их от света и влаги.

<р = класса "jove_title"> 4. Лазерная Microdissection бета-клеток с PALM Microbeam, Zeiss

Очистите микроскоп с RNaseZAP и смонтировать клей Cap в RoboMover.
Установить следующие параметры: набор фильтров 09 (возбуждение: 450-490 нм, эмиссия> 515 нм), AutoLPC режиме, 50% лазерной энергии, 65% лазерного фокуса, 100% лазерная скорости, 5 мкм, расстояние между AutoLPC выстрелов, 6 мкм расстоянии к линии, рабочая высота: -10100.
Вставьте один слайд на сцене.
Найдите аутофлуоресцентной бета-клетки под микроскопом визуализации (5x или 10x объектив).
Переключитесь на 40x объектив, выберите бета-клеток с "Freehand" Выбор инструмента и microdissect их с помощью лазера.
Захват ткани из четырех обезвоженной cryosections в одном AdhesiveCap.
Комментарий 1: время, чтобы рассекать бета-клеток одного обезвоженной cryosection не должна быть больше, чем 10-20 минут, чтобы избежать регидратации срезов тканей, которое может привести вДеградации РНК.
Комментарий 2: проверить успешность процесса микродиссекции путем визуального осмотра после переезда на сцену, чтобы контрольно-пропускной пункт.

5. Лизис микродиссекции Beta Ткань сотовый Обогащенный

Снимите AdhesiveCap от RoboMover.
Внесите 10 мкл буфера для экстракции (ВБ, PicoPure выделения РНК Kit, Arcturus) в крышку AdhesiveCap и инкубировать ее вверх дном при 42 ° С в течение 30 мин.
Спином вниз на 10000 XG и поставить лизат на сухом льду. Хранить при температуре -80 ° C до выделения РНК выполняют.
Повторите шаги 3.) До 5.) Со всеми другими разделами.

6. Экстракция РНК

Смешайте все десять 10 мкл лизатов
Приступить к изоляции РНК, работая при комнатной температуре в соответствии с протоколом PicoPure выделения РНК Kit, Арктур, используя Добыча соотношении 1:1 Buffer (ВБ) до 70% этанола (в том числе лечение ДНКазой).

7. Анализ РНК

Используйте 1 мкл РНК для анализа качества и количества использованием Agilent 2100 Bioanalyser (PicoChip). Количественная оценка делается по отношению к стандартным РНК загружается параллельно на чипе.