Imagerie en temps réel des hétérotypique plaquettes neutrophiles interactions sur l'endothélium activé lors de l'inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes

Résumé

Nous rapportons ici une technique expérimentale de la microscopie de fluorescence intravitale de visualiser hétérotypiques plaquettes neutrophiles interactions sur l'endothélium activé lors de l'inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes. Cette technologie microscopique seront très utiles pour étudier le mécanisme moléculaire de la maladie vasculaire et de tester des agents pharmacologiques dans des conditions physiopathologiques.

Résumé

L'interaction des plaquettes activées et des leucocytes neutrophiles (essentiellement) sur l'endothélium activé médie la thrombose et l'inflammation vasculaire. ^1,2 Au cours de la formation de thrombus au site de la lésion artériolaire, plaquettes adhérentes à l'endothélium activé et protéines de la matrice de support de roulement sous-endothéliales des neutrophiles et d'adhérence. ³ Inversement, dans des conditions inflammatoires veinules, les neutrophiles adhérents à l'endothélium activé peut prendre en charge l'adhésion et l'accumulation des plaquettes circulantes. Hétérotypique plaquettes agrégation des neutrophiles nécessite des processus séquentiels par les interactions spécifiques des récepteurs à gré entre les cellules. ⁴ Il est connu que les cellules endothéliales activées libèrent des molécules d'adhésion telles que le facteur von Willebrand, amorçant ainsi l'adhésion des plaquettes et accumulation dans les conditions de cisaillement élevées. ^{5 En} outre, cellules endothéliales activées en charge de roulement et l'adhérence des neutrophiles par les sélectines exprimant uneMolécule d-1 d'adhésion intercellulaire (ICAM-1), respectivement, dans des conditions de faible cisaillement. ⁴ plaquettes P-sélectine interagit avec les neutrophiles par la P-sélectine ligand glycoprotéine-1 (PSGL-1), ce qui induit l'activation des neutrophiles de β2 intégrines et fermes l'adhérence entre deux types de cellules. Malgré les progrès réalisés dans des expériences in vitro dans lequel hétérotypiques plaquettes neutrophiles interactions sont déterminées dans le sang ou des cellules isolées, ^6,7 ces études ne peuvent pas manipuler les conditions de stress oxydant au cours de la maladie vasculaire. Dans ce rapport, l'aide à marquage fluorescent, des anticorps spécifiques contre une souris plaquettes et des neutrophiles marqueur, nous décrivons un protocole détaillé intravitale microscopique pour surveiller les interactions hétérotypiques de plaquettes et de neutrophiles sur l'endothélium activé lors de TNF-α induite par l'inflammation ou à la suite induite par laser blessure musculaire crémaster microvaisseaux des souris vivantes.

Protocole

1. Préparation du microscope intravitale (figure 1A)

1. Préparer un tampon surfusion (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM de CaCl _2, MgCl ₂ 1 mM, et 17 mM de ₃ NaHCO, pH 7,4).
2. Activer un bain d'eau pour maintenir la température de circulation de tampon et une couverture thermo-contrôlé à 37 ° C. Aérer tampon avec de l'azote gazeux (5% de CO ₂ en balance avec de l'azote).
3. Allumez le système de microscope (Sutter Lambda DG-4 haute vitesse changeur de longueur d'onde, poste de travail informatique, Olympus BX61W microscope, MPC-200 multi-manipulateur, RE-200 contrôleur de scène, caméra à haute vitesse et intensif).
4. Pour le modèle de l'inflammation vasculaire, utiliser un miroir dichroïque 100%. Pour induire la formation de thrombus par une blessure au laser, remplacer un miroir de 100% avec un miroir 50/50% et tournent sur un système d'ablation laser micropoint.

2. Préparation du muscle crémaster pour la microscopie intravitale (figure 1B)

1. Anesthésier unsouris mâle (6-8 semaines, C57BL / 6) par injection intrapéritonéale de kétamine (125 mg poids corporel / kg (BW)) et de xylazine (12,5 mg / kg de poids corporel). L'Université de l'Illinois Soins des animaux et du Comité institutionnel utilisation approuvé tous les soins des animaux et des procédures expérimentales. Pour un modèle d'inflammation vasculaire, injecter murine TNF-α (0,5 pg dans 250 ul solution saline) intrascrotally dans une souris 3 heures avant l'imagerie (2-2.5 heures avant la chirurgie).
2. Placez la souris sur une couverture thermo-contrôlée à 37 ° C sur une plaque de microscope intravitale.
3. Tirez la peau à la surface du cou à l'aide des pinces et inciser horizontalement la ligne médiane de la peau du cou jusqu'à 1 cm avec des ciseaux.
4. Ouvrez doucement le muscle cervical avec des ciseaux émoussés et enlever les muscles entourant la trachée.
5. Cathétériser un tube dans la trachée PE90 pour éliminer la difficulté à respirer.
6. Retirer doucement le côté gauche du col de l'utérus et des muscles isoler la veine jugulaire des tissus environnants.
7. C annuellementla fin d'un tube PE10 dans la veine jugulaire gauche pour perfusion d'anticorps et d'anesthésiques supplémentaires.
8. Tirez doucement et inciser la peau du scrotum horizontalement. Afin de maintenir l'intégrité des tissus tout au long de l'expérience, tampon préchauffé a été perfusés sur le champ opératoire.
9. Appuyez sur le bas de l'abdomen avec une pince et tirez délicatement sur un testicule avec la pince autre.
10. Retirez les tissus environnants conjonctifs autour du testicule.
11. Incisez la crémaster verticalement et aplatir le muscle sur une lamelle de verre sur un plateau de microscope intravitale en épinglant la périphérie.
12. Laisser 10-20 min pour le muscle à se stabiliser avant la collecte des données. Artérioles musculaires Cremaster (pour la formation de thrombus) et les veinules (pour l'inflammation vasculaire) avec un diamètre de 30-45 um ont été choisis pour notre étude.
13. Pour maintenir des conditions anesthésiques, infuser 30-50 ml de la même anesthésie environ toutes les 30 minutes à travers la cannulus jugulaire.

3. Microscopie intravitale pour le TNF-α induite par l'inflammation vasculaire

1. Après le placement de la souris sur le microscope intravitale, ouvert SlideBook 5.0 du logiciel et cliquez sur "Fenêtre de mise au point" sur la barre de menu pour régler les optiques appropriées et objectives (60X).
2. Faire infuser DyLight 488-conjugué anticorps de rat anti-souris CD42c (0,1 pg / g de poids dans 100 ul solution saline) et Alexa Fluor 647-conjugués de rat anti-souris Gr-1 anticorps (0,05 pg / g de poids dans 100 ul solution saline) par une jugulaire cannulus .
3. Aller à la barre de menu, et cliquez sur "Transfert d'images" dans la barre d'outils.
4. Un nouveau menu apparaîtra, dans "Image", sélectionnez "Facteur Bin» comme 1x1 et sélectionnez "640" sur la largeur et "460" sur la hauteur.
5. Dans "Filter Set", cochez la case pour les chaînes que vous souhaitez exposer et de régler le temps d'exposition pour chacun. Par exemple, le canal ouvert: 10 ms, FITC canal: 50 ms, et Cy5 canal: 50 ms.
6. Sélectionnez «Time-Lapse Capture" pour ajuster le nombre de points dans le temps et l'intervalle. For le modèle de l'inflammation, le nombre de points dans le temps est réglé sur 1000-1500, avec un intervalle de 200 ms (temps total écoulé: 5 min).
7. Cliquez sur "Test" pour voir une seule image-avion à la durée d'exposition spécifiée pour ce canal. Réglez le temps d'exposition et / ou de lumière du microscope jusqu'à ce que l'histogramme montre une distribution d'intensité suffisante (pour le multi-canal de capture, répétez cette procédure pour chaque canal).
8. Une fois que tous les paramètres sont réglés (canaux, temps d'exposition, et ainsi de suite) dans le "Transfert d'images", sélectionnez "Démarrer" pour commencer la capture.
9. Surveiller les plaquettes de roulement et adhérence des neutrophiles et de 5 min dans la moitié supérieure d'une veinule crémaster enflammée dans le modèle de l'inflammation vasculaire. Huit à dix veinules différentes sont enregistrées dans une souris.
10. Les images ont été prises avec un grossissement total de 60x (1,0 NA objectif immersion dans l'eau) donne une taille de fenêtre de 157 um x 118 um.
11. À la fin de l'expérience, les souris ont été euthanasiées par l'intermédiaire du col dislocation.

4. Analyse des données pour le modèle de l'inflammation des veinules

1. Ouvrez SlideBook 5.0 du logiciel et cliquez sur "Dossier" dans la barre de menu pour ouvrir un fichier.
2. Cliquez sur le menu déroulant canal et sélectionnez «Ouvrir, FITC, Cy5, etc"
3. Cliquez sur "renormaliser (barres rouges et vertes)» et sélectionner le canal. Faites glisser les barres rouge et vert vers la gauche ou la droite pour environ optimiser le signal de fluorescence.
4. Cliquez sur «Appliquer» et «OK» pour mettre à jour l'image.
5. Cliquez sur "Bouton miniature" pour sélectionner l'affichage actuel comme valeur par défaut.
6. Jouer l'image capturée timelapse, et à compter de roulement des neutrophiles et adhérent au cours de la période de 5 min.
7. Pour analyser la formation de thrombus plaquettaire, allez dans "Masque" et sélectionner "Créer".
8. Nommez un masque et marque "Dans l'image actuelle".
9. Cliquez sur "icône de crayon Large" dans "Outil Rectangle de sélection" dans la vue principale.
10. Colorer une région à l'extérieur du navire dans la vue principale de mettre un masque d'arrière-plan.
11. Allez to "Mask", cliquez sur "Copier ce plan", cliquez sur "Copier masque en date jalon en cours" et sélectionnez "Tous les points dans le temps", et cliquez sur "OK".
12. Pour calculer le signal de fond, allez dans "Statistiques" et cliquez sur "Statistiques" Masque.
13. Cliquez sur "Heure actuelle 2D ou 4D Lapse Image (s)" dans la portée l'image et sélectionnez "Masque entier" dans Portée masque. En Fonctionnalités, sélectionnez "Temps écoulé (hh: mm: ms)" sous la date de capture, sélectionnez "Zone (pixels)" sous la morphométrie, sélectionnez «Intensité maximale" sous Intensité, puis cliquez sur "Exporter" (Cette méthode statistique permet de calculer l'intensité de l'autofluorescence (bruit de fond)).
14. Ouvrez le fichier texte dans Microsoft Office Excel et calculer la valeur moyenne du signal de fond tout au long de la période d'enregistrement. C'est l'intensité de fluorescence de fond.
15. Pour déterminer l'intensité de thrombus, cliquez sur "icône de crayon Large" à nouveau dans l'outil "Marquee" dans la vue principale.
16. Couleur intérieur de la cuve dans la vue principale pour régler signal de plaquettes.
17. Allez sur "Cache", cliquez sur "Copier ce plan", cliquez sur "Copier masque en date jalon actuel", sélectionnez "Tous les points dans le temps", et cliquez sur "OK".
18. Allez sur "Statistiques" et cliquez sur "Statistiques" Masque.
19. Cliquez sur "Heure actuelle 2D ou 4D Lapse Image (s)" dans la portée l'image et sélectionnez "Masque entier" dans Portée masque. En Fonctionnalités, sélectionnez "Temps écoulé (hh: mm: ms)" sous la date de capture, sélectionnez "Zone (pixels)" sous la morphométrie, sélectionnez «Intensité Somme" en vertu Intensité, puis cliquez sur "Exporter" (Cette méthode statistique nous permet de calculer l'intensité de fluorescence à l'intérieur de la cuve).
20. Ouvrez le fichier texte dans Microsoft Office Excel. Signal de fluorescence de plaquettes est calculé en soustrayant la valeur moyenne de l'intensité d'arrière-plan x proximité (pixel) de l'intensité de la somme à l'intérieur de la cuve. C'est l'intensité de fluorescence du thrombus plaquettaire.
21. Répétez cette veinules dans 30 différents en 3-5 souris différentes. Puis, calculer la valeur médiane de l'intensité de fluorescence des plaquettes.
22. Àanalyser le roulement et l'adhérence des neutrophiles, l'afflux de roulement des neutrophiles a été déterminée pendant 5 min dans chaque veinule et présenté comme le nombre de cellules par minute. Le nombre de neutrophiles adhérents qui ont été stationnaire pendant> 30 secondes et lentement analysé (<10 um 30 sec), mais n'a pas rouler, ont été comptés et présenté comme le nombre de cellules par 5 min.

5. Microscopie intravitale de thrombose induite par laser artériolaire

1.5 Calibration de l'ablation laser

1. Placez une diapositive en miroir sur la platine du microscope, appliquer une petite goutte d'eau distillée dans le haut de la diapositive, et d'ajuster l'intensité et la mise au point avec l'oculaire.
2. Ouvrez "Fenêtre de mise au point" et sélectionnez le "PAF" dans l'onglet SlideBook 5.0 du logiciel.
3. Réglez la puissance du laser à 40-50, et réglez les deux répétitions "double clic" et "taille Double-cliquez" à 8. Marquez sur le "Guide" boîte pour faire apparaître un ensemble de réticules.
4. Sélectionnez le "Arrow" icône dans la barre des tâches on le haut de l'écran.
5. Dans le cadre du «Alignement FRAP", cliquez sur "Fire prochaine". Une petite tache devrait apparaître dans le coin inférieur gauche de l'écran. Une fois la tache apparaît, double-cliquez sur le centre de celui-ci. Une fois cliqué, une autre tache devrait apparaître au-dessus et à droite de la première place; double-cliquez dessus. Répétez cette opération pour 16 points (16 ^ème place apparaîtra dans le coin inférieur droit.) Cliquez sur "Enregistrer" lorsque vous avez terminé de mettre à jour les paramètres d'étalonnage.
6. Pour tester la précision de l'étalonnage, cliquez sur le "Centre" bouton-une petite tache devrait apparaître au centre de l'écran. Sinon, répétez l'étalonnage jusqu'à ce que la précision désirée.

5-2 induite par laser formation de thrombus artériolaire

1. Placez une souris anesthésiée (voir la procédure de 2-2 à 2-12) sur la platine du microscope.
2. Dans le cadre du "Capture", sélectionnez un protocole ou d'en créer un nouveau. Les paramètres sont les suivants: CY5 (70 msec exposition), Open (10 mseexposition c), et FITC (50 msec exposition). L'image est capturée pendant 20 min (environ 2.400 points dans le temps avec un intervalle de temps de 500 ms).
3. Faire infuser DyLight 488-conjugués anti-souris CD42c et Alexa Fluor 647-conjugués anti-souris GR-1 anticorps tel que décrit ci-dessus.
4. Optimiser les paramètres du microscope, y compris l'intensité de fluorescence et de l'image en champ clair comme décrit dans 3-3 à 3-7.
5. Cliquez sur le bouton "Test" pour garantir l'intensité convenable fond clair ou un signal d'anticorps, le placement des artérioles et de concentration.
6. Cliquez sur "Démarrer" pour lancer le processus de capture d'image.
7. Avant d'allumer l'ablation laser, assurez-vous que l'icône de pointeur de la souris a été sélectionné et que la paroi de la cuve est net.
8. Pour déclencher le laser, double-cliquez sur un point 2-3 um interne de la paroi de la cuve. Blessures des cellules endothéliales artériolaires provoque un changement de forme visuelle qui devrait être évident dans l'image en fond clair, suivie par l'accumulation des plaquettes. Moniteur thrombusformation pendant 5 min après une blessure au laser.
9. Cinq minutes après la blessure laser (la taille du thrombus devrait maintenant être stable) pause et annuler la capture. Par la suite, démarrer une capture avec 2400 points dans le temps avec un intervalle de 500 ms pour enregistrer plaquettes adhérentes et les neutrophiles roulants / adhérent pendant 20 min. Trois à cinq artérioles sont enregistrés dans une souris.
10. À la fin de l'expérience, les souris ont été euthanasiées par dislocation cervicale.

6. Analyse des données pour le modèle de thrombose artériolaire

1. Passez en revue les étapes 4.1 à 4.5.
2. Pour obtenir l'intensité de fluorescence de fond au cours de la formation de thrombus plaquettaire, rendez-vous sur les étapes 4.7 à 4.14.
3. Allez sur "Cache", cliquez sur "Segment", sélectionnez FITC dans le canal, et insérer la valeur moyenne du signal de fond sur le bas. Cliquez sur «Appliquer» et «OK».
4. Afin d'analyser l'intensité de fluorescence de thrombus plaquettaires (DyLight 488-anticorps anti-CD42c anticorps), aller sur des marches 4,18 par 4,19. Pour calculer le signal anticorps, «Intensité Somme" est soustraite par le signal de fond ("Intensité maximale" x "Zone (pixels)"). C'est l'intensité de fluorescence du thrombus plaquettaire.
5. Afin de quantifier les neutrophiles roulement et adhérente, jouer le timelapse et de compter le nombre de cellules qui visiblement roulent sur ​​les thrombus plaquettaire plus de 20 min. Laminage est définie comme une diminution de la vitesse de neutrophiles en interaction avec le thrombus plaquettaire pendant au moins 2 secondes. Neutrophiles adhérents sont définis comme les neutrophiles qui restent attachés aux thrombus plaquettaire pendant au moins 2 min. Le nombre de neutrophiles roulement et adhérente a été présenté comme le nombre de cellules par 20 min. La vitesse de roulement a été calculé à l'aide d'un système de suivi de particules.

Résultats

En utilisant une analyse détaillée microscopie intravitale, hétérotypiques neutrophiles interactions plaquettes sur l'endothélium activé ont été visualisées par perfusion d'anticorps à marquage fluorescent contre une plaquette (CD42c) ou des neutrophiles marqueur (Gr-1) dans des souris vivantes.

Dans un modèle de TNF-α induite par l'inflammation des veinules, les neutrophiles ont été les plus roulement stable adhéré à l'endothélium probablement par interacti...

Discussion

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour la microscopie en temps réel intravitale fluorescence pour visualiser hétérotypiques plaquettes neutrophiles interactions sur l'endothélium activé lors de l'inflammation vasculaire et la thrombose. Auparavant, similaires fluorescence approches microscopiques ont été signalés à étudier le mécanisme moléculaire de la formation de thrombus et de l'inflammation vasculaire. ^8,12 Depuis le hétérotypique interaction cellule-cellule pourrait ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5
KCl	Sigma-Aldrich	7447-40-7
CaCl2 2H2O	Sigma-Aldrich	10035-04-8
MgCl2 6H2O	Fisher Scientific	7791-18-6
NaHCO3	Fisher Scientific	144-55-8
0.9% NaCl Saline	Hospira	0409-4888-10
Ketamine	Hospira	0409-2051-05
Xylazine	Lloyd
Intramedic Tubing (PE 90)	BD Diagnostics	427421
Intramedic Tubing (PE 10)	BD Diagnostics	427401
Murine TNF-α	R&D Systems	410-MT
Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody	Emfret Analytics	X488
Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody	BioLegend	108418
NESLAB EX water bath/circulator	Thermo-Scientific
Olympus BX61W microscope	Olympus
TH4-100 Power	Olympus
Lambda DG-4	Sutter
MPC-200 multi-manipulator	Sutter
R–-200 stage controller	Sutter
C9300 high-speed camera	Hamamatsu
Intensifier	Video Scope International
Ablation Laser	Photonic Instruments, Inc.
SlideBook 5.0	Intelligent Imaging Innovations