JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы сообщаем экспериментальная методика прижизненной флуоресцентной микроскопии для визуализации гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами взаимодействия на активированном эндотелии во сосудистыми воспаление и образование тромба в живых мышей. Это микроскопические технология будет ценным для изучения молекулярных механизмов сосудистых заболеваний и для проверки фармакологических агентов по патофизиологических условиях.

Аннотация

Взаимодействие активированных тромбоцитов и лейкоцитов (в основном нейтрофилы) на активированном эндотелии посредником тромбозов и сосудистых воспаления. 1,2 Во время образования тромба в месте травмы артериол, тромбоциты приверженцем активированного эндотелия и субэндотелиального матричных протеинов поддерживает нейтрофилов качению и сцепление 3. Наоборот, под венулярного воспалительных заболеваний, нейтрофилы приверженцем активированного эндотелия может поддерживать адгезию и накопление циркулирующих тромбоцитов. Гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами агрегации требует последовательных процессов на специфический рецептор-счетчик рецепторных взаимодействий между клетками. 4 Известно, что активированные эндотелиальные клетки выделяют молекулы адгезии, таких как фактора Виллебранда, инициируя тем самым адгезии тромбоцитов и накопления в условиях высокого сдвига условиях 5. Кроме того, активированных эндотелиальных клеток нейтрофилов поддерживает качению и сцепление, выразив селектиныD молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-1), соответственно, в условиях низкого сдвига. 4 тромбоцитов Р-селектина взаимодействует с нейтрофилов через P-селектина гликопротеин лиганд-1 (PSGL-1), тем самым вызывая активацию нейтрофилов β2 интегринов и фирмы адгезии между двумя типами клеток. Несмотря на успехи в экспериментах в пробирке, в которой гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами взаимодействия определяются в цельной крови или изолированных клеток, 6,7 этих исследований не может манипулировать условиях окислительного стресса во сосудистыми заболеваниями. В этом докладе, с использованием флуоресцентно-меченые, специфические антитела против мыши тромбоцитов и нейтрофилов маркером, мы описываем подробные прижизненных микроскопических протокол для мониторинга гетеротипические взаимодействия тромбоцитов и нейтрофилов на активированном эндотелии во время TNF-α-индуцированного воспаления или после лазерно-индуцированной травмы в кремастер мышц микрососудов живых мышей.

протокол

1. Подготовка прижизненные микроскоп (рис. 1А)

  1. Подготовка superfusion буфера (125 мМ NaCl, 4,5 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2 и 17 мМ NaHCO 3, рН 7,4).
  2. Включите водяной бане кровообращения для поддержания температуры буфера и термо-одеяла контролируемых при 37 ° C. Проветрить буфера с азотом (5% CO 2 сбалансирована с азотом).
  3. Включите микроскопа (Sutter Lambda DG-4 высокая скорость волны чейнджер, рабочей станции, Olympus BX61W микроскоп, MPC-200 мульти-манипулятор, ROE-200 этапом контроллер, камера высокой скорости и усилителем).
  4. Для сосудистого воспаления модели, используют 100% дихроичным зеркалом. Чтобы вызвать образование тромбов лазерной травмы, заменить 100% зеркало с 50/50% зеркал и включения абляции лазерной системы MicroPoint.

2. Подготовка мышц Кремастер для прижизненные микроскопии (рис. 1б)

  1. Anesthetizeсамца мыши (6-8 недель, C57BL / 6), IP-инъекции кетамина (125 мг / кг массы тела (BW)) и ксилазина (12,5 мг / кг массы тела). Университет штата Иллинойс Институциональные уходу и использованию животных комитета одобрили все ухода за животными и экспериментальных процедур. Для сосудистого воспаления модель, ввести мышиного TNF-α (0,5 мкг в 250 мкл физиологического раствора) intrascrotally в мышь 3 часа до визуализации (2-2.5 часа до операции).
  2. Наведите на термо-одеяла контролируемых при 37 ° C на прижизненный лоток микроскопом.
  3. Потяните вверх кожу на поверхности шеи с помощью пинцета и надрезать горизонтально средней линии шеи до 1 см с ножницами.
  4. Аккуратно откройте шейных мышц тупыми ножницами и снять окружающие мышцы трахеи.
  5. Иглу PE90 трубку в трахею, чтобы ликвидировать затрудненное дыхание.
  6. Аккуратно снимите с левой стороны шейки мышц и изолировать яремной вены от окружающих тканей.
  7. C ежегодноPE10 конце трубки в левую яремную вену для введения антител и дополнительных анестетиков.
  8. Аккуратно вытащить и надрезать кожу мошонки по горизонтали. Для поддержания целостности тканей на протяжении всего эксперимента, нагретого буфер superfused на операционном поле.
  9. Нажмите на нижнюю часть живота с одной forcep и осторожно вытащите яичко с другими forcep.
  10. Удалить окружающей соединительной ткани вокруг яичка.
  11. Надрезать мышцы кремастер вертикально и выровнять мышцы за бокалом покровное на прижизненный лоток микроскоп, закрепив на периферии.
  12. Разрешить 10-20 минут для мышц для стабилизации до сбора данных. Кремастер мышцы артериол (для образования тромба) и венул (для сосудистого воспаления) с диаметром 30-45 мкм были выбраны для нашего исследования.
  13. Для поддержания анестетика условиях, влить 30-50 мл анестетика же примерно каждые 30 мин через яремную cannulus.
<р = класса "jove_title"> 3. Прижизненные микроскопии для TNF-α-индуцированных сосудистого воспаления

  1. После размещения мыши на прижизненной микроскопии, открытые SlideBook 5,0 программное обеспечение и нажмите на кнопку "Focus Window" в строке меню, чтобы установить соответствующую оптику и объективные (60X).
  2. Настаивать DyLight 488-сопряженных антимышиным CD42c (0,1 мкг / г BW в 100 мкл физиологического раствора) и Alexa Fluor 647-сопряженных антимышиным Gr-1 антител (0,05 мкг / г BW в 100 мкл физиологического раствора) через яремную cannulus .
  3. Перейти к меню, и нажмите на кнопку "Image Capture" на панели инструментов.
  4. Новое меню появится, в "Image" выберите "Бен-фактор», как 1x1 и выберите пункт "640" по ширине и "460" на высоте.
  5. В «Набор фильтров», установите флажок для каналов, которые вы хотели бы выявить и установить время экспозиции для каждого. Например, открытый канал: 10 мс, FITC канала: 50 мс, а Cy5 канала: 50 мс.
  6. Выберите "Time-Lapse Capture", чтобы регулировать количество временных точек и интервал. FoГ воспаление модель, количество временных точек установлен в 1000-1500 с интервалом в 200 мс (всего прошедшего времени: 5 мин.)
  7. Нажмите кнопку "Проверить", чтобы увидеть одну плоскость изображения в указанное время экспозиции для этого канала. Отрегулируйте время экспозиции и / или световой микроскоп, пока гистограмма показывает адекватное распределение интенсивности (для многоканального захвата, повторить этот процесс для каждого канала).
  8. После того как все параметры заданы (каналов, времени экспозиции и т. д.) в "Image Capture", выберите "Пуск", чтобы начать захват.
  9. Мониторинг прокатки и приверженцем тромбоцитов и нейтрофилов в течение 5 мин в верхней половине воспаление венулы кремастер в сосудистом модели воспаления. От восьми до десяти различных венул записываются в одну мышь.
  10. Изображения были получены с использованием общее увеличение 60X (1,0 НС погружения в воду цель) дает размер окна из 157 мкм х 118 мкм.
  11. По завершении эксперимента у мышей умерщвляли через шейки dislocatioн.

4. Анализ данных для венулярного модели Воспаление

  1. Откройте SlideBook 5,0 программное обеспечение и нажмите кнопку "Папка" в строке меню, чтобы открыть файл.
  2. Нажмите на выпадающее меню каналов и выберите "Открыть, FITC, Cy5, и т.д."
  3. Нажмите кнопку "перенормируют (красные и зеленые полоски)" и выберите канал. Перетащите красные и зеленые полосы на левую или правую примерно оптимизации сигнала флуоресценции.
  4. Нажмите кнопку "Применить" и "ОК", чтобы обновить изображение.
  5. Нажмите кнопку "Миниатюра кнопки", чтобы выбрать текущий дисплей по умолчанию.
  6. Играть захватили интервальной съемки изображения, и посчитайте прокатки и приверженцем нейтрофилов в течение 5 мин период.
  7. Для анализа тромбоцитарного тромба, перейдите в раздел "Маска" и выберите "Создать".
  8. Имя маски и пометкой "В текущем изображении".
  9. Нажмите кнопку "Большой значок карандаша" в "Marquee Tool" в главном окне.
  10. Раскрась области вне судна на главном экране, чтобы установить фон маски.
  11. Перейти то "Маска", нажмите кнопку "Скопировать эту плоскость", нажмите кнопку "Копировать маски в текущем момента времени" и выберите "Все временные точки" и нажмите кнопку "OK".
  12. Для расчета фонового сигнала, перейдите в раздел "Статистика" и нажмите кнопку "Маска Статистика".
  13. Нажмите кнопку «Текущий 2D длительной или 4D изображений (ы)" в изображение Scope, и выберите пункт "Весь маска» в Mask Scope. В особенности, выберите "Прошедшее время (чч: мм: мс)" под дату съемки, выберите "Площадь (в пикселях)" под Морфометрия, выберите "максимальной интенсивностью" под Интенсивность и нажмите кнопку "Экспорт" (Эта статистика метод позволяет вычислить автоматически интенсивности флуоресценции (фоновый сигнал)).
  14. Откройте текстовый файл в MS Office Excel и вычислить среднее значение фонового сигнала течение всего периода записи. Это интенсивность фоновой флуоресценции.
  15. Для определения интенсивности тромб, нажмите кнопку "Большой значок карандаша" снова в "Marquee Tool" в главном окне.
  16. Цвет внутри сосуда в главном окне установить тромбоцитов сигнала.
  17. К "Маска", нажмите кнопку "Скопировать эту плоскость", нажмите кнопку "Копировать маски в текущем момента времени", выберите "Все временные точки" и нажмите кнопку "OK".
  18. К "Статистика" и нажмите кнопку "Маска Статистика".
  19. Нажмите кнопку «Текущий 2D длительной или 4D изображений (ы)" в изображение Scope, и выберите пункт "Весь маска» в Mask Scope. В особенности, выберите "Прошедшее время (чч: мм: мс)" под дату съемки, выберите "Площадь (в пикселях)" под Морфометрия, выберите "Сумма Intensity" под Интенсивность и нажмите кнопку "Экспорт" (Эта статистика метод позволяет рассчитать интенсивность флуоресценции внутри сосуда).
  20. Откройте текстовый файл в MS Office Excel. Сигнал флуоресценции тромбоцитов рассчитывается путем вычитания среднего значения фона Площадь интенсивности X (пикселов) от суммы интенсивности внутри судна. Это интенсивность флуоресценции тромбоцитарного тромба.
  21. Повторите это в 30 различных венул в 3-5 различных мышей. Затем вычислить среднее значение интенсивности флуоресценции тромбоцитов.
  22. Канализ нейтрофилов качению и сцепления, The Rolling приток нейтрофилов определяли в течение 5 минут в каждом венулы и представлены в виде числа клеток в минуту. Количество нейтрофилов приверженцем, которые были неподвижными в течение> 30 секунд и медленно пополз (<10 мкм в течение 30 сек), но не перевернуться, были подсчитаны и представлены в виде числа клеток за 5 мин.

5. Прижизненные микроскопии для Лазерно-индуцированные артериол Тромбоз

5-1 Калибровка лазерной абляции

  1. Поместите слайд зеркальной на столике микроскопа, нанесите небольшое капли дистиллированной воды до верхней части слайда и регулировать интенсивность и сфокусироваться с помощью окуляра.
  2. Откройте "Фокус Window" и выберите "FRAP" на вкладке в программное обеспечение SlideBook 5,0.
  3. Установите мощность лазера на 40-50, и установить как "Double повторений мыши" и "Двойной размер мыши" до 8. Отметить на "Руководство" окно, чтобы вызвать множество нитей.
  4. Выберите "Стрелка" значок на панели задач оп. в верхней части экрана.
  5. Под "FRAP Alignment" на вкладке, нажмите кнопку "Fire следующего". Небольшое пятно должно появиться около левом нижнем углу на мониторе. Как только пятно появляется, дважды щелкните на его центре. После нажатия другом месте должен появиться выше и правее первого места, дважды щелкните по нему. Повторите эту процедуру для 16 очков (16-е место появится в правом нижнем углу.) Нажмите кнопку «Сохранить» при полном обновить параметры калибровки.
  6. Чтобы проверить точность калибровки, нажмите на кнопку "Центр" Кнопка небольшое пятно должно появиться в центре экрана. Если нет, повторите калибровку до желаемой точности достигается.

5-2 Лазерно-индуцированные артериол тромба

  1. Место под наркозом мыши (см. процедуру 2-2 в 2-12) на столик микроскопа.
  2. Под "Capture" окне выберите протокол или создать новый. Параметры таковы: Cy5 (70 мс экспозиции), Open (10 MSEС экспозицией) и FITC (50 мс экспозиции). Изображение взято в плен более 20 мин (около 2400 временных точках с интервалом времени в 500 мс).
  3. Настаивать DyLight 488-сопряженных анти-мышь CD42c и Alexa Fluor 647-сопряженных анти-мышь Gr-1 антител, как описано выше.
  4. Оптимизация микроскопом параметров, включая интенсивность флуоресценции и яркое изображение поля, как описано в 3-3 до 3-7.
  5. Нажмите на кнопку "Тест" для обеспечения надлежащего интенсивность светлого или антитела сигнал, артериол размещения и фокус.
  6. Нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать процесс захвата изображения.
  7. Перед стрельбой лазерной абляции, убедитесь, что значок указателя мыши была выбрана и что стенки сосуда в четкий фокус.
  8. Для стрельбы лазера, дважды щелкните на месте 2-3 мкм внутренне от стенки сосуда. Повреждение эндотелиальных клеток артериол вызывает визуальное изменение формы, которая должна быть очевидной в образе светлого, а затем тромбоцитов накопление. Монитор тромбаформирование в течение 5 мин после лазерной травмы.
  9. Через пять минут после травмы лазером (размер тромба теперь должен быть стабильным) паузы и отмены захвата. Впоследствии начать захват с 2400 временных точках с интервалом 500 мс для записи приверженцем тромбоцитов и прокатки / приверженцем нейтрофилов в течение 20 мин. От трех до пяти артериол записываются в одну мышь.
  10. По завершении эксперимента у мышей умерщвляли посредством смещения шейных позвонков.

6. Анализ данных для модели тромбоза артериол

  1. Перейти по ступеням 4,1 через 4,5.
  2. Чтобы получить интенсивность фоновой флуоресценции во время тромбоцитарного тромба, перейдите по ступеням 4,7 через 4,14.
  3. К "Маска", нажмите кнопку "Сегмент", выберите FITC в канале, и вставить среднее значение фонового сигнала на низком уровне. Нажмите кнопку "Применить" и "ОК".
  4. Для анализа интенсивности флуоресценции тромбоцитарного тромба (DyLight 488-сопряженных анти-CD42c антитела), идти по ступеням 4,18 через 4,19. Для расчета антител сигнал, "Сумма Intensity" вычитается от фонового сигнала («максимальная интенсивность" х "Площадь (в пикселях)"). Это интенсивность флуоресценции тромбоцитарного тромба.
  5. Для количественной оценки прокатки и приверженцем нейтрофилов, играют интервальной съемки и подсчитать количество ячеек, которые заметно пролонгировать тромбоцитарного тромба в течение 20 мин. Роллинг определяется как снижение нейтрофилов скорость при взаимодействии с тромбоцитарного тромба, по крайней мере, 2 сек. Приверженец нейтрофилов определяется как любая нейтрофилов, которые остаются прикреплены к тромбоцитарного тромба в течение 2 мин. Число прокатки и приверженцем нейтрофилов было представлено как число клеток на 20 мин. Роллинг скорость была рассчитана с использованием системы частиц слежения.

Результаты

Используя подробные прижизненного анализа микроскопии, гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами взаимодействия на активированном эндотелии были визуализированы с помощью вливания флуоресцентно-меченых антител против тромбоцитов (CD42c) или нейтрофилов маркер (Gr-1) в живых мышей.

Обсуждение

Здесь мы опишем подробный протокол реального времени флуоресценции прижизненной микроскопии для визуализации гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами взаимодействия на активированном эндотелии во сосудистыми воспаление и тромбоз. Ранее подобные флуоресценции микроскопических ...

Раскрытие информации

Авторы заявляют нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была выполнена при частичной поддержке грантов от Национального института здоровья (P30 HL101302 и RO1 HL109439 к JC) и Американской Ассоциации Сердца (SDG 5270005 по х). А. Barazia была поддержана NIH T32HL007829 подготовки гранта.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
NaClFisher Scientific7647-14-5
KClSigma-Aldrich7447-40-7
CaCl2 2H2OSigma-Aldrich10035-04-8
MgCl2 6H2OFisher Scientific7791-18-6
NaHCO3Fisher Scientific144-55-8
0.9% NaCl SalineHospira0409-4888-10
KetamineHospira0409-2051-05
XylazineLloyd
Intramedic Tubing (PE 90)BD Diagnostics427421
Intramedic Tubing (PE 10)BD Diagnostics427401
Murine TNF-αR&D Systems410-MT
Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody Emfret AnalyticsX488
Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) AntibodyBioLegend108418
NESLAB EX water bath/circulatorThermo-Scientific
Olympus BX61W microscopeOlympus
TH4-100 PowerOlympus
Lambda DG-4Sutter
MPC-200 multi-manipulatorSutter
R–-200 stage controllerSutter
C9300 high-speed cameraHamamatsu
IntensifierVideo Scope International
Ablation LaserPhotonic Instruments, Inc.
SlideBook 5.0Intelligent Imaging Innovations

Ссылки

  1. Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
  2. Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
  3. Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction. Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).
  4. Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation. Blood Rev. 21, 99-111 (2007).
  5. Chen, J., Lopez, J. A. Interactions of platelets with subendothelium and endothelium. Microcirculation. 12, 235-246 (2005).
  6. Konstantopoulos, K., et al. Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin. Circulation. 98, 873-882 (1998).
  7. Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin. Haematologica. 90, 833-839 (2005).
  8. Hidalgo, A., et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury. Nat. Med. 15, 384-391 (2009).
  9. Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice. J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).
  10. Cho, J., et al. Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins. Blood. 120, 647-655 (2012).
  11. Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development. Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).
  12. Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).
  13. Barthel, S. R., et al. Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).
  14. Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule. The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).
  15. Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
  16. Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

74

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены