In vivo méthode d'imagerie à distinguer inflammation aiguë et chronique

Résumé

Nous décrivons une méthode d'imagerie non-invasive permettant de distinguer les stades inflammatoires. Administration systémique de luminol révèle des zones d'inflammation aiguë dépendent activité MPO dans les neutrophiles. En revanche, l'injection de lucigénine permet de visualiser l'inflammation chronique dépend de l'activité Phox dans les macrophages.

Résumé

L'inflammation est un aspect fondamental de nombreuses maladies humaines. Dans ce reportage vidéo, nous démontrons techniques d'imagerie non invasives bioluminescence qui distinguent inflammation aiguë et chronique chez des modèles de souris. À une lésion tissulaire ou invasion pathogène, les neutrophiles sont la première ligne de défense, en jouant un rôle majeur dans la médiation de la réponse inflammatoire aiguë. Comme la réaction inflammatoire progresse, monocytes circulants migrent progressivement dans le site de la lésion et se différencient en macrophages matures, qui interviennent dans l'inflammation chronique et de promouvoir la réparation des tissus par l'enlèvement des débris de tissus et la production de cytokines anti-inflammatoires. L'injection intrapéritonéale de luminol (,4-phtalazinedione, sel de sodium 5-amino-2 ,3-dihydro-1) permet la détection d'une inflammation aiguë largement médiatisée par infiltrant les tissus neutrophiles. Luminol réagit spécifiquement avec le superoxyde généré dans les phagosomes de neutrophiles puisque les résultats de bioluminescence d'une myéloperoxydase (MPO) réaction médiée. Lucigénine (bis-N-méthylacridinium nitrate) réagit également avec le superoxyde afin de générer la bioluminescence. Cependant, lucigénine bioluminescence est indépendant du MPO et il repose uniquement sur phagocyte NADPH oxydase (Phox) dans les macrophages au cours de l'inflammation chronique. Ensemble, luminol et lucigénine permettent la visualisation non invasive et l'évaluation longitudinale des différentes populations phagocytaires dans les phases inflammatoires aigus et chroniques. Compte tenu du rôle important de l'inflammation dans une variété de maladies humaines, nous pensons que cette méthode d'imagerie non-invasive peut aider à enquêter sur les rôles différentiels de neutrophiles et de macrophages dans une variété de conditions pathologiques.

Introduction

L'inflammation est une réponse biologique très réglementé impliqué dans une variété de maladies humaines, y compris l'infection microbienne ^1, la cicatrisation ^2, le diabète ^{3, 4} cancer, les maladies cardiovasculaires ^{5, 6} neurodégénératives, maladies auto-immunes et ^7. inflammation des tissus nécessite une bonne coordination des différentes cellules immunitaires afin d'atteindre dégagement pathogène, la réparation des tissus et de la résolution de la maladie. Neutrophiles et les macrophages sont des médiateurs immunitaires clés de l'inflammation des tissus. Dans la phase aiguë de l'inflammation, les neutrophiles sont les premiers intervenants à divers stimuli nocifs et des lésions tissulaires ^8. Les neutrophiles s'extravaser rapidement de la circulation au site de la lésion, où les cellules inactivent microbes envahisseurs en libérant des granulés anti-microbiennes et la phagocytose. Au cours de la phagocytose, les neutrophiles engloutir microbes envahisseurs en phagosomes, dans lequel les cellules produisent des niveaux élevés de superoxydeide (O ₂ · ^-). Superoxyde phagosome est la principale source de beaucoup d'espèces réactives de l'oxygène en aval (ROS). Par exemple, on peut dismutées superoxyde en peroxyde d'hydrogène (H ₂ O ₂₎ par dismutation spontanée ou par la superoxyde dismutase (SOD) ^{9, 10.} Dans les neutrophiles, la myéloperoxydase (MPO) convertit en outre du peroxyde d'hydrogène à de l'acide hypochloreux antimicrobien (HOCl) ^11. Comme les réactions inflammatoires se poursuivent, monocytes circulants migrent progressivement vers le site de la lésion et se différencient en macrophages matures ^2, dont la fonction phagocytaire aider à éliminer les agents pathogènes inactivés et les débris cellulaires. En outre, comme un régulateur clé dans la dernière phase de l'inflammation, les macrophages favorise la réparation des tissus en produisant des cytokines anti-inflammatoires ¹² et en générant extracellulaire ROS à un niveau inférieur ^9. Le ROS généré à ce stade ultérieur réguler le remodelage des tissus, formation de nouveaux vaisseaux, et reepithelialisation ^13.

Phagocyte NADPH oxydase (Phox) est la principale source de production de superoxyde dans les deux neutrophiles et les macrophages ^9. Phox est un complexe multi-unité dont l'assemblage est strictement réglementé ^9. L'holoenzyme contient plusieurs sous-unités régulatrices cytosolique (p67 ^phox, p47 ^phox, p40 ^phox, et RAC) et une membrane-bound hétérodimère cytochrome b ₅₅₈ (composé de sous-unité CYBA et CYBB). Cytochrome b ₅₅₈ est le noyau réaction dans laquelle la sous-unité CYBB (également connu comme p91 ^phox et NOX2) effectue la première réaction en chaîne oxydo-réduction ^9. Fait intéressant, ses sites d'assemblage sont différents entre les neutrophiles et les macrophages. Dans les neutrophiles au repos, le cytochrome b ₅₅₈ est surtout présente dans la membrane des granules de stockage intracellulaires ^14. Au cours de la phagocytose, les neutrophiles assembler les holoenzymes à phagosomes ^9, où des niveaux élevés d'activité MPO sont également présents. Le neutrophiles Phox consomme rapidement l'oxygène et exerce son pouvoir microbicide par la production de ROS, un phénomène appelé l'explosion respiratoire ^11. En revanche, les macrophages ont un faible niveau d'expression MPO et le cytochrome b ₅₅₈ se trouve principalement dans la membrane plasmique ^{15, 16.} Ainsi neutrophiles produisent des niveaux élevés de superoxyde de l'activité anti-microbienne, tandis que les macrophages génèrent moins de superoxyde des fonctions de réglementation ^15.

Depuis l'inflammation est un complexe dans le processus vivo, des méthodes d'imagerie non invasives spécifiques pour les différentes phases de l'inflammation permettraient une évaluation quantitative et longitudinale de modèles de maladies. En utilisant des études mécanistes, nous avons déjà démontré que l'utilisation de deux agents chimiluminescents, le luminol (5-amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-phtalazinedione) et lucigénine (bis-N-méthylacridinium nitrate), Pour l'imagerie non-invasive de phase aiguë et chronique (retard) de l'inflammation, respectivement ^17. Luminol permet de visualiser l'activité MPO neutrophiles dans la phase aiguë de l'inflammation ^18-20, alors que la bioluminescence de lucigénine peut être utilisé pour évaluer l'activité des macrophages, en association avec la phase tardive ou une inflammation chronique ^17. Dans ce manuscrit, nous avons utilisé deux modèles d'inflammation expérimentales (sc PMA et sc LPS) pour démontrer ces techniques d'imagerie.

Protocole

Note: Toutes les études chez l'animal ont été réalisées selon des protocoles approuvés institutionnels et des lignes directrices de soins aux animaux.

1. Réactifs et solutions

1. Solution PMA pour sc inoculation: Préparer une solution stock de phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) à 5 mg / ml dans le DMSO. Conservez la solution stock à -20 ° C. Avant inoculation, décongeler la solution de stock et diluer à 1 mg / ml de PMA dans PBS.
2. LPS solution pour inoculation SC: Dissoudre lipopolysaccharide (LPS de Salmonella enterica sérotype Enteritidis) dans du PBS stérile à 1 mg / ml avant sc inoculation.
3. Solution de luminol pour l'imagerie de phase aiguë: Dissoudre luminol (,4-phtalazinedione, sel de sodium de 5-amino-2 ,3-dihydro-1) dans une solution saline normale stérile (NaCl 0,9%) à 10 mg / ml. La solution peut être conservé à -20 ° C avant utilisation.
4. solution de lucigénine pour l'imagerie de phase chronique: Dissoudre lucigénine (bis-N-méthylacridinium nitrate) dans une solution saline normale stérileà raison de 2,5 mg / ml. La solution peut être conservé à -20 ° C avant utilisation.

2. Sous-cutanée PMA Inflammation du modèle

1. Anesthésier la souris nude NCR dans une chambre d'induction avec 1-2% d'isoflurane. Confirmer l'anesthésie générale par la perte de circulation et une fréquence respiratoire constante. Transférer un animal à un cône de nez alimentée en gaz isoflurane à l'emploi et maintenir l'animal sous anesthésie.
2. Utilisez un chiffon d'alcool isopropylique pour nettoyer et désinfecter le site d'injection sur le flanc gauche.
3. En utilisant une technique stérile, injecter 50 ul de la solution d'inoculation PMA (contenant 50 mg de PMA) dans l'espace sous-cutané sur le flanc gauche. Éliminer le liquide en excès à partir du site d'injection à l'aide d'un tampon imbibé d'alcool isopropylique. Évitez l'utilisation de l'analgésie car il peut affecter les réactions inflammatoires.
4. Déplacez l'animal dos à la cage de logement et de surveiller étroitement sa récupération de l'anesthésie. Afin d'aider à la récupération, utilisez un coussin chauffant pour garder l'animal au chaud.

3. Sous-cutanée LPS Inflammation du modèle

1. Anesthésier souris C57BL/6J avec 1-2% d'isoflurane dans une chambre d'induction. Une fois que l'établissement anesthésie générale, transférer un animal à un cône de nez alimentée en gaz isoflurane et garder l'animal sous anesthésie.
2. Utiliser un alcool isopropylique pour nettoyer la site d'injection sur le coussinet plantaire gauche.
3. En utilisant une technique stérile, injecter 50 ul de la solution inoculation LPS (contenant 50 pg de LPS) dans le coussinet gauche. Éliminer le liquide en excès à partir du site d'injection à l'aide d'un tampon imbibé d'alcool isopropylique. Évitez l'utilisation de l'analgésie car il peut affecter les réactions inflammatoires.
4. Déplacez l'animal dos à la cage de logement et de surveiller étroitement sa récupération de l'anesthésie. Utilisez un coussin chauffant pour conserver la chaleur animale pendant la récupération.

4. l'imagerie par bioluminescence de l'inflammation

1. Anesthésier l'animal dans une chambre d'induction avec 2.1% de gaz isoflurane mélangé. Confirm anesthésie générale par la perte de circulation et une fréquence respiratoire constante.
2. Alors que l'animal est encore sous anesthésie, par voie intrapéritonéale (IP) d'injecter la solution de luminol (10 mg / ml), ou la solution de lucigénine (2,5 mg / ml) pour l'imagerie de l'inflammation aiguë ou chronique, respectivement. La dose finale est de 100 mg / kg pour le luminol et 25 mg / kg pour lucigénine. Une dose plus faible de lucigénine (10-15 mg / kg) peut être utilisé pour éviter la toxicité possible pour certaines souches de souris. Les signes de toxicité comprennent l'essoufflement et une détresse respiratoire. La souche C57BL/6J a inférieur lucigénine tolérabilité que la souche nue RCN.
3. Le transfert de l'animal dans la chambre de formation d'image d'un système d'imagerie par bioluminescence.
4. Effectuez l'imagerie par bioluminescence séquentielle à des intervalles de 1 min. Chaque étape imagerie est composé de 1 min temps d'acquisition, f / arrêt = 1, binning = 16 et 0 sec retard.
5. Dans le panneau d'acquisition d'image, pour permettre l'imagerie multi-étapes séquentielles, cliquez sur la séquence mise button. Fournir des mesures d'imagerie suffisantes dans le profil de l'acquisition pour déterminer le débit de luminescence maximale (généralement 15 étapes d'une minute suffiront). La section d'imagerie de 15 min est suffisante pour permettre l'absorption du substrat et la circulation systémique.
6. Retirer l'animal de la chambre de l'imagerie et le ramener dans la cage du logement. Afin d'aider à la récupération, utilisez un coussin chauffant pour garder l'animal au chaud.
7. Lors de l'analyse post-acquisition, utilisez le logiciel d'imagerie pour calculer signal de bioluminescence totale pic à travers des régions normalisées d'intérêt (ROI). Les images sont présentes que dans l'éclat des photons / sec / cm ² / sr avec un seuil minimal et maximal indiqué. Les données quantitatives sont présentés comme des flux total en photons par seconde par le ROI.

Résultats

Nous avons procédé à l'imagerie par bioluminescence longitudinale pour évaluer l'inflammation aiguë et chronique dans les modèles expérimentaux d'inflammation. Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) est une protéine kinase C agoniste puissant (PKC) qui active Phox pour la production d'anion superoxyde et déclenche des réactions inflammatoires aiguës intenses ^21. Injection sous-cutanée de 50 mg de PMA chez la souris nude NCR a causé une irritation rapide de la peau et une inflammat...

Discussion

Dans ce rapport, nous démontrons une méthode de bioluminescence pour l'imagerie non-invasive de l'inflammation chez les animaux vivants. Profitant de deux substrats luminescent, le luminol et lucigénine, la méthode peut distinguer les différentes phases de l'inflammation. Bioluminescence luminol est associée à des neutrophiles dans la phase aiguë de l'inflammation, de la bioluminescence alors que la lucigénine est médiée par des macrophages dans la phase chronique. Relativement faible (MW = 17...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	P8139
Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	L2012
Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	A4685
Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	M8010
IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package	Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA