Метод В естественных изображений отличить острого и хронического воспаления

Резюме

Мы описываем неинвазивного метода визуализации для различения воспалительных стадиях. Системной доставки люминолом показывает областях острого воспаления зависит от активности МПО в нейтрофилах. В противоположность этому, инъекция люцигенином позволяет выводить хронического воспаления зависит от Phox активность макрофагов.

Аннотация

Воспаление является фундаментальным аспектом многих заболеваний человека. В этом видео отчет, мы демонстрируем неинвазивных методов визуализации биолюминесценции, которые отличают острого и хронического воспаления в мышиных моделях. С повреждением ткани или патогена вторжения, нейтрофилы являются первой линией обороны, играют важную роль в посредничестве острой воспалительной реакции. Как воспалительная реакция прогрессирует, циркулирующих моноцитов постепенно мигрируют в место повреждения и дифференцироваться в зрелые макрофаги, являющиеся посредниками хроническое воспаление и способствовать восстановлению тканей, удаляя ткани мусора и производство противовоспалительных цитокинов. Внутрибрюшинной инъекции люминол (5-амино-2 ,3-дигидро-1 ,4-фталазиндион, натриевой соли) позволяет обнаруживать острого воспаления в значительной степени опосредованы ткани проникновения нейтрофилов. Люминол специфически реагирует с супероксид генерируется в фагосомами нейтрофилов с биолюминесценции результаты миелопероксидазы (МPO) опосредованной реакции. Люцигенином (бис-N-methylacridinium нитрат) также вступает в реакцию с супероксид для того, чтобы генерировать биолюминесценции. Тем не менее, люцигенин биолюминесценции не зависит от МПО и это исключительно зависит от фагоцитарной NADPH оксидазы (Phox) в макрофагах при хроническом воспалении. Вместе люминол и люцигенином позволяет неинвазивной визуализации и продольный оценки различных популяций на фагоцитарную как острых, так и хронических воспалительных фаз. С учетом важной роли воспаления в различных заболеваний человека, мы считаем, что это неинвазивный метод визуализации может помочь исследовать дифференциальные роли нейтрофилов и макрофагов в различных патологических состояниях.

Введение

Воспаление является строго регулируется биологической реакции участвуют в различных заболеваний человека, в том числе микробной инфекции ^1, заживление ран ^2, диабет ^{3, 4} рак, сердечно-сосудистые ^{5, 6} нейродегенеративных и аутоиммунных заболеваний ^7. Воспаление тканей требует надлежащей координации различных иммунных клеток в целях достижения возбудителя оформление, восстановления тканей, и болезнь разрешение. Нейтрофилы и макрофаги являются ключевыми медиаторами иммунного воспаления тканей. В острой фазе воспаления, нейтрофилы первыми отвечают различным вредным воздействиям и повреждение тканей ^8. Нейтрофилов быстро вытекать из сосудов в ткань из обращения в месте повреждения, где клетки инактивировать вторжения микробов путем освобождения антимикробные гранул и фагоцитоза. Во фагоцитоз, нейтрофилы поглотить вторжения микробов в фагосомами, в течение которой клетки продуцируют высокие уровни СуперОксIDE (O ₂ · ^-). Phagosomal супероксид является основным источником многих вниз по течению активных форм кислорода (АФК). Например, супероксид может быть dismutated в перекись водорода (H ₂ O ₂₎ спонтанное дисмутация или супероксиддисмутаза (SOD), ^{9, 10.} В нейтрофилы, миелопероксидазы (MPO) дальнейшее преобразует перекиси водорода к антимикробным хлорноватистой кислоты (HOCl) ^11. Как воспалительные реакции продолжаются, циркулирующих моноцитов постепенно мигрируют в место повреждения и дифференцироваться в зрелые макрофаги ^2, чья фагоцитарной функции помогают удалить инактивированных патогенных микроорганизмов и клеточных обломков. Кроме того, в качестве ключевого регулятора в поздней фазе воспаления, макрофагов способствует восстановлению тканей, производя противовоспалительных цитокинов и ^12, генерируя внеклеточный ROS на более низком уровне ^9. АФК образуются в этой поздней стадии регулируют ремоделирования ткани, образование новых кровеносных и reepitheliaлизации ^13.

НАДФН-оксидазы фагоцитов (Phox) является основным источником супероксида в обоих нейтрофилов и макрофагов ^9. Phox является мульти-субъединицы комплекса, сборка жестко регулируется ^9. Холоферментом содержит несколько цитозольные регуляторных субъединиц (P67 ^{Phox, Phox} p47, p40 ^Phox и RAC) и связанный с мембраной гетеродимером цитохрома Ь ₅₅₈ (состоит из субъединицы CYBA и CYBB). Цитохром б ₅₅₈ является реакция ядро, в которой субъединицы CYBB (также известный как p91 ^Phox и NOX2) осуществляет первичный окислительно-восстановительной реакции цепи ^9. Интересно, что свои сайты сборки отличаются между нейтрофилов и макрофагов. В состоянии покоя нейтрофилы, цитохрома Ь _558, в основном, присутствующего в мембране внутриклеточных гранул хранения ^14. В процессе фагоцитоза, нейтрофилы собрать чoloenzymes в фагосомами ^9, где высокий уровень активности МПО также присутствуют. Нейтрофилов Phox быстро потребляет кислород и оказывает свое бактерицидное власти продукции АФК, явление называется респираторный взрыв ^11. Напротив, макрофаги, имеют более низкий уровень экспрессии и MPO цитохрома б ₅₅₈ встречается в основном в плазматической мембране ^{15, 16.} Таким образом нейтрофилы продуцируют высокие уровни супероксид на антимикробную активность, в то время как макрофаги вырабатывают меньше супероксид для регулирующих функций ^15.

Поскольку воспаление является сложной в процессе естественных условиях, неинвазивные методы визуализации специфичны для разных фаз воспаления позволит количественных и продольной оценки модели заболеваний. Использование механистических исследований, ранее мы показали, использование двух хемилюминесцентного вещества, люминол (5-амино-2 ,3-дигидро-1 ,4-фталазиндион) и люцигенином (бис-N-methylacridinium нитрат), Для неинвазивной визуализации острых и поздних (хронических) стадиях воспаления, соответственно ^17. Люминол позволяет визуализировать нейтрофилов активности МПО в острой фазе воспаления ^18-20, в то время как люцигенин биолюминесценции может быть использован для оценки активности макрофагов в связи с поздней стадии хронического воспаления или ^17. В этой рукописи, мы использовали два экспериментальных моделей воспаления (PMA SC и SC LPS), чтобы продемонстрировать эти методы визуализации.

протокол

Примечание: Все исследования на животных проводились в рамках утвержденных институциональных протоколов и руководств по уходу за животными.

1. Реагенты и растворы

1. PMA решение для подкожно прививки: Подготовка исходного раствора форбол-12-миристат-13-ацетатом (РМА) в дозе 5 мг / мл в ДМСО. Хранить раствор при -20 ° C. Перед посевом таять исходного раствора и разбавляют до 1 мг / мл в PBS PMA.
2. LPS решение для подкожно прививки: растворите липополисахарида (LPS из Salmonella enterica серотипа Enteritidis) в стерильном PBS при концентрации 1 мг / мл до подкожно прививки.
3. Люминол решение для острой фазы изображения: растворите люминол (5-амино-2 ,3-дигидро-1 ,4-фталазиндион, натриевая соль) в стерильном физиологическом растворе (0,9% NaCl) при концентрации 10 мг / мл. Раствор можно хранить при -20 ° C перед использованием.
4. Люцигенин решение для визуализации хронической фазе: Растворите люцигенин (бис-N-methylacridinium нитратов) в стерильном физиологическом растворепри дозе 2,5 мг / мл. Раствор можно хранить при -20 ° C перед использованием.

2. Подкожный PMA Воспаление модели

1. Обезболить NCr голым мышам в индукционной камера с 1-2% изофлурана. Подтвердите общей анестезии потеря движения и постоянная частота дыхания. Передача животного на носовой конус поставляется изофлураном перемешанные газ и держать животных под наркозом.
2. Используйте изопропиловый спирт протрите чистить и дезинфицировать место инъекции на левом фланге.
3. С помощью стерильной техники, вводят 50 мкл раствора PMA прививки (содержащей 50 мкг PMA) в подкожное пространство на левом боку. Удалить избыток жидкости из места инъекции с использованием изопропилового спирта площадку. Избегать использования обезболивание, как это может влиять на воспалительные реакции.
4. Переместить животное обратно к корпусу клетку и внимательно следить его выхода из наркоза. В целях оказания помощи в восстановлении, использовать грелку держать животное тепло.

3. Подкожный LPS Воспаление модели

1. Обезболить C57BL/6J мышей с 1-2% изофлурана в индукционной камере. После создания общей анестезии, передать животному носовой конус поставляется изофлураном газа и держать животное под наркозом.
2. Используйте изопропиловый спирт для очистки протрите место инъекции на левой лапы.
3. С помощью стерильной техники, вводят 50 мкл раствора LPS прививки (содержащей 50 мкг ЛПС) в левую лапу. Удалить избыток жидкости из места инъекции с использованием изопропилового спирта площадку. Избегать использования обезболивание, как это может влиять на воспалительные реакции.
4. Переместить животное обратно к корпусу клетку и внимательно следить его выхода из наркоза. Используйте грелку держать животное теплой во время восстановления.

4. Биолюминесценции изображений воспаления

1. Анестезию животных в индукционной камере с 1-2% изофлуран смешанного газа. Confirm общей анестезии потеря движения и постоянная частота дыхания.
2. В то время как животное все еще находится под анестезией, интраперитонеально (внутрибрюшинно) вводят люминол раствора (10 мг / мл), либо люцигенином раствор (2,5 мг / мл) в течение острое или хроническое воспаление изображений, соответственно. Конечный доза 100 мг / кг в течение люминол и 25 мг / кг в течение люцигенином. Низкие дозы люцигенином (10-15 мг / кг) может быть использован, чтобы избежать возможной токсичности некоторых линий мышей. Признаки токсичности включают одышку и дыхательной недостаточности. Штамм C57BL/6J имеет более низкую, чем переносимость люцигенин NCr обнаженной напряжения.
3. Передача животных в изображения камеры системы визуализации биолюминесценции.
4. Выполнять последовательные изображений биолюминесценции с интервалом в 1 мин. Каждый шаг визуализации состоит из 1 раз приобретении мин, F / стоп = 1, биннинге = 16 и 0 сек задержки.
5. В панели захвата изображений, с тем чтобы последовательного многоступенчатого изображений, нажмите на последовательность установки BUTton. Обеспечить достаточный шаги изображений в приобретении профилем для определения максимальным выходным люминесценции (обычно 15 одну минуту шагов будет достаточно). 15 мин изображений раздел позволяет достаточно времени для поглощения подложки и системный кровоток.
6. Удалить животное от изображения камеры и переместить его обратно в корпус клетке. В целях оказания помощи в восстановлении, использовать грелку держать животное тепло.
7. Во время после приобретения анализа, используйте пакет изображений программное обеспечение для расчета пика Всего биолюминесцентными сигнал через стандартизированные области интереса (ROI). Изображения присутствуют в виде сияния в фотон / сек / см ² / SR с минимальным и максимальным порогом указано. Количественные данные представлены в виде общего потока в фотонов в секунду на ROI.

Результаты

Мы провели продольное изображение биолюминесценции для оценки острых и хронических воспалений в экспериментальных моделях воспаления. Форбола 12-миристат-13-ацетатом (РМА) является сильнодействующим протеинкиназы С (РКС), агонист, который активирует Phox для супероксида аниона и вызывае...

Обсуждение

В этом докладе мы демонстрируем биолюминесценции метод неинвазивной визуализации воспаления в живых животных. Преимущества двух люминесцентные субстраты, люминол и люцигенином, способ может различать различные фазы воспаления. Люминол биолюминесценции связан с нейтрофилов в остро?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	P8139
Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	L2012
Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	A4685
Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	M8010
IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package	Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA