Visualisation de G3BP stress Granules dynamique dans les cellules primaires en direct

Résumé

granules de stress (SG) sont des granules d'ARN cytoplasmiques contenant des particules bloquées ribonucléoprotéiques (RNP), et important dans la réponse cellulaire à différents stress. Dynamique de SG peuvent être suivies dans les cellules vivantes en visualisant la localisation d'un composant marqué de SG dans des cellules primaires transfectées après le stress.

Résumé

SG peut être visualisé dans les cellules par immunocoloration de composants protéiques spécifiques ou polyA + ARNm. SG sont très dynamique et l'étude de leur assemblage et le destin est important de comprendre la réponse cellulaire au stress. Le déficit en facteurs clés de SG comme G3BP (RasGAP domaine SH3 de Binding Protein) conduit à des anomalies du développement chez les souris et les altérations du système nerveux central. Pour étudier la dynamique de SG dans les cellules d'un organisme, une des cellules primaires de culture de boîtes et de suivre la localisation d'un composant marqué transfectées de SG. Nous décrivons expérience time-lapse pour observer SG contenant G3BP1 en fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). Cette technique peut également être utilisée pour étudier GV contenant de G3BP dans les neurones vivants, ce qui est crucial car il a été montré récemment que ces SG sont formées à l'apparition de maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. Cette approche peut être adaptée à tout autre composant du corps cellulaire et des protéines de granules, et réaliséeavec des animaux transgéniques, ce qui permet l'étude en temps réel de la dynamique des granules, par exemple en l'absence d'un facteur spécifique de ces granules.

Introduction

granules de stress (SG) sont des foyers cytoplasmique non-membraneux formé comme une réponse protectrice cellulaire à un stress environnemental, tels que température élevée, le stress oxydatif, hypoxie, choc osmotique, irradiation UV, la privation de glucose, ou ^une infection virale. Ils peuvent être induits chimiquement par traitement avec des composés comme l'arsénite de sodium, ce qui provoque un stress oxydatif. SG s'accumulent au point mort traduction arrêté messager ribonucléoprotéique (mRNP) Complexes ^2, la séquestration des ARNm de la machinerie traductionnelle, et leur assemblage peut être déclenchée par la phosphorylation de eIF2α (facteur d'initiation eucaryote 2 α). SG sont des structures dynamiques qui échangent des composants avec les polysomes et autres granulés comme les P-organismes. Ils constituent un «centre de triage» où ARNm sont triés et traités soit pour la traduction, réamorçage, la dégradation ou l'emballage dans stables mRNP non polysomique ^3. L'ensemble de la SGS est rapide but est un processus progressif avec de nombreux petits agrégats initiaux qui confluent en granules plus grands. L'utilisation d'inhibiteurs chimiques qui perturbent ou stabilisent les microtubules montre que le réseau de microtubules est nécessaire pour la dynamique de la SG y compris les processus ensemble, coalescence et de démontage.

L'assemblage dynamique de SG est également favorisée par l'agrégation des protéines liant l'ARN spécifiques (ARN-BP) comme la norme TIA-1 (T-cellule interne antigène-1) et TIAR (protéine liée TIA-1), qui sont capables de dimériser et promouvoir polysome démontage et l'acheminement des ARNm dans SG ^4. G3BP (domaine RasGAP SH3 de la protéine de liaison) est telle un ARN-BP qui localise à SG lorsque les cellules sont stressés à l'arsénite ou une température élevée, et la surexpression de G3BP dephosphoryle peuvent induire SG ensemble ^5.

G3BP est un ARN-BP évolutivement conservées qui a été initialement caractérisée par son interaction avec une protéine d'activation de Ras-GTPase (p RasGAP120 ^6); mais cette interaction a été récemment revisitée ^7. La famille G3BP comprend deux membres chez les mammifères, G3BP1 (dénommé G3BP) et G3BP2 ^8. Les deux protéines colocalisent SGS, lorsque les cellules sont exposées à un stress ^9. G3BPs comprennent un domaine de NTF2 N-terminal a suggéré d'influer sur leur localisation et oligomérisation, suivie riche en proline (PxxP) motifs, puis des motifs C-terminaux associés à la liaison de l'ARN: la canonique ARN motif de reconnaissance (RRM) avec RNP1 et RNP2 motifs conservés , suivie d'un riche (RGG) boîte arginine-glycine. Chose intéressante, l'analyse des différentes parties de la protéine par la construction de différents domaines fusionné à la EGFP a montré que le domaine NTF2-like et le domaine de liaison à l'ARN étaient les plus efficacement recruté pour SG, ce qui suggère l'importance des propriétés de dimérisation et de liaison d'ARN dans l'ensemble de la SGS. Modèles divers ont mis en évidence différentes fonctions des protéines G3BP in vitro ^10-13.Perturbation de G3BP chez la souris ont montré l'importance de cette protéine dans la croissance et la survie de développement ^14, ainsi que d'un rôle important pour G3BP dans le système nerveux central (SNC), caractérisé par une ataxie et des défauts dans la mémoire de travail spatiale ^15. Carence G3BP conduit à altération neuronale et la plasticité calcium homéostasie, établissant un lien direct entre la formation de SG et les maladies neurodégénératives ^15. Il est donc important d'être en mesure d'étudier la dynamique de la SG dans des cellules primaires comme les neurones.

Ce protocole fournit un moyen simple d'observer l'ensemble de SG contenant G3BP1 dans les cellules primaires sous traitement de l'arsénite. Il peut être utilisé pour étudier l'assemblage SG dans des conditions différentes, par exemple différentes sortes de contraintes. Il peut également être adapté à d'autres granules ou d'autres constituants de la SGS. En effet, ce protocole met l'accent sur ​​G3BP1, mais il ya d'autres marqueurs de granules de stress comme la norme TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) ^2,FMRP (Fragile X Mental Retardation protéine Syndrome) ^16, (protéine de liaison à l'ADN de réponse transactive 43) TDP-43 ¹⁷ ou ¹⁸ Staufen. En particulier, les protéines comme la norme TIA-1 / R sont, comme G3BP, nucléation des protéines de liaison d'ARN qui peuvent induire ensemble SG lorsqu'il est surexprimé, même si les différentes SG formés peuvent différer en fonction, la régulation et les transcriptions associés. Transfection de la version fluorophore marqué de l'un de ces composants clés de nucléation ou de SG peut être effectuée à l'image notamment de montage et dynamique SG.

Protocole

Toutes les procédures d'animaux dans ce protocole sont en stricte conformité avec les lignes directrices de la directive du Conseil communautaire européen du 24 Novembre 1986 (86-609/EEC). Maison des souris du groupe, permettant la nourriture et de l'eau ad libitum. Les maintenir dans un environnement contrôlé (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% d'humidité) avec un 12 heures: 12 heures de lumière: cycle d'obscurité (lumière sur à 7h00).

1 Culture de cellules murines primaires:. Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)

1. Autoclave pinces fines, ainsi que des pinces et des ciseaux de dissection courbes. Conserver dans un contenant stérile. Utilisation stérile D-PBS (Phosphate-Buffered Saline de Dulbecco). Préparer un milieu complet MEF: milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) / F12 supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (FBS), 1 mM de L-glutamine, du pyruvate de sodium 1 mM, 1% d'acides aminés non essentiels, et mM de 2-mercaptoéthanol 0,5 et chaud à 37 ° C.
2. Euthanasier une souris enceinte (à 13,5 jours post-coïtum (DPC)) Par dislocation cervicale. Retirez les cornes utérines de la souris aseptisé avec 90% EtOH. Sous une hotte stérile et propre, placer les cornes avec les embryons dans 37 ° C préchauffé D-PBS. Ouvrez le cornes, le lieu les embryons dans une boîte de Petri en plastique stérile 100 mm, les nettoyer de la matière du cordon ombilical et les laver chaud D-PBS pour éliminer l'excès de sang. En vertu d'un binoculaire, enlever les branches de l'embryon, les organes internes et la partie supérieure de la tête contenant le cerveau.
3. Dans une nouvelle boîte de Pétri, émincer l' embryons en très petits morceaux avec un instrument chirurgical stérile lame ou des ciseaux (au moins pendant 1 min). Dans le cas d'embryons de différents génotypes, veillez à mettre chaque embryon dans des plats individuels de Petri et de garder la queue ou la tête supérieure pour le génotypage.
4. Couvrir l'embryon avec 1x trypsine-EDTA (0,25% de trypsine, 1 mM EDTA). Incuber pendant 30 min à 1 heure dans un incubateur à 37 °. Ajouter 10 ml de completMilieu MEF pour arrêter la réaction de la trypsine. Pipette de haut en bas pour éliminer tous les agrégats. Laisser reposer la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml (rempli de milieu complet) pendant 10 min, le surnageant et centrifuger pendant 5 min à 300 x g à température ambiante. Reprendre le culot dans du milieu complet (6 ml d'une embryon). Cellules nucléées viables peuvent être comptées en utilisant trypan bleu (Environ 5 x 10 ⁶ cellules peuvent être attendus d'un embryon). Plaque 3 ml par 60 mm boîte de Petri.
5. Changer le support le lendemain et permettre aux cellules de se développer jusqu'à ce que les plats sont confluentes. Beaucoup types de cellules peuvent être vus, mais seules vont survivre sous-culture des fibroblastes.
6. Fractionner les cellules et leur permettre de se développer dans des boîtes de 35 mm avec fond en verre (important pour l'expérience laps de temps), jusqu'à 50-70% de confluence pour la transfection. Test de Mycoplasma et des agents pathogènes de la souris.

2. Culture Adaptations dans le cas des neurones

1. La veille de la culture, le manteau 35 mm verre plats de Pétri de fond avec la poly-L-lysine (200 pi de 0,1 mg / ml) sous une hotte stérile et propre, et laisser toute la nuit.
2. Le lendemain matin, rincer à l'eau pure stérile, deux fois pendant 5 min et une fois pendant 45 minutes à 1 heure. Remplacer par 2 ml de DMEM plus 10% de FBS et conserver dans un incubateur à 37 ° C.
3. Disséquer embryons à 18,5 dpc. Sous une hotte stérile et propre, placer les cornes avec les embryons dans le froid HBSS stérile (solution saline équilibrée de Hank) en 100 mm boîte de Petri. Chiots nouveau-nés peuvent également être utilisés à la place des embryons afin de préserver la vie de la mère et de lui permettre de produire plus de descendants, en particulier dans le cas des animaux transgéniques qui peuvent être difficiles à obtenir. Dans les plats individuels de Petri, prendre chaque embryon ou du nouveau-né et couper la tête avec des ciseaux. Maintenir la tête en insérant pince courbe dans les yeux, couper la peau et ouvrir avec précaution le crâne mou à l'arrièrede la tête jusqu'à ce que les yeux, de chaque côté de la tête. Couper les nerfs optiques et le tronc cérébral, retirez le cerveau, et le mettre dans une nouvelle boîte de Pétri contenant HBSS. En vertu d'un stéréoscope, supprimer toutes les méninges à l'aide de deux pinces fines. Séparer les hippocampes, le cortex ou une autre partie du cerveau en fonction de la structure à étudier.
4. Immerger la structure cérébrale disséquée dans 4,5 ml de HBSS froid préparé précédemment dans 15 ml de tubes et de garder sur de la glace jusqu'à ce que la digestion avec la trypsine. Ajouter 0,5 ml de 2,5% de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 15 min à 20 min. Rincer le 3x de la trypsine avec du HBSS, étant extrêmement attention à ne pas jeter les parties du cerveau digérés.
5. Remettre en suspension dans 500 pi (hippocampes) à 1 ml (cortex) DMEM plus 10% de FBS et pipette de haut en bas plusieurs fois avec 1 ml micropipette munie d'un embout 1 ml, alors équipé d'1 ml, plus de 200 conseils de pi, jusqu'à ce qu'il y est aucun agrégat visible.
6. Distribuer 100 à 200 pl de suspension cellulaire à chaque botto de verre de 35 mmm plat contenant du DMEM plus 10% de FBS et laisser les neurones adhèrent à 37 ° C pendant au moins 3 h. Remplacer par un milieu complet préchauffé neurone (milieu Neurobasal additionné de 250 uM de L-glutamine et NS21, préparé comme décrit dans Chen et al. ¹⁹⁾ et laissé à 37 ° C pour permettre la croissance neuronale. Transfecter les neurones à 5 à 14 jours in vitro (div) (l'efficacité de la transfection est plus élevé après un couple de connexions synaptiques div mais sont mieux établie 7-10 div).

3. Transfection de EGFP-G3BP1 Construct

Transfecter des cellules avec un vecteur contenant l'ADNc de votre protéine d'intérêt (l'un des composants de SG) fusionné à un marqueur fluorescent (GFP, YFP, etc), en utilisant 3 ug de plasmide purifié par boîte de 35 mm.

1. Transfecter les FAE en utilisant une méthode commerciale, en suivant le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux / Réactifs).
2. Transfecter les neurones avec une calciumProcédé phosphate adapté de Xia et al ²⁰ Brièvement.:
   1. Préparer les solutions: DMEM-lavage: DMEM contenant 25 mM de KCl; solution de transfection: DMEM-lavage contient 1x DMKY (HEPES 5 mM, MgCl ₂ 10 mM, du rouge de phénol); et une solution de choc: HeBS 1x, 1x DMKY, et DMSO 2% (v / v); et gardez-les à 37 ° C.
   2. Retirez le support de neurones, filtrat, et le maintenir à 37 ° C. Laver avec du DMEM-lavage puis remplacer par du milieu de transfection et maintenir à 37 ° C au cours de la préparation des précipités d'ADN calcium-phosphate plasmide.
   3. Dans un tube à centrifuger de 1,5 ml, ajouter (dans cet ordre) Braun eau (volume final de 50 ul), 5 pi de _CaCl2 2,5 M et 3 pg d'ADN de plasmide. Déposez ce mélange sur 50 pi de HeBS 2x déjà introduit dans un tube à fond rond en polypropylène. Mélanger le tube par rotation avec la chute. Laissez la forme de précipité à la température ambiante pendant 30 min.
   4. Ajouter le precipitate goutte à goutte sur les neurones et laisser à 37 ° C pendant 30 à 50 min.
   5. Remplacer avec une solution de choc pendant 1 min, puis rincer avec du DMEM-lavage et enfin réintroduire le milieu préconditionné. Gardez les cellules à 37 ° C.

4. Visualisation de G3BP contenant Assemblée et dynamique SG

1. Remplacez le support des cellules qui contient du phénol rouge par milieu dépourvu de rouge phénol.
2. Utiliser un microscope confocal équipé de fluorescence pour les acquisitions. Mettre en marche le système de microscope: une lampe au mercure, un ordinateur, et des lasers. Réchauffez la chambre à 37 ° C au moins 20 minutes avant le début des acquisitions.
3. L'expression de plus de G3BP induit la formation spontanée d'un type de SG. Les cellules peuvent donc être observées pour l'ensemble des 24 SG droit h après la transfection sans induction du stress. Sinon, le stress peut être amené à induire en outre l'ensemble de SG. Ajouter arsénite de sodium à 0,5 mM et étoilest l'acquisition immédiatement après l'addition du composé (granules seront bien formés à l'intérieur de 1 heure).
4. Ajouter de l'huile à l'objectif à immersion (utiliser 40X 63X ou objectifs) et installer la boîte de Pétri sur l'objectif dans le porte-microscope 35 mm adapté, stabilisée sur le support de la scène. Vérifiez que le plat est plat sinon les acquisitions seront modifiés. Allumez la lumière de fluorescence en fonction de la fluorophore pertinentes et visualiser les cellules transfectées. Désactiver fluorescence fois une cellule d'intérêt est dans le domaine afin d'éviter le blanchiment et la cytotoxicité.
5. Dans le "acquérir onglet", sélectionnez les lasers en fonction de la longueur d'onde d'excitation du fluorophore tag (488 nm dans notre protocole qui utilise G3BP EGFP marqués) et sélectionner la longueur d'émission adaptée pour le PMT (tube photomultiplicateur). Régler la puissance du laser (généralement pas plus de 10%) pour réduire au minimum le bruit et la sursaturation de même que la toxicité, et de régler le gain et le décalage de modifier le rapport signal sur bruit.Numérisation rapide (1000 Hz) afin de minimiser la durée d'exposition au laser (moyenne de la ligne 2, la moyenne de l'image 1). Si vous le souhaitez, définissez les paramètres de la pile de Z pour pouvoir reconstruire l'image en 3D (une étape de Z de 1 um est généralement bien avec les cellules). Déterminer l'intervalle de temps entre chaque acquisition: des intervalles plus petits permettent d'obtenir un film plus cohérente, mais cela peut provoquer une toxicité et de photo-blanchiment (un intervalle de 20 secondes a été utilisé dans les expériences décrites). Durée d'acquisition totale peut varier en fonction du type de stress. Beaucoup de SG contenant G3BP sont formés très rapidement sous traitement de l'arsénite et sont bien visibles après 1 heure de traitement: dans ce cas, choisir rapidement les cellules de filmer et de commencer les acquisitions à droite après le stress, d'une durée totale de l'acquisition de 15 - 20 min largement suffisante pour observer l'assemblage de plusieurs Commissions d'études.
6. Enregistrer les images et reconstituer les piles et film en utilisant le logiciel ImageJ.

Résultats

Stress formation de granule est important dans la réponse des cellules à un stress, ce qui permet une adaptation de traduction cellulaire avec point mort, jusqu'à ce que l'effort a disparu, associée à la prévention de l'apoptose. Ce dosage permet d'étudier les SG dans les cellules primaires, en suivant la localisation de composants clés de protéines SGS (Figure 1). G3BP, un facteur clé de l'ensemble SG, est présent plutôt diffuse dans le cytoplasme des MEF en culture ou d...

Discussion

Les étapes les plus critiques dans le protocole concernent la transfection et plus particulièrement les acquisitions de laps de temps, qui doivent être surveillés attentivement afin d'abaisser en bas de la cytotoxicité.

Culture de cellules primaires n'est pas une partie difficile, tant que les conditions stériles sont maintenus et la prudence sont prises afin d'éviter des dommages lors de la dissection et de dissociation cellulaire étapes. MEF peut être conservé congel?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Gibco	21331	Prewarm at 37 °C
Sodium pyruvate	Gibco	11360
Nonessential amino acids	Gibco	11140
L-Glutamine	Gibco	25030
Trypsin	Gibco	15096
Glass bottom B-35	Greiner	627860/627861	Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
DMEM	Gibco	31966	Prewarm at 37 °C
HeBS	Sigma-Aldrich	51558
Neurobasal	Gibco	21103	Prewarm at 37 °C
2-mercaptoethanol	Gibco	31350
Forceps	Biotek	DU-110-A	Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges)
Curved forceps	Biotek	P-110-BUF	Very thin, tips 0.1 mm
Small scissors	Biotek	CM-85-BS	Can be useful to remove hippocampi
Polyplus transfection JetPEI reagent	Ozyme	101-10	MEFs transfection, follow the forward protocol
Inverted laser scanning confocal microscope	Leica	SP5