Visualização de G3BP Estresse grânulos Dynamics em pilhas ao vivo

Resumo

Grânulos de estresse (SGs) são grânulos de RNA citoplasmático contendo partículas paralisadas ribonucleoproteínas (RNPs), e importante na resposta celular a várias tensões. Dinâmica da SGS pode ser seguido em células vivas, visualizando a localização de um componente marcado da SGS em células primárias transfectadas após o estresse.

Resumo

A SGS pode ser visualizada nas células por imunocoloração de componentes protéicos específicos ou poli + mRNAs. SG são altamente dinâmico e o estudo da sua montagem e o destino é importante entender a resposta celular ao stress. A deficiência em fatores-chave da SGS como G3BP (RasGAP SH3 domínio Binding Protein) leva a defeitos de desenvolvimento em ratos e alterações do Sistema Nervoso Central. Para estudar a dinâmica da SGS em células de um organismo, pode-se pilhas de cultura e seguir a localização de um componente marcado transfectadas da SGS. Descrevemos experiência de lapso de tempo para observar contendo G3BP1 SGS em rato embrionárias fibroblastos (MEFs). Esta técnica também pode ser usada para estudar SGs contendo G3BP em neurónios vivos, o que é fundamental, uma vez que foi demonstrado recentemente que estes SG são formadas no aparecimento de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer. Esta abordagem pode ser adaptada a qualquer outro componente do corpo celular e de proteína de grânulo, e realizadacom animais transgénicos, que permite o estudo directo de grânulos, por exemplo, a dinâmica na ausência de um factor específico destes grânulos.

Introdução

Grânulos de estresse (SGs) são focos citoplasmática não-membranoso formado como uma resposta protetora celular ao estresse ambiental, tais como temperatura elevada, estresse oxidativo, hipóxia, choque osmótico, a irradiação UV, a privação de glicose, ou infecção viral ^1. Eles podem ser quimicamente induzida por tratamento com compostos como o arsenito de sódio, o que desencadeia o stress oxidativo. SG acumular tradução preso parado mensageiro ribonucleoprotein (mRNPs) complexos ^2, sequestrando mRNAs da maquinaria de tradução, e sua montagem pode ser desencadeada pela fosforilação de eIF2α (fator de iniciação eucariótico 2 α). SG são estruturas dinâmicas que trocar componentes com os polissomos e outros grãos, como os corpos P. Eles constituem um "centro de triagem", onde mRNAs são classificadas e processadas para qualquer tradução, reinício, degradação, ou embalagem em estáveis ​​mRNPs não polissomal ^3. A montagem da SGS é rápido but é um processo gradual, com vários pequenos agregados iniciais que se aglutinam em grânulos maiores. O uso de inibidores químicos que perturbam ou estabilizar os microtúbulos mostra que é necessária a rede de microtúbulos para a dinâmica de SG, incluindo os processos de montagem, desmontagem e coalescência.

O conjunto dinâmico de SG é também promovida pela agregação de proteínas de ligação a ARN específicas (RNA-BP) como TIA-1 (células T interna antigénio-1) e TIAR (proteína relacionada com o TIA-1), que são capazes de formar dímeros e promover polysome desmontagem e encaminhamento de mRNAs em SG ^4. G3BP (proteína de ligação de domínio SH3 RasGAP) é um tal ARN-PA que se localiza SGs, quando as células são forçadas a arsenito ou a alta temperatura, e a sobre-expressão de G3BP desfosforilado pode induzir GV de montagem ^5.

G3BP é um evolutivamente conservada RNA-BP que foi inicialmente caracterizado através de sua interação com uma proteína ativando-Ras GTPase (RasGAP p120 ^6); mas esta interação foi recentemente revisitou ^7. A família G3BP inclui dois membros em mamíferos, G3BP1 (referido como G3BP) e G3BP2 ^8. Ambas as proteínas colocalize em SGs, quando as células são submetidas a tensão ^9. G3BPs compreendem um domínio N-terminal NTf 2 sugeriu a influenciar a sua localização e oligomerização, seguido pela prolina rica (PxxP) motivos, então motivos C-terminal associada com a ligação RNA: o RNA-canônico Recognition Motif (RRM) com conservadas RNP1 e RNP2 motivos , seguido de uma caixa rica arginina-glicina (RGG). Curiosamente, a análise de diferentes partes da proteína através da construção de diferentes domínios fundidos com EGFP mostrou que o domínio NTf2-like e o domínio de ligação a ARN-se o mais eficiente recrutados para SG, sugerindo a importância das propriedades de dimerização e de ligação de ARN em a montagem da SGS. Diversos modelos têm revelado diferentes funções das proteínas G3BP in vitro ^10-13.Perturbação de G3BP em ratos mostraram a importância desta proteína no crescimento do desenvolvimento e sobrevivência ^{de 14,} bem como um papel importante para G3BP no Sistema Nervoso Central (SNC), caracterizada por ataxia e defeitos em espacial da memória de trabalho ^15. Deficiência G3BP leva à alteração neuronal plasticidade e cálcio homeostase, estabelecer uma ligação directa entre a formação SG e doenças neurodegenerativas ^15. Assim, é importante ser capaz de estudar a dinâmica da SGS em células primárias, como neurônios.

Este protocolo fornece uma maneira simples de observar a montagem de contendo G3BP1 SGS em células primárias em tratamento arsenito. Ele pode ser utilizado para estudar a montagem SG sob diferentes condições, por exemplo, diferentes tipos de stress. Ele também pode ser adaptado a outros grânulos ou outros componentes de SG. Com efeito, este protocolo incide sobre G3BP1, mas existem outros grânulos de stress como marcadores TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) ^2,FMRP (Fragile X Retardo Mental Síndrome de proteína) ^16, (proteína de ligação DNA resposta transacional 43) TDP-43 ¹⁷ ou ¹⁸ Staufen. Em particular, as proteínas como TIA-1 / R são, como G3BP, proteínas de ligação de ARN de nucleação que podem induzir a montagem SGs, quando sobre-expresso, mesmo se os diferentes SGs formadas pode variar em função, regulação e transcritos associados. A transfecção de versão marcou-fluoróforo de qualquer um destes componentes-chave ou nucleadores da SGS pode ser realizada para determinada imagem montagem e dinâmica do GV.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais neste protocolo estão em estrita observância com as diretrizes da Diretiva do Conselho da Comunidade Europeia, de 24 de Novembro de 1986 (86-609/EEC). Casa dos ratos no grupo, permitindo que alimentos e água ad libitum. Mantê-los em um ambiente controlado (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% de umidade), com uma hr 12: 12 luz hr: ciclo escuro (luz às 7:00 am).

1 Cultura de Células Murino preliminares:. Rato embrionárias fibroblastos (MEFs)

1. Autoclave fórceps finos, bem como uma pinça curvos e as tesouras de dissecção. Guarde em um recipiente estéril. Use estéril D-PBS (Phosphate-Buffered Saline Dulbecco). Prepare meio MEFs completa: meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) / F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 1% de aminoácidos não-essenciais, e 0,5 mM de 2-mercaptoetanol e quente a 37 ° C.
2. Euthanize um rato grávidas (em 13,5 dias pós-coitum (DPC)) Por deslocamento cervical. Retire os cornos uterinos do rato higienizado com 90% EtOH. Dentro de uma câmara estéril e limpo, coloque as pontas com os embriões em 37 ° C pré-aquecido D-PBS. Abra a chifres, lugar os embriões em um 100 milímetros estéril de plástico placa de Petri, limpá-los a partir do material do cordão umbilical e lavá-los com água morna D-PBS para remover o excesso de sangue. Sob um binocular, remover membros do embrião, os órgãos internos e a parte superior da cabeça contendo o cérebro.
3. Em uma nova placa de Petri, mediu o embriões em pedaços muito pequenos com um cirúrgico estéril lâmina ou tesoura (pelo menos durante 1 minuto). No caso de embriões de diferentes genótipos, ter o cuidado de colocar cada embrião em pratos individuais de Petri e manter a cauda ou a cabeça superior para genotipagem.
4. Cobrir o embrião com 1x tripsina-EDTA (tripsina a 0,25%, EDTA 1 mM). Incubar durante 30 min a 1 hora num banho a 37 ° C incubadora. Adicionar 10 ml de completaMédio MEFs para parar reação tripsina. Pipeta cima e para baixo para remover todos os agregados. Deixar repousar a suspensão de células para um tubo de 50 ml (preenchido com meio completo) durante 10 minutos, e centrifugar o sobrenadante, durante 5 min a 300 xg à temperatura ambiente. Ressuspender o sedimento em meio completo (6 ml para um embrião). Células nucleadas viáveis ​​podem ser contadas usando tripan azul (Cerca de 5 x 10 ⁶ células pode ser esperado a partir de um embrião). Placa 3 ml por 60 milímetros placa de Petri.
5. Troca da mídia no dia seguinte e permitir que as células cresçam até que os pratos são confluentes. Muitos tipos de células pode ser visto, mas apenas os fibroblastos vão sobreviver subcultura.
6. Dividir as células e permitir-lhes crescer em pratos de 35 mm com fundo de vidro (importante para o tempo de experimentação lapso), até 50-70% de confluência para a transfecção. Teste para Mycoplasma e patógenos do mouse.

2. Cultura Adaptations em Caso de Neurônios

1. O dia antes da cultura, revestimento 35 milímetros placas de Petri de fundo com poli-L-lisina (200 ul de 0,1 mg / ml) sob um capuz estéril e limpo, e deixar durante a noite.
2. Na manhã seguinte, enxaguar com água pura esterilizada, duas vezes durante 5 min e depois durante 45 minutos a 1 hora. Substituir com 2 ml de meio DMEM mais 10% de FBS e manter numa incubadora a 37 ° C.
3. Dissecar embriões em 18,5 dpc. Dentro de uma câmara estéril e limpo, coloque as pontas com os embriões em HBSS frio estéril (Solução Salina Balanceada de Hank) em 100 milímetros placa de Petri. Filhotes neonatais também pode ser usado em vez de embriões, a fim de preservar a vida da barragem e que possa produzir mais descendentes, especialmente no caso de animais transgénicos, que pode ser difícil de obter. Em pratos individuais de Petri, tome cada embrião ou recém-nascido e cortou a cabeça com uma tesoura. Segure a cabeça através da inserção de uma pinça curva para os olhos, cortar a pele e cuidadosamente abrir o crânio mole da parte de trásda cabeça, até os olhos, em cada um dos lados da cabeça. Cortar os nervos ópticos e do tronco cerebral, remova o cérebro, e colocá-lo em uma nova placa de Petri contendo HBSS. Sob um estereoscópio, remova todas as meninges utilizando duas pinças finas. Separa-se o hipocampo, no córtex ou qualquer outra parte do cérebro que, dependendo da estrutura de estudar.
4. Imergir a estrutura do cérebro dissecado em 4,5 ml de HBSS frio preparado anteriormente em tubos de 15 ml e guardar em gelo até a digestão com tripsina. Adicionar 0,5 ml de 2,5% de tripsina e incubação a 37 ° C durante 15 min a 20 min. Lavar o 3x de tripsina com HBSS, sendo extremamente cuidadoso para não descartar as partes do cérebro digeridos.
5. Ressuspender em 500 mL (hipocampo) a 1 ml (córtex) DMEM acrescido de 10% FBS e pipeta cima e para baixo várias vezes com uma micropipeta de 1 ml equipado com uma ponta de 1 ml, em seguida, equipado com 1 ml mais 200 dicas ml, até que haja nenhum agregado visível.
6. Distribuir 100-200 mL de suspensão de células a cada botto vidro 35 milímetrosm prato contendo DMEM acrescido de 10% FBS e deixar os neurônios aderem a 37 ° C durante pelo menos 3 horas. Substituir por neurónio pré-aquecido meio completo (meio Neurobasal suplementado com 250 uM de L-glutamina e NS21, preparado como descrito em Chen et al. ¹⁹⁾ e deixar a 37 ° C para permitir o crescimento neuronal. Transfecção os neurônios em 5 a 14 dias in vitro (div) (a eficiência de transfecção é maior depois de algumas conexões sinápticas div mas é melhor estabelecida 7-10 div).

3. Transfecção de EGFP-G3BP1 Construct

Transfectar as células com um vector contendo o cDNA da sua proteína de interesse (de qualquer componente de SG) fundido com um marcador fluorescente (GFP, YFP, etc), utilizando 3 ug de plasmídeo purificado por 35 milímetros prato.

1. Transfectar as MEFs usando um método comercial, seguindo o protocolo do fabricante (ver o quadro de Materiais / Reagentes).
2. Transfecção de neurônios com um cálciométodo do fosfato adaptado de Xia et al ²⁰ Resumidamente.:
   1. Preparar as soluções: DMEM-wash: DMEM contendo KCl 25 mM; solução de transfecção: DMEM-lavagem contendo 1x DMKY (HEPES 5 mM, _MgCl2 10 mM, vermelho de fenol); e solução de choque: HeBS 1x, DMKY 1x, e DMSO a 2% (v / v); e mantê-los a 37 ° C.
   2. Remova a mídia dos neurônios, filtrado, e mantê-lo a 37 ° C. Lavar com DMEM-lavagem, em seguida, substitua-o por meio de transfecção e manter a 37 ° C durante a preparação dos precipitados de fosfato de ADN-plasmídeo de cálcio.
   3. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar (por esta ordem) Braun água (volume final de 50 ul), 5 ul de _CaCl2 2,5 M, e 3 ug de DNA de plasmídeo. Largue essa mistura em 50 mL de HeBS 2x já introduzidas em um tubo de polipropileno de fundo redondo. Misture o tubo por rotação, juntamente com a queda. Deixe o formulário precipitado à temperatura ambiente durante 30 min.
   4. Adicionar o precipitate gota a gota, para os neurónios e deixar a 37 ° C durante 30 a 50 min.
   5. Substitua com solução de choque para 1 min, em seguida, enxaguar com DMEM-lavagem e finalmente reintroduzir o meio pré-condicionado. Manter as células a 37 ° C.

4. Visualização de G3BP Contendo Assembléia e Dynamics SG

1. Substituir o meio das células que contém vermelho de fenol por fenol médio vermelho-free.
2. Use um microscópio confocal equipado com fluorescência para as aquisições. Ligue os sistemas de microscópio: lâmpada de mercúrio, computador e lasers. Aquecer a câmara a 37 ° C, pelo menos 20 minutos antes do início das aquisições.
3. A expressão mais de G3BP induz a formação espontânea de um tipo de SG. As células podem, portanto, ser observado para o conjunto da SGS 24 hr direita após a transfecção sem indução de estresse. Alternativamente, o stress pode ser induzido para induzir ainda mais a montagem da SGS. Adicionar arsenito de sódio 0,5 mM e estrelat a aquisição logo após a adição do composto (grânulos será assim formado dentro de 1 hora).
4. Adicione o óleo para a objetiva de imersão (use 40X ou 63X objetivos) e instalar a placa de Petri sobre o objetivo do titular microscópio adaptado 35 milímetros, estabilizado no suporte do palco. Verifique se o prato é plana caso contrário, as aquisições serão alterados. Ligue a luz de fluorescência de acordo com o fluoróforo relevante e visualizar células transfectadas. Desactivar a fluorescência uma vez por célula de interesse está no campo, a fim de minimizar o branqueamento e citotoxicidade.
5. No "adquirir guia", selecione os lasers, dependendo do comprimento de onda de excitação do fluoróforo tag (488 nm em nosso protocolo que utiliza G3BP EGFP-marcadas) e selecione o período de emissão adaptado para a PMT (tubo fotomultiplicador). Ajustar a potência de laser (geralmente não mais do que 10%), para minimizar o ruído e supersaturação, bem como a toxicidade, e ajustar o ganho eo deslocamento para modificar a relação sinal-ruído.Digitalização rápida (1.000 Hz), a fim de minimizar o tempo de exposição do laser (linha média 2, quadro médio 1). Se desejar, defina os parâmetros para a pilha Z para ser capaz de reconstruir a imagem em 3D (um passo Z de 1 mícron é geralmente bem com as células). Determine o tempo de intervalo entre cada uma das aquisições: intervalos menores permitem obter um filme mais coerente, mas isto pode provocar a fotodegradação e toxicidade (um intervalo de 20 segundos foi usado nas experiências descritas). Duração de aquisição total pode variar, dependendo do tipo de stress. Muitos SG contendo G3BP são formadas muito rapidamente sob tratamento arsenito e são bem visíveis após 1 hora do tratamento: nesse caso, escolher rapidamente as células para filmar e iniciar as aquisições logo após o stress, com uma duração total de aquisições de 15 - 20 min largamente suficientes para observar a montagem de vários GV.
6. Salve as imagens e reconstruir as pilhas e filme usando o software ImageJ.

Resultados

A formação de grânulos de stress é importante na resposta de células ao stress, permitindo uma adaptação celular com tradução parada, até que a pressão foi eliminada, associado à prevenção de apoptose. Este ensaio permite estudar as SGS em células primárias, seguindo a localização dos principais componentes proteicos SGs (Figura 1). G3BP, um fator-chave de montagem SG, está presente, em vez difusamente no citoplasma das MEFs cultivadas ou neurônios (Figura 2A A e

Discussão

Os passos mais críticos no protocolo preocupação a transfecção e mais particularmente as aquisições lapso de tempo, que devem ser cuidadosamente monitoradas a fim de baixar a citotoxicidade.

Cultura de células primárias não é uma parte difícil, desde que sejam mantidas condições estéreis e cuidado é tomado para evitar danos durante as etapas de dissecação e de dissociação celular. MEFs pode ser mantido congelado no início passagens. Neuron transfecção com fosfato de c?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Gibco	21331	Prewarm at 37 °C
Sodium pyruvate	Gibco	11360
Nonessential amino acids	Gibco	11140
L-Glutamine	Gibco	25030
Trypsin	Gibco	15096
Glass bottom B-35	Greiner	627860/627861	Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
DMEM	Gibco	31966	Prewarm at 37 °C
HeBS	Sigma-Aldrich	51558
Neurobasal	Gibco	21103	Prewarm at 37 °C
2-mercaptoethanol	Gibco	31350
Forceps	Biotek	DU-110-A	Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges)
Curved forceps	Biotek	P-110-BUF	Very thin, tips 0.1 mm
Small scissors	Biotek	CM-85-BS	Can be useful to remove hippocampi
Polyplus transfection JetPEI reagent	Ozyme	101-10	MEFs transfection, follow the forward protocol
Inverted laser scanning confocal microscope	Leica	SP5