Mince couche chromatographique (CCM) Séparations et essais biologiques d'extraits végétaux pour identifier des composés antimicrobiens

Résumé

Des méthodes sont décrites pour chromatographie sur couche mince (CCM) la séparation d'extraits de plantes et le contact bioautographie pour identifier les métabolites antibactériens. Les méthodes sont appliquées à la sélection de composés phénoliques de trèfle rouge inhibant les bactéries hyper-production d'ammoniac (HAB) originaires de la panse de bovin.

Résumé

Un écran commun pour les composés antimicrobiens de plantes consiste en la séparation d'extraits de plantes en papier ou en chromatographie sur couche mince (PC ou TLC), ce qui expose les chromatogrammes de suspensions microbiennes (par exemple, de champignons ou de bactéries dans un bouillon ou la gélose), laissant du temps pour les microbes de se développer en un environnement humide, et la visualisation des zones de pas de croissance microbienne. L'efficacité de cette méthode de dépistage, connu sous le nom bioautographie, dépend à la fois de la qualité de la séparation chromatographique et le soin apporté aux conditions de cultures microbiennes. Ce document décrit les protocoles standards pour la CCM et le contact bioautographie avec une nouvelle application aux acides des bactéries d'acide de fermentation. L'extrait est séparé sur flexibles (support aluminium) des plaques de CCM de silice, et les bandes sont visualisées sous lumière ultraviolette (UV). Les zones sont découpées et incubées visage vers le bas sur de la gélose inoculé avec le micro-organisme d'essai. Bandes inhibitrices sont visualisés par coloration de la plaque de géloses avec tétrazolium rouge. Le procédé est appliqué à la séparation de trèfle rouge (Trifolium pratense cv. Kenland) des composés phénoliques et leur criblage pour l'activité contre Clostridium sticklandii, une bactérie produisant de l'ammoniac hyper (HAB) qui est natif de la panse de bovin. Les procédés de CCM s'appliquent à de nombreux types d'extraits de plantes et d'autres espèces bactériennes (aérobie ou anaérobie), ainsi que les champignons, peuvent être utilisés comme organismes d'essai, si les conditions de culture sont modifiées pour être compatibles avec les exigences de l'espèce de croissance.

Introduction

Le dosage de composés antimicrobiens dans des plantes nécessite la séparation des constituants d'un extrait de plante, l'exposition d'un micro-organisme d'essai à ces composants, et pour déterminer si la croissance du micro-organisme est inhibée par l'un quelconque des composés. Séparations par papier ou chromatographie sur couche mince (CCM ou PC) sont pratiques car de nombreux composés peuvent être séparés sur une surface plane. La séparation est basée sur la polarité, avec des composés de liaison étanche à l'adsorbant (cellulose dans le cas de PC, et une variété d'adsorbants dans le cas de la Chromatographie sur couche mince) et la migration de moins que les autres ^une. Figure 1 donne un exemple de la position relative des des composés phénoliques polaires et non polaires après la séparation sur une plaque de TLC de silice.

Figure 1. Diagramme illustrant la répartition des composés de polarités différentes après la séparation sur une couche mince de silice chromatographique (CCM) plaque. Composés phénoliques de trèfle rouge (Trifolium pratense L.) sont utilisés comme un exemple. Des composés polaires tels que le clovamide, ont une forte affinité pour un adsorbant polaire comme le silice et restent près de l'origine (OR), alors que moins de composés polaires, tels que les trois isoflavones près du front de solvant (SF), partition plus facilement dans les solvants (qui sont moins polaires que la silice à moins que l'eau, des acides ou des bases sont incluses) et de migrer plus haut sur la plaque.

Après séparation de l'extrait sur ​​une plaque de CCM, les micro-organismes d'essai peuvent être exposés à tous les composés de la plaque, en accélérant ainsi l'identification des composants actifs de l'extrait ^2. Si une culture fongique ou bactérienne est exposé au chromatogramme, la croissance microbienne se produit partout sauf sur les zones où la croissance inhibiteurcomposés y. Zones d'inhibition peuvent ensuite être visualisées en observant le contraste entre la croissance du mycélium et les zones de libre-croissance si les champignons ont été appliquées ³ ou par pulvérisation avec des composés qui changent de couleur lorsqu'ils sont réduits ou hydrolysé par des cellules vivantes ^4. Bien que l'utilisation de papier ou couche mince chromatogrammes pour les tests antimicrobiens a été d'abord appliquée aux antibiotiques et fongicides ^{5 3,6,} extraits de plantes sont maintenant souvent masqués pour les composés antimicrobiens avec cette méthode, souvent appelés bioautographie. Les protocoles décrits ici s'appliquent à bioautographie de chromatogrammes en couche mince. TLC est largement utilisé parce qu'il est relativement rapide et peut être effectué sur les différents adsorbants (par exemple, la silice, l'amidon, l'alumine), ainsi que de fournir une bonne résolution et ^une sensibilité.

Les extraits de plantes peuvent être préparés pour TLC dans de nombreuses façons. Les méthodes courantes comprennent le matériel végétal extraction dans alcdes mélanges tels que l'éthanol à 80% ^7,8, éventuellement avec l'addition d'acide ou de base ⁹ ohol à l'eau. Suite à une extraction dans de tels solvants, qui contiennent un peu d'eau et sont peut-être acide ou basique, les extraits doivent être concentrées de sorte qu'ils peuvent être appliqués à des plaques de CCM dans un volume minimal. La concentration des extraits d'alcool dans l'eau peut être obtenue en divisant l'aide de solvants organiques non miscibles à l'eau ⁸ ou avec un mélange de tels solvants, tels que l'éther éthylique-acétate d'éthyle (1:1, v / v) ^10,11. Métabolites de plantes différentes sont extraits dans différents solvants organiques, en fonction de leur polarité. Pour s'assurer que les acides ou les bases organiques végétaux sont extraits dans des solvants organiques, à ce stade, le pH d'un extrait d'alcool dans l'eau peut être élevé ou abaissé avec un acide ou une base soluble dans l'eau pour convertir les analytes dissociées en leurs formes non dissociée, qui sont ensuite soluble dans les solvants organiques neutres ^9. La phase organique peut alors être evaporated sous pression réduite ou sous atmosphère d'azote et on ajuste le volume souhaité pour la CCM. Le pH de l'extrait est peu susceptible d'être létale pour les micro-organismes dans les essais biologiques en raison de la séparation des analytes dans des solvants neutres, petit volume final, et l'évaporation de l'extrait sur la plaque de CCM avant la séparation.

Les champignons et les bactéries sont utilisées comme des micro-organismes d'essai dans bioautographie d'extraits de plantes ^2. Les spores de certains champignons tels que Cladosporium cucumerinum, germent sur ​​des plaques de CCM (en dehors des zones avec des composés inhibiteurs) si pulvérisée sur les plaques dans une solution nutritive et on les incube dans un environnement humide pendant plusieurs jours ^3. Le mycélium foncé de C. cucumerinum sur les zones non inhibitrice offre un contraste frappant avec les zones franches de la croissance du mycélium. Bien que les bactéries ont été appliquées à une Chromatographie sur couche mince (CCM) des plaques de la même manière ^4,12, les bactéries sont également versé sur TLCsurfaces de la plaque de gélose superpositions ^13,14. Levure, telle que Candida albicans, peut être appliquée dans les superpositions de gélose ainsi ^14. Alternativement, des plaques de CCM peuvent être placés face vers le bas sur une gélose inoculée avec des bactéries ou des levures ^{10,15 8,} un procédé connu sous le nom de contact bioautographie ^2.

Nous décrivons une méthode pour le contact bioautographie pour cribler des composés phénoliques antimicrobiens du trèfle rouge (Trifolium pratense cv. Kenland). Le micro-organisme test est Clostridium sticklandii, une bactérie du rumen hyper ammoniac-production (HAB) et obliger anaérobie. Bien que les séparations utilisées ne résolvent pas tous les composants de l'extrait, elles facilitent l'identification des zones d'activité antimicrobienne, réduisant ainsi la piscine de composés antimicrobiens possibles. Le protocole utilise des procédures standard pour la CCM ^1. Le protocole décrit également certaines des techniques requises pour la culture obligationsgrille anaérobies pour un tel essai, l'utilisation d'un bio-autographie de contacts ¹⁵ et un procédé de visualisation avec un sel de tétrazolium, qui colore les cellules vivantes ^2,4.

Protocole

Une. Préparation de l'extrait de la plante

1. Voir Kagan et Flythe ¹⁰ pour l'extraction des composés phénoliques de Trifolium pratense cv. Kenland.
2. Pour extraire d'autres composés dans d'autres usines, consultez la documentation de l'analyse phytochimique des méthodes d'extraction de plantes ou spécifique-métabolites (beaucoup sont décrits), ou chercher des protocoles tels que ceux de Khurram et al. ^7,8 qui isolent de nombreux composés d'un grand gamme de polarités.

2. Préparation de couche mince Plaques

1. Nettoyer les plaques de CCM par le développement dans un ou plusieurs solvants polaires neutres, afin de déplacer les contaminants adsorbés hors de la zone de développement.
   1. Dans une hotte de laboratoire, préparer suffisamment de solvant de nettoyage (par exemple 15 à 100 ml d'acétate d'éthyle-méthanol 2:1, v / v) pour couvrir le fond de la chambre de développement TLC, ainsi que le bord inférieur d'une plaque de CCM lors de consigne à l'intérieur de la chambre.
   2. Utilisez comverre ment disponible TLC développer chambres (différentes tailles disponibles, avec des couvercles) ou béchers en pyrex recouvert de papier aluminium ou bocaux.
   3. Utilisez des ciseaux pour couper (flexibles) des plaques de gel de silice en plastique à des créances, qui viennent dans différentes tailles (20 cm x 20 cm et plus petits), pour s'adapter à la chambre de développement disponible en aluminium ou. (Attention: la silice peut provoquer une atteinte des poumons en cas d'inhalation Travailler dans une hotte, et manipuler des plaques de CCM avec des gants pour éviter d'avoir des huiles de la peau sur la silice..)
   4. Insérez les plaques dans la chambre, avec les sommets appuyé contre les parois de la chambre. Elles ne doivent pas se toucher. Couvrir la chambre et laissez le solvant déplacer la plaque par capillarité.
   5. Lorsque le solvant a atteint le sommet des plaques, enlever les plaques de la chambre et les disposer dans une position debout dans la hotte jusqu'à évaporation du solvant.
   6. Vérifiez si des impuretés ont migré vers le haut de la plaque de CCM par la recherche d'une bande jaune sous visiblelumière, ou une bande fluorescente sous rayonnement ultraviolet (UV) (voir le «front d'impureté" ou SI sur la figure 2B). Si la majorité de la plaque a encore une teinte jaunâtre, répétez le processus de nettoyage.
   7. Après avoir enlevé les plaques CCM de la chambre, jeter le solvant. Laisser le solvant résiduel s'évaporer complètement avant d'utiliser la chambre pour le protocole 2.
   8. Pour éliminer l'humidité résiduelle qui peut affecter la migration des composés de silice ^16, prop les plaques en position verticale dans un four de séchage à 100 ° C (10-15 min pour un 20 cm x 20 cm plaque, et 5 min pour 7 cm x 10 cm plaques ).
   9. Si un séchage à l'étuve à 100 ° C n'est pas disponible, les plaques de chaleur pour une période de temps plus longue à des températures plus basses (par exemple 40 min à 60 ° C).
   10. Après que les plaques sont sèches, les laisser refroidir à température ambiante avant de le charger.

3. Préparation de développement Chambers pour Extrait séparation

1. Utilisez des ciseaux pour couper un morceau de papier filtre légèrement en dessous de la hauteur de la chambre, et environ la moitié du périmètre de la chambre de largeur. Ce papier agit comme une mèche pour tirer solvant jusqu'à la paroi de la chambre et de saturer la chambre avec les vapeurs de solvant et d'améliorer ainsi la reproductibilité des séparations ^1.
2. Dans une hotte, mélanger de solvants (acétate d'éthyle-méthanol 4:1, v / v, pour cette étude). Verser le mélange de solvant dans la chambre et couvrir. Attendez jusqu'à ce que toute la mèche est mouillée avec un solvant, ce qui indique la saturation de la chambre, de mettre des plaques dans la chambre.

4. Chargement en cours et le développement de Plaques CCM

1. Légèrement marquer l'origine avec un crayon. Si la plaque adsorbant TLC est tendre et fragile, des notes sur les bords. Les composés doivent être au-dessus de la surface du solvant de développement lorsque les plaques sont insérées dans la chambre de TLC.
2. Dissoudre les extraits dans suffisamment de solvant organique (en l'occurrence, le methanol) à une solution concentrée à la place d'un troublesuspension.
3. Charger les échantillons et les normes que des bandes étroites avec une seringue microlitre ou micropipettes capillaires, laissant un 1 cm frontière sur les côtés de la plaque. Laissez les bandes sécher (attisant la plaque ou le charger dans une hotte aide).
4. Si une plus grande concentration de l'échantillon est nécessaire sur une plaque, "overspot» en chargeant des échantillons de nouveau sur les bandes séchées.
5. Avec des pinces ou des pinces, la plaque de fixation (s) à l'intérieur de la chambre TLC saturé. Elles ne doivent pas toucher la mèche, car il peut fournir solvant pour les plaques aux points de contact, modifiant ainsi le chemin de la migration de composé. Couvrez et laissez chambre plaques se développent.

5. Préparation des plaques pour les essais biologiques

1. Retirer la plaque (s) de réservoir CCM avant le front de solvant atteigne le haut de la plaque, et marquer la hauteur du front de solvant avec un crayon. Laissez plaque sèche dans une hotte.
   1. Développer des plaques de CCM restant dans la même chambre TLC, qui est geralement utilisable pour une journée entière si gardé fermé. Refaire un mélange de solvants pour chromatographie sur couche mince chambre si la quantité de solvant dans la chambre diminue notablement.
2. Après plaques sont sèches, visualiser les bandes à la lumière visible ou UV, et de délimiter les bandes avec un crayon. Une chambre d'observation avec une lampe UV portable est pratique, surtout si la lampe peut détecter des composés à la fois 254 nm (ondes courtes UV) et 365 nm (longueur d'onde UV).
   Remarque: À ce stade ou après la prochaine étape, les plaques peuvent être enveloppés dans une pellicule de plastique, recouverts d'une feuille, et conservés à -20 ° C. Durée maximale de conservation dépend de la stabilité de composé. Parce que la silice n'est pas neutre, certains composés peuvent se dégradent tandis que sur la plaque de CCM.
3. Photographier ou dessiner plaques.
   1. Utilisez un système de gel photodocumentation si une équipée d'UV-dessus et / ou les lumières visibles est disponible.
   2. Si aucun système d'photodocumentation commerciale est disponible, plaques de photographie à l'intérieur d'une boîte doublés de papier noir ou tissu, wie Un jeu de caméra sur un trépied et une lumière UV portable bloqué à un support annulaire ^17. Lorsque vous photographiez des plaques qui n'ont pas un indicateur fluorescent, utiliser un filtre de la lumière bleue sur la lentille de la caméra pour améliorer l'apparence de la bande ^17.
4. Pour aider à la caractérisation des bandes, calculer le facteur de rétention _(Rf) en mesurant les valeurs de distances parcourues par le composé et le front de solvant, et en divisant la première par la seconde (Figure 2A).

6. Culture bactérienne et dosage

1. Préparer et inoculer médias dans des conditions anaérobies. La culture utilisée dans ce cas était Clostridium sticklandii souche SR, qui a été obtenu à partir de la collection de cultures de James B. Russell, Cornell University, Ithaca, NY.
   1. Voir Flythe et Kagan ¹³ et la liste des matériaux pour une description des HAB médias.
2. Cultiver la culture à la phase exponentielle ou stationnaire. Utilisez anaérobie techniqu stérilees lorsqu'on travaille avec des micro-organismes anaérobies.
3. Inoculer la culture (1% v / v) dans de la gélose en fusion après que la température de la gélose (0,75% p / v) a diminué à moins de 60 ° C. Mélanger délicatement et mettre immédiatement dans une chambre anaérobie (95% de CO ₂ -5% H ₂ atmosphère HAB médias) à verser.
4. Verser dans 15 mm x 100 mm en plastique des boîtes de Petri, et laisser se solidifier.
5. Avec des ciseaux, couper la plaque de CCM dans les zones contenant groupe (s) d'intérêt. Lay bandes face vers le bas sur des plaques d'agar-agar, le marquage des bandes sur le support de plaque pour garder une trace de l'orientation originale sur plaque de CCM. Posez une bande TLC utilisé sur une plaque de gélose en tant que témoin.
6. Incuber les boîtes de gélose, côté agar en bas, dans la chambre anaérobie (24 h, 39 ° C).

7. Visualisation de testées biologiquement plaques de gélose

1. Avec une pince, enlever les bandes à partir de plaques de gélose pendant qu'ils sont dans la chambre anaérobie.
2. Ajouter 1% (p / v) tetrazolium rouge, préparée dans de l'eau, goutte à goutte sur les surfaces des plaques de gélose. Laisser la coloration se développer pendant au moins 20 minutes, ou jusqu'à ce que la plaque de commande tourne complètement rouge, avant de retirer de la chambre anaérobie. Les bactéries anaérobies commencent à perdre leur viabilité immédiatement après le retrait de la chambre anaérobie, mais la couleur est stable pendant plus de 24 heures.
3. Photographier à la lumière visible.

Résultats

Représentant séparations TLC de silice de trèfle rouge (Trifolium pratense cv. Kenland) d'extraits, contenant des composés phénoliques, sont présentés dans la figure 2. Séparation de l'extrait de trèfle rouge dans l'acétate d'éthyle-hexane (9:1, v / v), plus de 8,5 cm, a donné cinq bandes, une incomplètement résolu à partir de l'origine (figure 2A). Cependant, la figure 2B montre que près de deux fois plus de bandes ont été...

Discussion

Ce protocole décrit un procédé simple pour la séparation d'un extrait en sous-ensembles de composés et de dosage de ces sous-ensembles contact par bioautographie. Le procédé est tout à fait similaire à celui utilisé par Chomnawang et al. ¹⁵ pour cribler des inhibiteurs de métabolites de plantes à des bactéries responsables de la gonorrhée. Le type de bioautographie employé à l'écran pour les composés de plantes antimicrobiens dépend de nombreux facteurs, y compris la micro-...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 × 20 cm	EMD Chemicals	5554/7	These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm.  Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background.  Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka.  Adsorbents other than silica may be needed.  Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used.
Sharp, heavy-duty scissors	any sewing supply company	similar to Fiskars  175800-1002	For cutting TLC plates.  A paper cutter with a sharp blade can be used as well.  Do not inhale silica dust.
Drying oven at 100 °C (mechanical convection)	Thermo Scientific	PR305225M	Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)
TLC chamber	Kimble Chase	416180-0000	Alternative sources:  Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 × 10 cm).  Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors).
50-µL syringe with flat needle tip	Hamilton	80965	For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µL.  Alternative sources are equivalent.
micropipets	Drummond	2-000-001	For loading small amounts of standards or samples.  Alternative sources:  VWR.  Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch.
Filter paper (#1 grade)	Whatman	1001 917	Serves as a chamber wick.  Other grades of filter paper are OK.  This size can be trimmed for the chambers holding 20 × 20 cm plates.
Beaker tongs	Fisher Scientific	15-186	For putting plates in and out of a large TLC chamber.  Alternate sources: VWR
Flat-edge forceps	Fisher Scientific	10-275	For putting plates in and out of a small chamber.   Alternate sources: VWR
Small portable UV lamp with 4-Watt or 6-Watt bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively)	Ultraviolet Products	95-0271-01	Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)
Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp	Ultraviolet Products	Chromato-Vue C-10E	UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here.  Alternate sources: Spectronics Corporation.
Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp	Kodak	Gel Logic 200	Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com).  See protocol for homemade alternative.
Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl	Coy	7150000	This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described.  However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay.  A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others
Tetrazolium red	Sigma-Aldrich	T8877	Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar
			Ingredients for HAB media
Pyridoxamine · 2 HCl	Sigma-Aldrich	P9380	For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent.
Riboflavin	Sigma-Aldrich	R4500
Thiamine HCl	Sigma-Aldrich	T3902
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N3376
Calcium D-Pantothenate	Sigma-Aldrich	C8731
Lipoic Acid	Sigma-Aldrich	T5625
p-Aminobenzoic acid	Sigma-Aldrich	A9878
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8798
Biotin	Sigma-Aldrich	B4639
Cobalamine	Sigma-Aldrich	C3607
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P9130
Pyridoxine	Sigma-Aldrich	P5669
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Iron sulfate · 7 H2O	Sigma-Aldrich	F8263
Zinc sulfate · 7 H2O	Sigma-Aldrich	Z0251
Manganese chloride · 4 H2O	Sigma-Aldrich	M8054
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768
Cobalt chloride · 6 H2O	Sigma-Aldrich	C8661
Copper chloride · 2 H2O	Sigma-Aldrich	459097
Nickel chloride · 6 H2O	Sigma-Aldrich	203866
Sodium molybdate · 2 H2O	Sigma-Aldrich	331058
Trypticase (Pancreatic digest of casein)	Thermo Fisher	B11921
Potassium phosphate monobasic anhydrous	Thermo Fisher	P284
sodium carbonate · H2O	Thermo Fisher	S636
Agar	Thermo Fisher	50841063
Magnesium sulfate · 6 H2O	Thermo Fisher	7791-18-6
Calcium chloride · 2 H2O	Thermo Fisher	BP510
Cysteine HCl	Thermo Fisher	19464780
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Thermo Fisher	P290
Sodium chloride	Thermo Fisher	BP358