Cromatográfica em camada delgada (TLC) Separações e Bioensaios de extratos de plantas para identificar compostos antimicrobianos

Resumo

Métodos são descritos para-cromatografia em camada delgada (TLC) separação de extratos de plantas e contatar bioautografia para identificar metabólitos antibacterianos. Os métodos são aplicados para o rastreio de compostos fenólicos de trevo vermelho que inibem bactérias produtoras de amoníaco hiper (HAB) nativas para o rúmen de bovinos.

Resumo

Um ecrã comum para compostos anti-microbianos de plantas consiste na separação dos extractos de plantas por papel ou por cromatografia em camada fina (TLC ou PC), expondo os cromatogramas para as suspensões microbianas (por exemplo, fungos e bactérias em caldo ou ágar), dando tempo para que os micróbios a crescer em um ambiente úmido e visualizar zonas sem crescimento microbiano. A eficácia deste método de rastreio, conhecido como bioautografia, depende tanto da qualidade da separação cromatográfica e os cuidados com as condições de cultura microbiana. Este artigo descreve os protocolos padrão para TLC e bioautografia contato com uma nova aplicação de aminoácidos bactérias fermentadoras de ácido. O extrato é separado em flexíveis (lastreados em alumínio) placas de sílica TLC, e bandas são visualizados sob luz ultravioleta (UV). As zonas são cortadas e incubadas a face para baixo em ágar inoculado com o microrganismo teste. Bandas de inibição são visualizadas por coloração da placa de ágars com tetrazólio vermelho. O método é aplicado para a separação de trevo vermelho (Trifolium pratense cv. Kenland) compostos fenólicos e seu rastreio quanto à actividade contra Clostridium sticklandii, uma bactéria produtora de amoníaco hiper (HAB) que é nativo ao rúmen de bovinos. Os métodos de TLC aplicar a vários tipos de extractos de plantas e outras espécies bacterianas (aeróbicas ou anaeróbicas), bem como fungos, podem ser usados ​​como organismos de teste, se as condições de cultura são modificados para se ajustar aos requisitos de crescimento das espécies.

Introdução

Ensaio para compostos anti-microbianos em plantas requer a separação dos componentes de um extracto de planta, a exposição de um microorganismo de teste para os componentes, e determinar se o crescimento do microorganismo é inibida por qualquer um dos compostos. Separações por papel ou por cromatografia em camada fina (TLC ou PC) é conveniente, porque muitos compostos podem ser separados sobre uma superfície plana. A separação baseia-se na polaridade, com a ligação de alguns compostos estreitamente ao adsorvente (celulose, no caso de PC, e uma variedade de adsorventes em caso de TLC) e a migração de menos do que os outros ^1. Figura 1 fornece um exemplo das posições relativas compostos fenólicos polares e não polares, após separação numa placa de sílica de CCF.

Figura 1. Diagrama que ilustra a distribuição de compostos de diferentes polaridades, após separação num gel de cromatografia de camada fina (TLC) da placa. Compostos fenólicos de trevo vermelho (Trifolium pratense L.), são utilizados como um exemplo. Compostos polares, tais como clovamide, têm uma forte afinidade para um adsorvente polar como sílica e permanecer perto da origem (OR), enquanto que os compostos menos polares, tais como os três isoflavonas perto da frente do solvente (SF), partição mais facilmente em solventes (que são menos polares do que a água a menos de sílica, ácidos ou bases são incluídos) e migra mais longe da placa.

Após a separação de um extracto de uma placa de TLC, os microrganismos de teste podem ser expostos a todos os compostos na placa, acelerando, assim, a identificação dos componentes activos de um extracto ^2. Se uma cultura fúngica ou bacteriana é exposta ao cromatograma, o crescimento microbiano irá ocorrer em todos os lugares, excepto em áreas de crescimento com inibidorcompostos y. As zonas de inibição, em seguida, pode ser visualizado pela observação do contraste entre o crescimento micelial e as áreas livres do crescimento de fungos se foram aplicadas ^3, ou por pulverização com os compostos que mudam de cor quando reduzido ou hidrolisados ​​pelas células vivas ^4. Embora o uso de papel ou de camada fina cromatogramas para ensaios antimicrobianos foi aplicado pela primeira vez aos antibióticos e fungicidas ^{5 3,6,} extratos de plantas já são freqüentemente selecionados para compostos antimicrobianos com este método, muitas vezes referida como bioautografia. Os protocolos aqui descritos aplicam-se a bioautografia dos cromatogramas em camada fina. TLC é amplamente usada porque é relativamente rápida e pode ser realizada em diferentes adsorventes (por exemplo, sílica, amido, alumina), bem como proporcionar boa resolução e sensibilidade ^1.

Extractos vegetais podem ser preparados por TLC de muitas maneiras. Os métodos mais comuns incluem material vegetal extração em alcmisturas OHOL em água tais como etanol a 80% ^7,8, possivelmente com a adição de ácido ou de base ^9. Na sequência de uma extracção em solventes, que contêm água e que são, eventualmente, ácido ou básico, extractos deve ser concentrado de modo a que possam ser aplicadas a placas de TLC em um volume mínimo. A concentração dos extractos de álcool-água pode ser alcançado através da repartição com solventes orgânicos imiscíveis em água ⁸ ou com uma mistura de tais solventes, tal como acetato de etilo-éter etílico (1:1, v / v) ^10,11. Diferentes metabolitos de plantas são extraídos em diferentes solventes orgânicos, dependendo das suas polaridades. Para garantir que os ácidos orgânicos vegetais ou bases são extraídos para solventes orgânicos, nesta fase, o pH de um extracto de álcool e água pode ser aumentado ou reduzido com um ácido solúvel em água ou uma base para converter analitos dissociados em suas formas nondissociated, que são então solúveis em solventes orgânicos neutros ^9. A fase orgânica pode então ser evaporated sob pressão reduzida ou sob azoto, e ajustou-se o volume pretendido de TLC. O pH do extracto é improvável que seja letal para os microorganismos bio-ensaio, devido à partição de analitos em dissolventes neutros, pequeno volume final, e a evaporação do extracto sobre a placa de TLC, antes da separação.

Ambos os fungos e bactérias são empregados como microrganismos testes em bioautografia de extratos vegetais ^2. Esporos de alguns fungos, tais como Cladosporium cucumerinum, germinar sobre placas de TLC (além de regiões com compostos inibitórios), se for pulverizado sobre placas de uma solução nutriente e incubou-se em um ambiente húmido durante vários dias ^3. O micélio escuro da C. cucumerinum em zonas noninhibitory fornece um nítido contraste com as zonas francas de crescimento micelial. Apesar de as bactérias terem sido aplicadas a cromatografia em camada fina (TLC) as placas da mesma forma que ^4,12, bactérias também são derramadas sobre TLCsuperfícies da placa de ágar sobrepõe ^13,14. Levedura, tais como Candida albicans, pode ser aplicado em sobreposições de agar, bem ^14. Alternativamente, placas de TLC pode ser colocado de bruços em ágar inoculadas com bactérias ou leveduras ^{10,15 8,} um método conhecido como contato bioautografia ^2.

Nós descrevemos um método para contato bioautografia para triagem de compostos fenólicos antimicrobianos de trevo vermelho (Trifolium pratense cv. Kenland). O microrganismo teste é sticklandii Clostridium, uma produtora de amônia bactéria hiper ruminal (HAB) e obrigar anaeróbio. Embora as separações utilizados não resolve todos os componentes do extracto, que facilitam a identificação de zonas de actividade antimicrobiana, reduzindo, assim, o conjunto de possíveis compostos antimicrobianos. O protocolo utiliza procedimentos padrão para TLC ^1. O protocolo também descreve algumas das técnicas necessárias para a cultura obrianaeróbios de corrediça para um tal ensaio, a utilização de contacto bioautografia ¹⁵ e um método de visualização com um sal de tetrazólio, que cora as células vivas ^{de 2,4.}

Protocolo

1. Preparação de Extrato vegetal

1. Veja Kagan e Flythe ¹⁰ para a extração de compostos fenólicos de Trifolium pratense cv. Kenland.
2. Para extrair outros compostos em outras plantas, veja a literatura análise fitoquímico por métodos de extracção de plantas ou específica do metabolito (muitos estão descritos), ou olhar para protocolos, tais como aqueles de Khurram et al. ^7,8 que isolam diversos compostos com uma vasta gama de polaridades.

2. Preparação das placas de camada fina

1. Limpo placas de TLC de desenvolver em um ou mais solventes polares, neutras, a fim de mover os contaminantes adsorvidos para longe da zona de desenvolvimento.
   1. Numa hotte, preparar suficiente solvente de limpeza (por exemplo, de 15-100 ml de acetato de etilo-metanol 2:1, v / v) para cobrir a parte inferior da câmara de cromatografia, bem como a extremidade inferior de uma placa de TLC quando conjunto no interior da câmara.
   2. Use comercialmentevidro cialmente disponível TLC desenvolver câmaras (diferentes tamanhos disponíveis, com tampas) ou coberto com folha de alumínio copos pirex ou frascos de preservação.
   3. Use a tesoura para cortar placas de gel de sílica (flexíveis) plástico apoiado, que vêm em vários tamanhos (20 cm x 20 cm e menores), para ajustar a câmara de desenvolvimento, disponível em alumínio ou. (Atenção: sílica pode causar danos nos pulmões se inalado Trabalhar em um exaustor, e lidar com placas de TLC com luvas para evitar a oleosidade da pele para a sílica.).
   4. Coloque as placas na câmara, com os topos encostados as paredes da câmara. As placas não devem tocar uns aos outros. Cubra e deixe a câmara de mover o solvente até a placa por ação capilar.
   5. Quando solvente alcançou o topo das placas, remover as placas de câmara e organizar em uma posição de pé dentro da coifa até solvente tenha evaporado.
   6. Verifique se as impurezas migraram perto do topo da placa de TLC, procurando por uma faixa amarela sob visívelluz, ou uma banda fluorescente sob luz ultravioleta (UV) (ver "frente impureza" ou se na Figura 2B). Se a maioria da placa ainda tem um tom amarelado, repetir o processo de limpeza.
   7. Depois de remover as placas de TLC da câmara, descartar o solvente. Permitir solvente residual evaporar completamente antes de usar a câmara para Protocol 2.
   8. Para remover a humidade residual, que pode afectar a migração de compostos em sílica ^16, as placas de suporte na posição vertical em um forno de secagem a 100 ° C (10-15 min para a 20 cm x 20 cm de placa, e 5 min para 7 cm x 10 cm placas ).
   9. Se um forno de secagem de 100 ° C não está disponível, as placas de calor por um longo período de tempo, a temperaturas mais baixas (ou seja, 40 min a 60 ° C).
   10. Depois as placas são secas, deixá-las arrefecer até à temperatura ambiente antes do carregamento.

3. Preparação de Desenvolvimento de Chambers para Extrato de Separação

1. Use a tesoura para cortar um pedaço de papel de filtro ligeiramente abaixo da altura da câmara, e cerca de metade do perímetro da câmara de largura. Este trabalho funciona como um pavio para desenhar solvente até a parede da câmara e saturar a câmara com vapores de solventes, melhorando assim a reprodutibilidade das separações ^1.
2. Em uma capela, misture solventes (acetato de etilo-metanol 4:1, v / v, para este estudo). Despeje a mistura de solvente para a câmara e cobrir. Espere até que todo o pavio está molhado com solvente, indicando saturação de câmara, para colocar placas na câmara.

4. Carregando e Desenvolvimento de Placas de TLC

1. Levemente marcar a origem com o lápis. Se a placa de TLC adsorvente é macio e facilmente danificada, fazer marcas nas bordas. Os compostos devem ser acima da superfície do solvente de desenvolvimento quando as placas são inseridos na câmara de CCF.
2. Dissolve-se os extractos em solvente orgânico suficiente (neste caso, metanol) para se ter uma solução concentrada, em vez de um turvosuspensão.
3. Carregar as amostras e padrões como bandas estreitas com uma seringa de microlitros ou micropipetas capilares, deixando uma borda de 1 cm na os lados da placa. Permitir que as bandas para secar (ventilando a placa ou carregá-lo em um exaustor ajuda).
4. Se uma maior concentração de amostra é necessária em uma placa, "overspot" por colocar as amostras de novo sobre as bandas secas.
5. Com fórceps ou pinças, conjunto placa (s) no interior da câmara TLC saturada. As placas não devem tocar o pavio, pois pode proporcionar solvente para as chapas em pontos de contacto, alterando, assim, o percurso de migração do composto. Tampa da câmara e deixar placas desenvolver.

5. Preparação das placas para Bioassay

1. Remova a placa (s) a partir do tanque de TLC antes da frente de solvente atingir o topo da placa, e marcar a altura da frente de solvente com um lápis. Vamos placa seca na coifa.
   1. Desenvolver quaisquer placas de TLC restantes na mesma câmara TLC, que é generally utilizável por um dia inteiro, se mantida fechada. Refazer mistura solvente de CCF câmara se a quantidade de solvente na câmara diminui notavelmente.
2. Após as placas são secas, visualizar bandas sob luz visível ou UV, e delinear as bandas com um lápis. Uma câmara de visualização com uma lâmpada UV portátil é conveniente, em especial, se a lâmpada pode detectar compostos, tanto a 254 nm (com ondas curtas de UV) e 365 nm (UV de onda longa).
   Nota: Neste momento ou após a etapa seguinte, as placas podem ser embrulhados em plástico, cobertos com folha, e armazenada a -20 ° C. O tempo máximo de armazenamento depende da estabilidade composto. Porque não é sílica neutra, alguns compostos podem degradar durante a placa de TLC.
3. Fotografar ou desenhar placas.
   1. Use um sistema de fotodocumentação gel se equipado com UV sobrecarga e / ou luzes visíveis está disponível.
   2. Se nenhum sistema de fotodocumentação comercial está disponível, as placas de fotografia dentro de uma caixa forrada com papel escuro ou tecido, with um conjunto de câmera em um tripé e uma luz UV portátil preso a um anel ficar ^17. Ao fotografar as placas que não têm nenhum indicador fluorescente, use um filtro de luz azul sobre a lente da câmera para melhorar a aparência da banda ^17.
4. Para ajudar na caracterização de bandas, calcular os valores do factor de retenção _(Rf) de medição de distâncias percorridas por composto e frente de solvente, e dividindo-se a primeira pela segunda (Figura 2A).

6. Cultura bacteriana e Ensaio

1. Preparar e inocular mídia em condições anaeróbias. A cultura utilizada neste caso era Clostridium SR sticklandii estirpe, que foi obtida a partir da colecção de culturas de James B. Russell, Cornell University, Ithaca, NY.
   1. Veja Flythe e Kagan ¹³ ea lista de materiais para uma descrição dos meios de comunicação HAB.
2. Incubar a cultura a fase exponencial ou estacionária. Use techniqu anaeróbia estériles quando se trabalha com microrganismos anaeróbios.
3. Inocular a cultura (1% v / v) em agar fundido depois da temperatura do ágar (0,75% w / v), foi reduzido para menos de 60 ° C. Misture delicadamente e trazer imediatamente em câmara de anaerobiose (95% de CO ₂ -5% H ₂ atmosfera para a mídia HAB) para derramar.
4. Verte-se 15 milímetros x 100 mm placas de Petri de plástico, e deixar solidificar.
5. Com uma tesoura, corte a placa de TLC em zonas contendo banda (s) de interesse. Coloque faixas viradas para baixo em placas de ágar, marcando bandas na placa de apoio para acompanhar a orientação do original na placa TLC. Coloque uma tira TLC não utilizada para uma placa de agar como um controlo.
6. Incubar as placas de agar agar para baixo, de lado, na câmara de anaerobiose (24 hr, 39 ° C).

7. A visualização das placas ensaiadas biologicamente Agar

1. Com uma pinça, remover faixas de placas de agar enquanto estão na câmara de anaerobiose.
2. Adicionar 1% (w / v) de tetrazolium vermelho, preparado em água, gota a gota, sobre as superfícies das placas de agar. Permitir que a cor se desenvolva durante pelo menos 20 minutos, ou até que a placa de controlo fica completamente vermelha, antes de remover a partir da câmara de anaerobiose. As bactérias anaeróbias começará a perder a viabilidade imediatamente após a remoção da câmara anaeróbia, mas a cor é estável por mais de 24 horas.
3. Fotografia em luz visível.

Resultados

Representante separações sílica TLC de trevo vermelho (Trifolium pratense cv. Kenland) extratos contendo compostos fenólicos, são mostrados na Figura 2. Separação do extracto de trevo vermelho em acetato de etilo-hexano (9:1, v / v), mais de 8,5 centímetros, resultou em cinco bandas, uma incompletamente resolvidos a partir da origem (Figura 2A). No entanto, a Figura 2B mostra que cerca de duas vezes mais bandas foram revelados quando uma amostra diferen...

Discussão

Este protocolo descreve um método simples para a separação de um extrato em subconjuntos de compostos e ensaiando esses subconjuntos por contato bioautografia. O método é bastante semelhante ao utilizado por ¹⁵ Chomnawang et al. Seleccionar para os metabolitos de plantas inibidoras para as bactérias causadoras de gonorreia. O tipo de bioautografia empregues para o rastreio de compostos anti-microbianos de plantas depende de muitos factores, incluindo o microorganismo de teste, a configuração ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silica F254 TLC plates, aluminum-backed, 0.2 mm thickness, 20 × 20 cm	EMD Chemicals	5554/7	These plates are coated with silica that contains an indicator fluorescing at 254 nm.  Compounds absorbing at that wavelength appear dark on a fluorescent green background.  Alternative sources include Analtech, Selecto Scientific, Fluka.  Adsorbents other than silica may be needed.  Plastic-backed plates may be suitable, depending on the solvents to be used.
Sharp, heavy-duty scissors	any sewing supply company	similar to Fiskars  175800-1002	For cutting TLC plates.  A paper cutter with a sharp blade can be used as well.  Do not inhale silica dust.
Drying oven at 100 °C (mechanical convection)	Thermo Scientific	PR305225M	Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)
TLC chamber	Kimble Chase	416180-0000	Alternative sources:  Aldrich. Pyrex beakers or preserving jars can be used for small plates (i.e. 5 × 10 cm).  Cover with aluminum foil (jar lids may contain material extractable by solvent vapors).
50-µL syringe with flat needle tip	Hamilton	80965	For loading amounts of standard or sample exceeding 5-10 µL.  Alternative sources are equivalent.
micropipets	Drummond	2-000-001	For loading small amounts of standards or samples.  Alternative sources:  VWR.  Also, Pasteur pipets can be stretched to a thinner diameter with a butane torch.
Filter paper (#1 grade)	Whatman	1001 917	Serves as a chamber wick.  Other grades of filter paper are OK.  This size can be trimmed for the chambers holding 20 × 20 cm plates.
Beaker tongs	Fisher Scientific	15-186	For putting plates in and out of a large TLC chamber.  Alternate sources: VWR
Flat-edge forceps	Fisher Scientific	10-275	For putting plates in and out of a small chamber.   Alternate sources: VWR
Small portable UV lamp with 4-Watt or 6-Watt bulbs for short- and long-wave UV light illumination (254 and 365 nm, respectively)	Ultraviolet Products	95-0271-01	Alternate sources: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)
Viewing cabinet for use with hand-held UV lamp	Ultraviolet Products	Chromato-Vue C-10E	UV-active bands are more easily circled if plates can be set in here.  Alternate sources: Spectronics Corporation.
Photodocumentation system with overhead UV lamp and visible lamp	Kodak	Gel Logic 200	Alternate sources: Ultraviolet Products (www.uvp.com).  See protocol for homemade alternative.
Anaerobic Chamber, Type A, Vinyl	Coy	7150000	This chamber is appropriate for anaerobic bacteria, like Clostridium sticklandii, as described.  However, growth conditions must be tailored to organism used in the assay.  A biosafety cabinet and other precautions should be taken if pathogenic organisms are used. Alternate sources: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, others
Tetrazolium red	Sigma-Aldrich	T8877	Alternate sources: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar
			Ingredients for HAB media
Pyridoxamine · 2 HCl	Sigma-Aldrich	P9380	For this and for all the other reagents in this table, alternative sources are equivalent.
Riboflavin	Sigma-Aldrich	R4500
Thiamine HCl	Sigma-Aldrich	T3902
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N3376
Calcium D-Pantothenate	Sigma-Aldrich	C8731
Lipoic Acid	Sigma-Aldrich	T5625
p-Aminobenzoic acid	Sigma-Aldrich	A9878
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8798
Biotin	Sigma-Aldrich	B4639
Cobalamine	Sigma-Aldrich	C3607
Pyridoxal HCl	Sigma-Aldrich	P9130
Pyridoxine	Sigma-Aldrich	P5669
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
Iron sulfate · 7 H2O	Sigma-Aldrich	F8263
Zinc sulfate · 7 H2O	Sigma-Aldrich	Z0251
Manganese chloride · 4 H2O	Sigma-Aldrich	M8054
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768
Cobalt chloride · 6 H2O	Sigma-Aldrich	C8661
Copper chloride · 2 H2O	Sigma-Aldrich	459097
Nickel chloride · 6 H2O	Sigma-Aldrich	203866
Sodium molybdate · 2 H2O	Sigma-Aldrich	331058
Trypticase (Pancreatic digest of casein)	Thermo Fisher	B11921
Potassium phosphate monobasic anhydrous	Thermo Fisher	P284
sodium carbonate · H2O	Thermo Fisher	S636
Agar	Thermo Fisher	50841063
Magnesium sulfate · 6 H2O	Thermo Fisher	7791-18-6
Calcium chloride · 2 H2O	Thermo Fisher	BP510
Cysteine HCl	Thermo Fisher	19464780
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Thermo Fisher	P290
Sodium chloride	Thermo Fisher	BP358