Guidée par échographie transthoracique intramyocardique injection chez la souris

Résumé

Injection intra-myocardique percutanée guidée par échocardiographie représente une modalité efficace, fiable, précis et efficaces pour la livraison de gènes agents de transfert ou de cellules dans le cœur murin. En suivant les étapes décrites dans le présent protocole, l'opérateur peut rapidement devenir compétent dans cette technique polyvalent, minimalement invasive.

Résumé

Les modèles murins de maladies cardio-vasculaires sont importants pour l'enquête mécanismes physiopathologiques et explorer les thérapies régénératives potentiels. Les expériences impliquant l'injection du myocarde sont actuellement effectuées par l'accès chirurgical direct par une thoracotomie. Bien commode lorsqu'il est effectué à un autre moment de la manipulation expérimentale telle que la ligature de l'artère coronaire, la nécessité d'une procédure invasive pour la livraison intramyocardique limite modèles expérimentaux possibles. Avec toujours améliorer la résolution de l'échographie et avancées techniques d'imagerie non invasives, il est maintenant possible d'effectuer systématiquement guidée par échographie, l'injection intra-myocardique percutanée. Cette modalité efficace et fiable offre les agents à une région ciblée du myocarde. Les avantages de cette technique sont la prévention de la morbidité chirurgicale, la possibilité de cibler les régions du myocarde sélectivement sous guidage échographique, et la possibilité de livrer à injecter de la myocardium à plusieurs intervalles de temps prédéterminés,. Avec une technique pratiquée, les complications de l'injection intra-myocardique sont rares, et les souris revenir rapidement à une activité normale sur la récupération de l'anesthésie. En suivant les étapes décrites dans le présent protocole, l'opérateur avec une expérience de base de l'échocardiographie peut rapidement devenir compétent dans cette technique polyvalent, minimalement invasive.

Introduction

Les maladies cardiaques sont la principale cause de décès chez les hommes et les femmes aux États-Unis, ce qui représente 600 000 décès par an ^1. Les modèles murins de maladies cardio-vasculaires sont très importantes pour l'enquête mécanismes physiopathologiques et pour explorer des thérapies potentielles. Livraison du myocarde de vecteurs de thérapie génique, cellules souches, des ARN modifiés, et d'autres agents thérapeutiques permis enquête de leur potentiel thérapeutique pour les maladies cardiaques ^2-7. Actuellement, il existe peu d'options pour la livraison du myocarde d'agents thérapeutiques dans des modèles de souris ^6. Injection intra-myocardique sous visualisation directe est couramment utilisé, mais nécessite une sternotomie ou thoracotomie et est limitée à la région exposée du cœur. Bien commode lorsqu'il est effectué à un autre moment de la manipulation expérimentale comme CONT ligature, la nécessité d'une procédure invasive pour la livraison intramyocardique limite modèles expérimentaux possibles et présente unutres effets de la procédure (par exemple, la fibrose due à une thoracotomie). Livraison péricardique percutané des vecteurs viraux ont été rapportés, mais le site et la distribution de l'agent thérapeutique n'est pas homogène et il est difficile de commande ^8. Percutanées résultats d'injection coronaires dans la répartition plus homogène de matière injectée, mais la livraison coronarienne efficace et reproductible est difficile dans des modèles murins.

Ici, nous décrivons un coffre technique d'injection intra-myocardique fermé qui permet minimalement invasive, contrôlé par l'opérateur ciblage d'agents thérapeutiques sous contrôle échographique. La technique est facile à apprendre, évite la nécessité d'une thoracotomie ou sternotomie et leurs complications expérimentales qui en découlent, et offre une plus grande flexibilité sur le calendrier et les sites d'injection intra-myocardique. Ainsi, l'injection intra-myocardique assistée échocardiographie-représente un procédé techniquement simple et très efficace de la manipulation de l'myocarde dans des modèles expérimentaux murins.

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Protocole

Toutes les étapes décrites ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Hôpital pour enfants de Boston.

1 Préparation

1. Faire une analyse anatomique et fonctionnelle cardiaque initiale par échocardiographie avant le début du protocole d'injection, comme la position de la sonde fixe optimale pour l'injection intra-myocardique peut ne pas donner les vues standard optimales pour délimiter l'anatomie et l'évaluation de la fonction.
2. La configuration de l'injection est représentée sur les figures 1A-1C. Passer une seringue vide avec une aiguille gainée, coniques orientée vers le haut, dans la pince de la seringue (voir figure 1C) et fixer la sonde de transducteur à ultrasons dans la pince scan-tête (voir figure 1B). Desserrer le joint de verrouillage à billes de serrage à tête de balayage (figure 1B) et à manipuler l'orientation de la sonde de façon à ce qu'il soit aligné parallèlement à l'axe de l'aiguille. Fixer la numérisationposition de la tête en serrant le joint de verrouillage pince balle scan-tête.
   REMARQUE: Pour l'injection chez la souris adulte, une aiguille G 30 avec un 1 dans / 2,5 cm de longueur est optimale. Une seringue de 1 ml peut être utilisée pour de plus grands volumes, tandis que d'une seringue étanche aux gaz peut être utilisé pour un contrôle plus précis de petites quantités (5 à 10 pi).
3. Appliquer le gel échographique généreusement à la pointe de la sonde avec une spatule pour couvrir la tête le long de son intégralité. Dégainer l'aiguille avec précaution et utiliser l'aiguille monter contrôles pour faire avancer l'aiguille directement sous le transducteur et dans le gel de l'échographie pour la visualisation. Faire des ajustements mineurs à l'aide de l'aiguille de contrôle de montage de sorte que l'aiguille est visualisée clairement sur toute sa longueur sur l'image échographique. Si le capteur est correctement alignée parallèlement à l'aiguille à l'étape 1.4, puis l'aiguille doit rester dans le plan de formation d'image tel qu'il est avancé et retiré au moyen du bouton de commande d'injection (Figure 1C).
4. Dans les étapes suivantes, ne pas déranger la nécessitéle / transducteur alignement horizontal en déplaçant sur l'axe horizontal. Au contraire, cibler des zones spécifiques du cœur pour injection en changeant la (axe des y) en position verticale de la monture d'aiguille et en déplaçant la plate-forme d'animal.
5. Déplacer le transducteur à partir de la plate-forme supérieurement animale en utilisant le contrôle de la hauteur de balayage (figure 1B) pour permettre le placement subséquent de la souris anesthésiée sur la plate-forme d'animal. Cela ne va pas perturber l'alignement de l'axe des x du capteur à l'axe longitudinal de l'aiguille.
6. Retirez la seringue qui a été utilisé pour l'alignement de l'attache de la seringue et la jeter avec précaution. Chargez la nouvelle aiguille et la seringue à l'injecter dans le volume cible finale, permettant à l'espace mort dans l'embout de la seringue. Soyez prudent pour éliminer les bulles d'air. Placer la seringue dans la bride de la seringue sans ajuster l'alignement de l'axe des x. Rétracter complètement la seringue en utilisant la commande d'injection.
   REMARQUE: Pour des fins de formation initiale, l'utilisation du bleu Evanscolorant (1%), Trypan bleuissement (0,4%) ou d'une suspension de microsphères fluorescentes que le produit injecté peut aider l'opérateur à confirmer la compétence et le succès de l'injection ciblée.

2 Injection

1. Tournez sur la plaque chauffante intégrée de la plate-forme de chauffage et le régler pour 37 ° C. Placez la plate-forme des animaux à 180 ° de l'orientation de l'imagerie habituelle, avec la pince anesthésie tuyau et la tête de l'animal le plus proche de l'opérateur. Cela permet au coeur (sur le côté gauche de la poitrine) soit ipsilatéral à la bride de la seringue et l'aiguille. Remarque: dans le sens horaire des ajustements mineurs de rotation supplémentaires à la plate-forme de l'animal peut être nécessaire d'orienter correctement le coeur de l'avion parasternale petit axe de formation d'image qui sera utilisée pour l'injection (Figure 2A).
2. Préparer souris pour échocardiographie comme indiqué précédemment ^9. Anesthésier les souris dans une chambre d'induction avec 2% d'isoflurane. Enlever les poils de la poitrine avec les cheveux crème de suppression d'unD appliquer gel lubrifiant pour les deux yeux pour éviter le dessèchement de la sclérotique.
3. Soulevez le capteur en utilisant l'analyse de contrôle de la hauteur de la tête (figure 1B). Placer le décubitus dorsal de souris anesthésiées au sommet de la plate-forme de l'animal avec son museau chauffé à l'intérieur d'un cône de nez délivrant 1-3% d'isoflurane (figures 2A-2B). Insérez délicatement une sonde rectale et la bande des quatre pattes pour les électrodes de l'ECG, l'application de gel d'électrode pour contact électrique.
   REMARQUE: Un niveau approprié de l'anesthésie doit être assurée pour le traitement humain de l'animal. Il devrait y avoir aucune variation de la fréquence cardiaque et l'absence de réponse de mise en place de l'aiguille à travers la paroi thoracique. Intégrés de contrôle de température de l'homéostasie de la plate-forme des animaux doivent être utilisés pour maintenir la normothermie (37 ± 0,5 ° C), que l'hypothermie se traduira par une bradycardie relative, dilatation ventriculaire, et une gêne éventuelle.
4. Une fois que la souris est bien fixé sur la plate-forme d'animaux, de réduire le transducteur sur la depilapoitrine Ted utilisant le balayage contrôle de la hauteur de la tête (figure 1B). La configuration de l'échographie optimale pour l'injection est pour le cœur à être visualisée à court orientation de l'axe parasternale, selon la technique échocardiographique standard. Tournez la plate-forme animale 20-30 ° vers la droite pour obtenir la fenêtre acoustique optimale pour injection dans le plan d'imagerie du petit axe (Figures 2A et 2B). Remarque: Vous pouvez injection peut être réalisée à partir d'une orientation à long axe parasternale par rotation anti-horaire de la plate-forme animale (figure 2C).
5. Utilisez les commandes de réglage de la plate-forme d'origine animale pour ajuster le champ de vision et pour cibler un site d'injection souhaité dans le myocarde ventriculaire gauche. Pan de va-et-vient à partir de l'apex à la base du coeur à une cible, le lieu d'injection souhaité dans le myocarde ventriculaire gauche (figures 3A-3C). Remarque: La vue à court axe parasternale midpapillary (figure 3A) propose reproducible des sites qui permettent l'imagerie de suivi du site d'injection. Remarque: Vous pouvez également, la vue parasternale grand axe peut être utilisé pour cibler un site d'injection prédéfini (figure 3D).
6. A partir de la seringue dans la pince de la seringue entièrement rétractée, progresser lentement la seringue vers la poitrine de l'animal en tournant la commande d'injection dans le sens horaire (figure 4A). Pour permettre une visualisation à ultrasons claire à la fois le cœur et la pointe de l'aiguille à l'approche de la poitrine, d'utiliser beaucoup de gel à ultrasons sur le côté gauche de la poitrine et d'optimiser la fenêtre acoustique en fixant un large champ de vision sur les contrôles d'échocardiographie. Réglez le point / zone focale sur le site cible pour injection. Des ajustements mineurs à l'aiguille monter contrôles peuvent optimiser l'image de l'aiguille sur toute sa longueur.
   REMARQUE: Certains appareils à ultrasons ont une fonction de logiciel de guidage de l'aiguille à s'étendre le long d'une ligne numérique de l'axe longitudinal de l'aiguille à travers le myocarde cible(Figure 4B). Un tel logiciel peut être utile mais n'est pas indispensable.
7. Avec l'animal sous sédation appropriée (1-3% d'isoflurane mélangé à 0,5-0,8 L / min de 100% d'oxygène), avancer l'aiguille à travers la paroi thoracique de la souris et dans le myocarde, en observant attentivement la position de la pointe de l'aiguille biseautée du tout fois. Arrêter l'avancement lorsque la pointe de l'aiguille est à l'intérieur du myocarde de la cible (figure 4C). L'ensemble pointe biseautée doit être solidement dans le myocarde, afin d'éviter la fuite à injecter dans l'espace péricardique.
8. Lorsque la pointe est à l'endroit désiré, livrer le produit à injecter en poussant sur le piston de la seringue. Livrer le produit à injecter lentement, sur 5-30 sec (en fonction du volume d'être livré). Jusqu'à 50 pi de produit à injecter peuvent être livrés sans compromettre la fonction ventriculaire. Un aspect de echobright transitoire pour la région du myocarde injecté peut être évident après l'injection réussie. Une brève période (en secondes) de bradycard rapportia est parfois noté avec injection dans le myocarde et résout rapidement.
9. Une fois que le produit injecté a été administré, retire immédiatement l'aiguille en rotation anti-horaire du bouton de commande d'injection. La souris doit être maintenu sous anesthésie pendant plusieurs minutes d'observation échocardiographie pour confirmer la fonction ventriculaire préservée et aucune complication postopératoire. Si cela est indiqué, de multiples régions du myocarde peuvent être injectés en série par le repositionnement de l'angle d'approche de l'aiguille par un réglage de la plate-forme d'animal. Après injection intra-myocardique, la souris est placée dans une cage sur son propre et on le laisse récupérer de l'anesthésie en observation.
10. Ne pas laisser un animal sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. Ne retournez pas un animal qui a subi l'injection intra-myocardique à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète. La cage doit être placée sur un coussin thermorégulée avec ready disposition de l'alimentation en eau et de la souris. Inconfort postopératoire n'est pas prévu et l'échec de reprendre correctement le comportement normal peu de temps après l'intervention suggère une complication potentielle (voir Discussion).
11. Prenez soin de l'aiguille immédiatement après la fin de l'injection intra-myocardique afin de minimiser les risques de blessures d'objets tranchants à l'opérateur ou des tiers. Réutilisation d'une aiguille peut entraîner émoussement de la pointe qui rend plus difficile de percer le myocarde et entraîne un risque plus élevé de complications.

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Résultats

Injection intra-myocardique murin de bleu de méthylène ou des microsphères fluorescentes

L'injection de colorant bleu Evans est utile à des fins de formation. Peu après l'injection, l'euthanasie la souris et enlever le coeur de visualiser la localisation du colorant bleu injecté. Figure 5 montre un exemple d'une injection réussie, avec un colorant bleu d'infiltration du myocarde au niveau du muscle mi-papillaire (figure 5A, dans la r?...

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Discussion

Biologiques peuvent être livrés au myocarde par injection directe intramyocardique, injection intrapéricardique, ou l'administration indirecte via la circulation sanguine. Cellulaires récents essais de thérapie dans les modèles d'infarctus du myocarde ont décrit une approche de thoracotomie ouverte à la prestation de injectat ^12-14. Un facteur important dans le succès d'une intervention thérapeutique infarctus repose sur le choix de la voie d'accouchement. La dose la plus élevée lo...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 2100 ultrasound imaging system	Visualsonics
Vevo Integrated Rail System III	Visualsonics
Microscan MS400 transducer	Visualsonics
Microscan MS550D transducer	Visualsonics
PrecisionGlide needles	BD	305128	30 G x 1 in/2.5 cm
1 cc slip tip syringe	Exel International	26048	or equivalent
Gastight 50 μl glass syringes	Hamilton	1705
Trypan blue stain (0.4%)	Gibco	15250	or equivalent
Isoflurane	Baxter	AHN3640	or equivalent
Aquasonic 100	Parker Laboratories	(01-08)	or equivalent
Polystyrene microspheres (red fluorescent)	Life Technologies	F-8842	or equivalent