마우스의 초음파 유도 경 흉부 심근 내 주입

요약

심장 초음파 유도 경피적 심근 주입 뮤린 마음에 유전자 전달 제 또는 세포의 전달을위한 효율적인 신뢰성 있고 타겟팅 양상을 나타낸다. 이 프로토콜에 설명 된 단계에 따라, 운전자는 신속하게이 다재 다능 한, 최소 침습 기술에서 경쟁력이 될 수 있습니다.

초록

심혈관 질환의 생쥐 모델은 병리 생리 학적 메커니즘을 조사하고 잠재적 인 재생 치료를 탐험 중요하다. 심근 주입을 포함하는 실험은 현재 개흉술을 통해 직접 수술 접근에 의해 수행된다. 관상 동맥 결찰 같은 다른 실험 조작의 시간에 수행 될 때 편리하지만, 심근 배달 침습 절차에 대한 필요성이 전위 실험 설계를 제한한다. 지금까지 초음파 해상도와 고급 비 침습적 영상 방식을 개선, 그것은 정기적으로 초음파 유도 경피적 심근 내 주입을 수행 할 지금 가능하다. 이 양상은 효율적이고 안정적​​으로 심근의 대상 지역에 에이전트를 제공합니다. 이 기술의 장점은 수술 사망률의 회피, 선택적으로 초음파지도하에 심근의 지역을 대상으로 시설, myocardiu에 injectate을 제공 할 수있는 기회를 포함복수, 소정의 시간 간격 m. 연습 기술로, 심근 내 주입의 합병증은 드문와 마우스를 신속하게 마취에서 회복 정상적인 활동으로 돌아갑니다. 이 프로토콜에 설명 된 단계에 따라 기본 심 초음파 검사 경험이있는 운전자는 신속하게이 다재 다능 한, 최소 침습 기술에서 경쟁력이 될 수 있습니다.

서문

심장 질환은 매년 600,000 사망 ^한 회계, 미국에서 남성과 여성 모두 사망의 주요 원인이다. 심혈관 질환의 생쥐 모델은 병리 생리 학적 메커니즘을 조사 및 치료 가능성을 둘러보기에 매우 중요하다. 유전자 치료 벡터의 심근 전달, 세포 RNA를 변성하고, 심장 질환에 대한 그들의 ^2-7 치료 가능성의 다른 치료제 허가 조사 줄기. 현재 마우스 모델 ⁶ 치료제의 심근 전달을위한 제한된 옵션이 있습니다. 직접적인 시각화 하에서 심근 내 주입 흔히 사용하지만, 흉골 또는 개흉술을 요구하고 심장의 노출 된 영역에 한정되어있다. 이러한 LAD 결찰 같은 다른 실험 조작의 시간에 수행 될 때 편리하지만, 심근 배달 침습 절차에 대한 필요성이 전위 실험 설계를 제한하고 소개절차와 뉴 부가 효과 (예, 개흉술에 의한 섬유화). 바이러스 벡터의 경피적 심낭 전달보고되었지만 사이트 및 치료제의 분포는 균일하지 않으며 ⁸ 제어하는 것이 곤란하다. 주입 물질 있지만 효율적이고 재현 관상 전달보다 균일 분포 경피적 관상 동맥 주입 결과 뮤린 모델에 도전하고있다.

여기에, 우리는 초음파지도하에 치료제의 최소 침습, 운영자 제어 타겟팅을 할 수있는 닫힌 가슴 심근 내 주입 기술을 설명합니다. 기술은 쉽게 배울 개흉술 또는 흉골 및 부수적 인 실험 합병증의 필요성을 제거하고, 타이밍 및 심근 주사 부위에 더 큰 유연성을 제공한다. 따라서, 심장 초음파를 이용한 심근 내 주입 조작의 기술적으로 간단하고 매우 효과적인 방법을 나타낸다쥐 실험 모델에서 심근.

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프로토콜

모든 기술 단계는 보스턴 아동 병원의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다.

1 준비

1. 심근 내 주입을위한 최적의 고정 센서의 위치가 해부학 및 기능 평가를 서술을위한 최적의 표준 뷰를 생성하지 수 있으므로, 이전에 주입 프로토콜을 시작으로 심 초음파에 의한베이스 라인 심장 해부학 및 기능 평가를 수행합니다.
2. 사출 설치는도 1a-1c에 표시됩니다. 피복 빈 바늘 주사기를 놓고, 위쪽으로 경사 배향은, 주사기 클램프 (도 1c 참조)와 검사 헤드 클램프 초음파 변환기 프로브를 고정 (도 1b 참조). 스캔 헤드 클램프 공 잠금 조인트 (도 1b)를 느슨하게하고 바늘의 축에 평행하게 정렬되도록 트랜스 듀서 방향을 조작. 스캔 - 수정스캔 머리 클램프 볼 잠금 관절을 조여 헤드 위치.
   참고 : 성인 쥐에 주사를 들어, 1 / 2.5 cm 길이 30 G 바늘이 최적입니다. 기밀 주사기는 작은 볼륨의보다 정확한 제어 (5 ~ 10 μL)에 사용할 수있는 동안 한 ML의 주사기는 더 큰 볼륨을 사용할 수 있습니다.
3. 전체가 함께 머리를 보호하기 위해 주걱으로 트랜스 듀서 팁에 자유롭게 초음파 젤을 적용합니다. 조심스럽게 바늘을 unsheathe 바늘 직접 트랜스 듀서에서와 시각화를위한 초음파 젤 내에 바늘을 사전에 컨트롤을 장착 사용합니다. 니들은 초음파 영상에서 그 길이를 따라 명확하게 가시화되도록 바늘 제어를 탑재하여 미세 조절. 변환기가 적절 단계 1.4에서 바늘에 평행하게 정렬 된 경우는 전진 및 분사 제어 노브 (도 1C)와 같이 배출된다 후 바늘 촬상면 내에 유지한다.
4. 후속 단계에서, 요구를 방해하지 않는다수평 축에 하나를 이동하여 제작 / 트랜스 듀서 수평 정렬. 오히려, 바늘의 수직 (Y 축)의 위치를​​ 변경하여 장착하고 동물 플랫폼을 이동시켜 주사 중심의 특정 부분을 타겟팅.
5. 동물의 플랫폼에 마취 된 마우스의 후속 배치를 할 수 있도록 스캔 높이 제어 (그림 1B)를 사용하여 동물의 플랫폼에서 우량 변환기를 이동합니다. 이 바늘의 긴 축에 진동자의 X 축 배향을 방해하지 않을 것이다.
6. 주사기 클램프에서 정렬을 위해 사용 조심스럽게 폐기 된 주사기를 제거합니다. 새 바늘을 넣고 주사기 팁 죽은 공간을 허용, 최종 목표 볼륨으로 injectate 주사기. 공기 방울을 제거주의하십시오. 그 x 축 정렬을 조정하지 않고 주사기 클램프에 주사기를 놓습니다. 완전 분사 제어를 사용하여 주사기를 후퇴.
   참고 : 초기 교육 목적을 위해, 에반의 파란색의 사용염료 (1 %)은, 트리 판 블루 스테인 (0.4 %) 또는 injectate 같은 형광 미립자의 현탁액을 주입 능력과 표적의 확인에 성공 연산자를 어시스트 할 수있다.

2 사출

1. 가열 플랫폼의 통합 따뜻한 켜고 37 ° C '의 설정합니다. 운영자에 가장 가까운 동물의 마취 호스 클램프 및 머리, 일반적인 영상 방향에서 동물의 플랫폼 180 °를 놓습니다. 이것은 (가슴의 왼쪽에) 마음이 주사기 클램프와 바늘 동측 될 수 있습니다. 주 : 동물 플랫폼에 추가 작은 시계 방향으로 회전 조정 분사 (그림 2A)에 사용되는 흉골 단축 영상 평면에 대해 올바르게 마음을 방향을해야 할 수도 있습니다.
2. 이전에 ^구를보고 심장 초음파 검사 생쥐를 준비합니다. 2 % 이소 플루 란으로 유도 챔버에 마우스를 마취. 머리 제거 크림과 함께 가슴 털을 제거공막의 건조를 방지하기 위해 두 눈에 젤 윤활 적용 거라고.
3. 스캔 헤드 높이 제어 (도 1b)을 사용하여 트랜스 듀서를 올린다. 1-3%의 이소 플루 란 (그림 2A-2B)를 제공하는 코 콘 내 주둥이로 가열 된 동물 플랫폼 꼭대기 마취 마우스 부정사를 놓습니다. 부드럽게 직장 프로브를 삽입하고 전기 접촉 전극 젤을 적용, ECG 전극에 네 발을 테이프.
   NOTE : 마취 적정 수준이 동물의 치료를 위해 인간을 확보해야한다. 심장 박동의 변화와 가슴 벽을 통해 바늘의 위치에 대한 응답이 없어야합니다. 저체온증은 상대적 서맥, 심실 팽창, 가능한 불편을 초래할 것 같이 동물 플랫폼의 통합 항상성 온도 컨트롤은 정상 체온 (37 ± 0.5 ° C)를 유지하는 데 사용되어야한다.
4. 마우스 동물 플랫폼 보안되면 depila 상에 트랜스 듀서를 낮출스캔 헤드 높이 조절 (그림 1B)를 사용하여 테드의 가슴. 심장이 표준 심 초음파 기법에 따라, 흉골 단축 방향으로 가시화 될 때까지 주입을위한 최적의 초음파 설정입니다. 단축 영상 평면 (그림 2A-2B) 주입을위한 최적의 음향 창을 얻기 위해 동물 플랫폼에게 20 ~ 30 ° 시계 방향으로 돌립니다. 주 : 대안 적으로, 주입은 동물 플랫폼 (도 2c)의 반 시계 방향 회전에 의해 흉골 장축 방향에서 수행 될 수있다.
5. 시야를 조정하고 좌심실의 심근에서 원하는 주사 부위를 대상으로 동물 플랫폼 조절 제어를 사용합니다. 좌심실 심근 (도 3A-3C)에서 원하는 주입 위치를 대상으로 심장의베이스에 정점으로부터 전후 패닝. 참고 : midpapillary 흉골 짧은 축보기 (그림 3a는) reproducibl을 제공합니다주사 부위의 후속 영상을 허용 전자의 랜드 마크. 참고 : 또는 흉골 장축이 미리 정의 된 주입 부위 (도 3D)을 대상으로 사용될 수있다.
6. 완전히 수축 된 주사기 클램프 주사기를 시작으로 천천히 분사 제어를 시계 방향으로보기 (그림 4A)를 돌려 동물의 가슴쪽으로 주사기를 진행합니다. 그 가슴에 접근 심장 및 바늘 끝 모두 명확한 초음파 시각화를 허용하기 위해, 가슴의 왼쪽 위에 초음파 겔을 충분히 사용하고 심장 초음파 제어에 넓은 시야를 설정하여 음향 창을 최적화. 주사에 대한 대상 사이트에 초점 / 시간대를 설정합니다. 바늘에 약간의 조정은 제어가 그 길이를 따라 니들의 이미지를 최적화 할 수 마운트.
   NOTE : 일부 초음파 시스템은 디지털 목표 심근까지 바늘의 장축을 따라 선을 연장 봉침 소프트웨어 기능을 갖는다(그림 4B). 이러한 소프트웨어 도구가 도움이 될 수 있지만 필수적인 것은 아니다있다.
7. 동물 적절 진정으로 신중 전혀 모따 바늘 끝의 위치를​​ 관찰하고, 마우스의 흉부 벽을 통해 심근에 바늘을 전진 (1-3 %의 이소 플루 0.5-0.8 L / 분으로 100 %의 산소와 혼합) 배. 니들 팁이 목표 심근 (도 4C) 내에서 전진 할 때 멈춘다. 전체 빗면 팁 심낭 공간으로 injectate 누출을 피하기 위해, 안전하게 심근 내에 있어야한다.
8. 선단이 원하는 위치에있을 때, 시린지 플런저를 밀어 injectate을 제공한다. 5 ~ 30 초 동안 천천히 injectate를 제공​​ (볼륨에 따라 전달되는). injectate의 최대 50 μL은 심실 기능을 손상시키지 않고 전달 될 수있다. 주입 된 심근 지역에 과도 echobright 모양이 성공적으로 주입 후 분명있을 수 있습니다. 상대 bradycard의 개요 (초) 기간아이오와 때때로 심근에 주입 언급하고 신속하게 해결됩니다.
9. injectate 투여되면, 즉시 분사 제어 노브의 반 시계 방향 회전에 의해 바늘을 인출. 마우스가 보존 심실 기능없이 postprocedural 합병증을 확인하기 위해 심 초음파 관찰 몇 분 동안 마취 유지되어야한다. 표시하는 경우, 복수의 영역의 심근 직렬 동물 플랫폼의 조정에 의해 접근 니들의 각도로 재배치하여 주입 할 수있다. 심근 내 주사 후, 마우스는 그 자체 케이지에 넣고 관찰 하에서 마취에서 회복시킨다.
10. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 회복 할 때까지 다른 동물의 회사에 심근 주사를 겪었다 동물을 반환하지 않습니다. 새장은 재와 온도 조절 패드에 배치해야물과 마우스 다이어트의 ADY 제공. Postprocedural 불편이 예상 적절 곧 개입 후 정상적인 동작을 재개 실패는 잠재적 인 합병증 (토론 참조) 제안하지 않습니다.
11. 조심스럽게 심근 내 주입의 완료가 운영자 또는 방관자로 날카로운 물건 손상의 위험을 최소화하기 위해 바늘 직후 폐기. 바늘을 재사용하면 더 도전 심근를 관통 할 수있게 팁의 둔화 및 합병증의 위험이 높은 결과가 발생할 수 있습니다.

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결과

블루 염료 또는 형광 마이크로 스피어와 쥐의 심근 내 주입

에반의 파란색 염료를 주입 연습을 위해 유용합니다. 곧 주사 후, 중간 유두근 수준에서 심근 침윤 청색 염료, 마우스를 안락사 및 주입 청색 염료의 위치를 시각화 할 심장을 제거.도 5를 성공적으로 주입의 일례를 나타낸다 (도 5a는, 영역 밀폐 )의 점선으로. 에반스 블루 염료는 몇 시간 내에 ...

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토론

생물 의약품은 혈류를 통해 직접 심근 내 주입, intrapericardial 주사, 또는 간접적으로 관리하여 심근에 전달 될 수있다. 심근 경색 모델에서 최근 세포 기반 치료 임상 시험 injectate ^12-14의 전달에 개흉술 방식을 설명했다. 심근 치료 적 개입의 성공에 중요 인자는 전달 경로의 선택에 달려있다. 생물의 높은 로컬 도즈는 심근 ^15,16 전달함으로써 달성된다. 직접 시각화에서 심근 내 주?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo 2100 ultrasound imaging system	Visualsonics
Vevo Integrated Rail System III	Visualsonics
Microscan MS400 transducer	Visualsonics
Microscan MS550D transducer	Visualsonics
PrecisionGlide needles	BD	305128	30 G x 1 in/2.5 cm
1 cc slip tip syringe	Exel International	26048	or equivalent
Gastight 50 μl glass syringes	Hamilton	1705
Trypan blue stain (0.4%)	Gibco	15250	or equivalent
Isoflurane	Baxter	AHN3640	or equivalent
Aquasonic 100	Parker Laboratories	(01-08)	or equivalent
Polystyrene microspheres (red fluorescent)	Life Technologies	F-8842	or equivalent