Identifier les sites d'interaction protéine-protéine à l'aide de peptides tableaux

Résumé

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Résumé

Les interactions protéine-protéine médient la plupart des processus dans la cellule et le contrôle de l'homéostasie de l'organisme vivant. Les interactions entre protéines peut provoquer une baisse de la maladie, ce qui rend les interactions entre protéines cibles médicamenteuses importantes. Il est donc très important de comprendre ces interactions au niveau moléculaire. Les interactions protéiques sont étudiés en utilisant une variété de techniques allant de dosages biochimiques et cellulaires à des analyses quantitatives biophysiques, et ceux-ci peuvent être réalisés soit avec des protéines de pleine longueur, avec des domaines de protéines ou de peptides. Les peptides sont d'excellents outils pour étudier les interactions entre protéines depuis peptides peuvent être synthétisés facilement et permettre la mise au point sur des sites d'interaction spécifiques. Tableaux peptidiques permettent l'identification des sites d'interaction entre les deux protéines, ainsi que le dépistage de peptides qui se lient à la protéine cible à des fins thérapeutiques. Ils permettent également des études SAR haut débit. Pour l'identification des sites de liaison, un Typical réseau de peptides contient habituellement se chevauchant partiellement 10-20 résidus des peptides dérivés des séquences complètes d'un ou plusieurs protéines partenaires de la protéine cible souhaitée. La sélection de la gamme pour la liaison de la protéine cible révèle les peptides de liaison, correspondant aux sites de liaison dans les protéines partenaires, dans une méthode facile et rapide à l'aide de seulement petite quantité de protéines.

Dans cet article, on décrit un protocole de criblage de matrices de peptides pour la cartographie des sites d'interaction entre une protéine cible et de ses partenaires. Le réseau peptidique est conçue sur la base des séquences des protéines partenaires compte tenu de leurs structures secondaires. Les tableaux utilisés dans ce protocole étaient Celluspots tableaux préparés par Intavis Instruments de bioanalyse. L'ensemble est bloqué pour éviter une liaison non spécifique et ensuite incubé avec la protéine étudiée. La détection en utilisant un anticorps révèle des peptides de liaison correspondant à des sites d'interactions spécifiques entre les protéines.

Introduction

Les interactions protéine-protéine médient la plupart des processus dans la cellule vivante. Les interactions entre protéines peut provoquer une baisse de la maladie, ce qui rend les interactions entre protéines cibles médicamenteuses importantes. Il est donc très important de comprendre ces interactions au niveau moléculaire. Les interactions protéiques sont étudiés en utilisant une variété de techniques allant de dosages biochimiques et cellulaires à des analyses quantitatives biophysiques, et ceux-ci peuvent être réalisés soit avec des protéines de pleine longueur, avec des domaines de protéines ou de peptides. Les peptides sont d'excellents outils pour étudier les interactions entre protéines. En effet, les peptides peuvent être facilement synthétisés et permettent la mise au point d'un site d'interaction spécifique d'une part, et sur ​​plusieurs cibles protéiques d'une manière à haut débit, d'autre part de ^1,2. dépistage de réseau de peptides est un moyen rapide, facile à réaliser procédé pour obtenir une grande quantité de données sur les interactions d'une protéine cible avec de nombreux partenaires dans un court laps de temps ³. Contrairement à d'autres méthodes biochimiques ou biophysiques pour détecter et analyser les interactions protéine-protéine, le criblage de la matrice de peptide nécessite une très faible concentration de protéine et peut détecter de très faible liaison. matrices de peptides peuvent être utilisés pour de nombreuses applications dans les interactions peptide-protéine tels que la cartographie de la protéine-protéine ou des sites d'interaction ligand-récepteur ^4, les interfaces d'homo- ou d'hétéro-oligomérisation, des anticorps caractérisant épitopes ^5, étudier les activités enzymatiques ⁶ et un débit élevé structure- relation de l'activité (SAR) étudie ^7. Pour un examen approfondi sur le dépistage du réseau de peptides voir Katz et al. ⁴

Plusieurs types de tableaux peptidiques existent actuellement. Il existe deux stratégies de synthèse pour la fabrication de grands ensembles de peptides: synthèse des peptides avant de les attacher au support solide, ou la synthèse de peptides directement sur ​​le support solide, en utilisant essentiellement la technique de ^4,8 SPOT. Leles peptides sont synthétisés sur le support solide généralement par 9-fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc) ⁸ chimie. Parmi les schémas de synthèse courantes sont l'attachement peptide par l'extrémité N-terminale (par exemple, les JPT PepStar tableaux ⁹⁾ et la fixation de peptides grâce à l'extrémité C-terminale (par exemple, des tableaux de PEPSCAN pepchip ^10, JPT pepspot tableaux ⁹ et Intavis tableaux de celluspot ^{11) 4.} Le support solide peut varier et il en va de la chimie du couplage peptidique pour elle. Peptides Cys-terminés peuvent être fixés à des lames de verre par l'intermédiaire du groupe thiol ^12. L'extrémité N-terminale d'un peptide peut être lié de manière covalente à un groupe hydroxyle sur la membrane de cellulose par estérification de l'acide aminé fixé ^huit.

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour cribler des matrices de peptides en tant que méthode pour l'étude des interactions protéine-protéine. Le tableau que nous avons utilisé est le tableau Celluspots, qui est un micro-array contenant grand amount de taches (doublons de 384 points) sur une petite membrane de cellulose pris en charge par une lame de verre. Cela permet de travailler avec de faibles volumes de protéines et d'anticorps et d'obtenir quantité importante de données par expérience unique. Ce tableau contient également la densité de peptide élevé qui permet la détection de faible affinité de liaison. La matrice a été utilisé pour cartographier l'interaction STIL-CHFR, ce qui est très important pour le contrôle de la prolifération cellulaire ¹³ normal. Interaction non contrôlée entre les deux protéines peut conduire au développement d'un cancer. En cartographiant cette interaction, nous avons trouvé le site de liaison spécifique et les résidus ¹⁴ de liaison. Cela ouvre la voie à la conception d'inhibiteurs rationnels qui inhibent cette interaction protéine-protéine.

Protocole

1. Concevoir un tableau Peptide

1. Diviser la séquence de la protéine cible en se chevauchant en partie les résidus 10 à 20 peptides. Varier la quantité de chevauchement sur l'expérience spécifique et les ressources du laboratoire performant, mais en principe, plus le chevauchement le mieux. Lors de la conception des peptides prennent en compte les éléments connus de la structure secondaire de la protéine qui peut être responsable de l'interaction.
2. Commandez le réseau de peptides conçu par les fournisseurs commerciaux. Ici, l'utilisation des peptides liés de façon covalente à la matrice par l'intermédiaire du C-terminal.

Non-spécifique 2. bloquer la liaison

1. Ajouter une solution de tampon Tris 50 mM et de phosphate contenant 0,05% de Tween 20 (TBST / PBST) et ajuster au pH désiré avec une quantité mesurée de HCl ou de NaOH (pour connaître la force ionique précis) et de la force ionique désirée avec NaCl . Ici, en utilisant un pH de 7,5 et une force ionique de 150 mM.
2. Faire une solution de blocage de2,5% (p / v) de lait écrémé en poudre dans du TBST / PBST.
3. Pour éviter la liaison non spécifique, immerger la matrice dans 5 ml d'une solution de blocage. Incuber la gamme de 2 à 4 h à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C sur un agitateur.

3. L'incubation avec la protéine

1. Laver le premier réseau avec 5 ml de solution de blocage pendant 30 secondes et ensuite deux fois avec 5 ml de TBST / PBST pendant 5 min sur un agitateur à température ambiante.
2. Incuber la gamme lavé avec 5 ml de His-solution de protéines contenant 2,5% (p / v) de lait écrémé en poudre pour éviter la liaison non spécifique. Ici, en utilisant 4,5 M de solution de protéine (STIL 500-650) dissous dans la solution de blocage décrite.
   NOTE: Habituellement 5-10 protéine uM sont utilisés pour le dépistage, mais la concentration de protéine peut être même aussi bas que 2-3 uM, en fonction de l'affinité de liaison et les concentrations locales des peptides qui se lient à la matrice (l'efficacité de la synthèse). Le tampon dans lequel la protéineest dissous peut varier mais est commun pour diluer la protéine en utilisant la même solution de blocage décrite ci-dessus.
3. Incuber la matrice dans la solution de protéine de 3-8 heures à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C.

4. Incubation avec l'Anticorps

1. Laver le tableau trois fois avec 5 ml de TBST / PBST. Le premier lavage est de 30 secondes, suivi de deux lavages de 5 min sur un agitateur à température ambiante.
2. Incuber la gamme lavé avec 5 ml d'anticorps conjugué à HRP dilué (1: 1500) dans un tampon d'incubation contenant les mêmes ingrédients à la même concentration que la solution de blocage, pendant 1 heure sur un agitateur à température ambiante. L'anticorps peut se lier soit à la protéine cible ou l'étiquette.
3. Réaliser des expériences de contrôle de tester l'interaction de l'anticorps avec des peptides sur le réseau, surtout si le tableau contient des peptides de la protéine cible (par exemple, pour oligomérisation études) en répétant le même protocole sans step 3, l'incubation avec la protéine.
4. Laver le tableau trois fois avec 5 ml de TBST / PBST. Le premier lavage est de 30 secondes, suivi de deux lavages de 5 min sur un agitateur à température ambiante.

5. La lecture du tableau

1. Effectuer le développement de chimiluminescence avec un kit de substrat Western blot ECL.
2. Effectuer la détection avec un analyseur d'image luminescent.
3. Analyser les résultats. Assurez-vous que les deux exemplaires de la matrice montrent les mêmes signaux, de sorte que les résultats sont fiables. Si la structure de la partenaire de protéine est connue, la recherche sur la structure des peptides de liaison et de chercher les sites de liaison. Même les peptides qui sont bien dans la séquence peuvent être rapprochés dans la structure tertiaire et de créer un site de liaison.

Résultats

STIL est une protéine très importante centrosomale. Il contrôle la division cellulaire normale et la prolifération cellulaire ^{13,15 - 19.} STIL interagit avec plusieurs protéines ^18,20,21, et la plupart des interactions se produisent à travers sa partie centrale, qui est une région désordonnée intrinsèque (IDR) ^14. Nous avons conçu un tableau composé de peptides dérivés de la protéine de liaison CHFR STIL. CHFR est un gène suppresseur de tumeur qui est induite en réponse ...

Discussion

Dépistage du tableau peptide est un excellent outil pour identifier les sites de liaison d'une protéine cible dans ses partenaires. Ce test est rapide et facile à réaliser et les résultats peuvent être obtenus dans un ou deux jours ouvrables. Dépistage du tableau peptide est polyvalent et peut être utilisé à de nombreuses fins. Il peut être utilisé pour caractériser les modifications de traduction soumettre comme la phosphorylation et l'identification des substrats de kinases. Par exemple, la kinase...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peptide array	INTAVIS Bioanalytical Instruments
His-probe Antibody (H-3) HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-8036 HRP
EZ-ECL Kit	Biological industries	20-500-120
Skim Milk	Becton, Dickinson and Company	232100
LAS-3000 camera	FUJI film