Выявление белок-белковых сайтов взаимодействие по пептидов массивов

Резюме

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Аннотация

Белок-белковых взаимодействий посредником большинство процессов в живой клетке и управления гомеостаза организма. Нарушениями белковых взаимодействий может привести к болезни, что делает белковых взаимодействий важные цели наркотиков. Таким образом, крайне важно понимать эти взаимодействия на молекулярном уровне. Белковых взаимодействий изучаются с использованием различных методик, начиная от клеточных и биохимических анализов, чтобы количественных биофизических анализов, и они могут быть выполнены либо с полноразмерные белки, с белковыми доменами, или пептидами. Пептиды служить превосходными инструментами для изучения белковых взаимодействий, так как пептиды могут быть легко синтезированы и позволяют упором на конкретных участках взаимодействия. Пептидные массивы позволяют идентифицировать сайты взаимодействие между двумя белками, а также для скрининга пептидов, которые связывают белок-мишень для терапевтических целей. Они также позволяют высокую пропускную способность исследования SAR. Для идентификации сайтов связывания, в typiкал пептид массив обычно содержит частично перекрывающихся 10-20 остатков пептиды, полученные из полных последовательностей одного или нескольких партнеров белков желаемого целевого белка. Скрининг массив для связывания белок-мишень раскрывает обязательные пептиды, соответствующие сайты связывания в белках партнеров, в простой и быстрый метод, используя только небольшое количество белка.

В этой статье мы опишем протокол для скрининга пептидных массивы для отображения сайтов взаимодействия между белком-мишенью и ее партнеров. Массив пептид разработан на базе последовательностей белков-партнеров с учетом их вторичные структуры. Массивы, используемые в настоящем протоколе были Celluspots массивы, подготовленные INTAVIS биоаналитических инструменты. Массив заблокирован, чтобы предотвратить неспецифическое связывание и затем инкубировали с исследуемой белка. Обнаружение с использованием антитела раскрывает связывающие пептиды, соответствующие определенным сайтам взаимодействия между белками.

Введение

Белок-белковых взаимодействий посредником большинство процессов в живой клетке. Нарушениями белковых взаимодействий может привести к болезни, что делает белковых взаимодействий важные цели наркотиков. Таким образом, крайне важно понимать эти взаимодействия на молекулярном уровне. Белковых взаимодействий изучаются с использованием различных методик, начиная от клеточных и биохимических анализов, чтобы количественных биофизических анализов, и они могут быть выполнены либо с полноразмерные белки, с белковыми доменами, или пептидами. Пептиды служить превосходными инструментами для изучения белковых взаимодействий. Это потому, что пептиды могут быть легко синтезированы и позволяют фокусировки на определенном участке взаимодействия с одной стороны, и на нескольких целевых белков в высокой пропускной образом, с другой стороны ^1,2. Скрининг Пептид массив быстро, легко выполнить метод получения большого количества данных о взаимодействиях белка-мишени с многочисленными партнерами в течение короткого времени ³, В отличие от других биохимических или биофизических методов обнаружения и анализа белок-белковых взаимодействий, скрининг пептид массив требует очень низкую концентрацию белка и может обнаружить очень слабое связывание. Пептидные массивы могут быть использованы для многих приложений в пептид-белковых взаимодействий, таких как отображение белок-белок или рецептор-лиганд сайтов взаимодействия ^4, гомо- или гетеро-олигомеризации интерфейсов, характеризующие антитела, эпитопы, ^5, изучении активности ферментов ⁶ и высокую пропускную способность корпусного Активность отношения (SAR) изучает ^7. Для обзора о скрининге пептид массива углубленного см Кац и др. ⁴

Несколько типов пептидных массивов в настоящее время существуют. Существуют две основные стратегии синтетические пептидные для создания массива: синтез пептидов перед прикреплением их к твердому носителю, или синтеза пептидов непосредственно на твердом носителе, главным образом, с использованием метода SPOT ^4,8.пептиды синтезируют на твердом носителе, как правило, с помощью 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc) химии ^8. Среди общих синтетических схем пептид привязанность через N-конца (например, JPT pepstar массивы ⁹⁾ и привязанность пептид через С-конца (например, PEPSCAN pepchip массивы ^10, JPT pepspot массивы ⁹ и INTAVIS celluspot массивы ^{11) 4.} Твердый носитель может варьировать, и так же химический состав пептидной связью с ней. Cys-концевыми пептиды могут быть прикреплены к предметные стекла с помощью тиольной группы ^12. N-конец пептида может быть ковалентно связан с гидроксильной группой на целлюлозной мембране через этерификации аминокислоты присоединены ^8.

Здесь мы представляем подробный протокол для скрининга пептидных массивы в качестве метода для изучения белок-белковых взаимодействий. Массив мы использовали массив Celluspots, который является микро-массив, содержащий большое АМОЕНТ пятен (дубликаты до 384 мест) на небольшом целлюлозной мембране, поддерживаемых предметное стекло. Это дает возможность работать при низких объемов белка и антител и получение значительного количества данных в одном эксперименте. Этот массив содержит также высокую плотность пептид, который позволяет обнаруживать низким сродством связывания. Массив был использован для отображения взаимодействия СТИЛ-CHFR, которая очень важна для управления распространением нормальный клеточный ^13. Неконтролируемое взаимодействие между двумя белками могут привести к развитию рака. Нанеся на карту этого взаимодействия мы нашли конкретное сайт связывания и связывания остатков ^14. Это открывает путь для разработки рациональных ингибиторы, которые препятствуют это взаимодействие белок-белок.

протокол

1. Проектирование массив пептид

1. Разделить последовательность целевого белка в частично перекрывающихся 10-20 остатков пептидов. Вары величину перекрытия на конкретном эксперименте и ресурсы, выполняющего лаборатории, но, в принципе, больше перекрытия, тем лучше. При проектировании пептиды учитывать известно элементов вторичной структуры в белке, которые могут быть ответственны за взаимодействие.
2. Заказать разработанный массив пептид через коммерческих поставщиков. Здесь используют пептиды, ковалентно связанный с массива через С-конце.

2. Блокирование неспецифическое связывание

1. Сделать буферного раствора 50 мМ Трис или фосфатным, содержащим 0,05% Tween 20 (TBST / PBST) и регулировать до нужного рН с измеренным количеством HCl или NaOH (для того, чтобы знать точное ионной силы) и желаемой ионной силы с NaCl , Здесь используют рН 7,5 и ионную силу 150 мм.
2. Сделать блокирующий раствор2,5% (вес / объем) сухое обезжиренное молоко в TBST / PBST.
3. Чтобы предотвратить неспецифическое связывание, погружать массив в 5 мл блокирующего раствора. Инкубируйте массив в течение 2-4 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С на качалке.

3. Инкубация с белком

1. Промыть массив первых 5 мл блокирующего раствора в течение 30 сек, а затем дважды 5 мл TBST / PBST в течение 5 мин на шейкере при комнатной температуре.
2. Инкубируют промытые массив с 5 мл His-меченого раствора белка, содержащего 2,5% (вес / объем) сухое обезжиренное молоко, чтобы предотвратить неспецифическое связывание. Здесь используют 4,5 мкМ раствора белка (стил 500-650), растворенного в описанном блокирующего раствора.
   Примечание: Обычно 5-10 мкМ белка используются для скрининга, но концентрация белка может быть даже по цене от 2-3 мкМ, в зависимости от аффинности связывания и местных концентраций пептидов, которые связаны с массива (КПД Синтез). Буфер, в котором белокрастворяют может варьироваться, но является общим для разбавления белка с использованием того же блокирующий раствор, описанный выше.
3. Инкубируйте массив в белковом растворе в течение 3-8 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.

4. Инкубация с антителом

1. Вымойте массив со трижды 5 мл TBST / ФБРТ. Первый стирки в течение 30 сек с последующим двух промывок 5 мин на шейкере при комнатной температуре.
2. Инкубируют промытые массив с 5 мл разбавленного HRP-конъюгированного антитела (1: 1500) в инкубационном буфере, содержащем те же ингредиенты в тех же концентрациях, блокирующим раствором, в течение 1 часа на шейкере при комнатной температуре. Антитело может связываться либо целевой белок или тег.
3. Выполнение контрольных экспериментов тестирования взаимодействие антитела с пептидами на массив, особенно если массив содержит пептиды из белка-мишени (например, для олигомеризации исследований), повторив тот же протокол без Steр 3, инкубации с белком.
4. Вымойте массив со трижды 5 мл TBST / ФБРТ. Первый стирки в течение 30 сек с последующим двух промывок 5 мин на шейкере при комнатной температуре.

5. Чтение массива

1. Провести разработку хемилюминесценции с западной промокательной комплекта подложки ECL.
2. Выполните обнаружение с люминесцентным анализатора изображений.
3. Проанализируйте результаты. Убедитесь, что оба дубликаты на массиве показывают те же самые сигналы, так что результаты являются надежными. Если структура белка партнера, как известно, поиск по структуре для связывания пептидов и отыскать сайтов связывания. Даже пептиды, которые гораздо в последовательности может быть близко друг к другу в третичной структуры и создать сайт связывания.

Результаты

СТИЛЬ является очень важным центросомных белок. Она контролирует нормальное деление клеток и клеточной пролиферации ^{13,15 - 19.} СТИЛ взаимодействует с несколькими белками ^18,20,21, и большинство взаимодействий происходить через его центральную часть, которая является по своей пр...

Обсуждение

Пептид скрининг массив является отличным инструментом для определения сайты связывания белка-мишени в своих партнеров. Этот анализ очень быстро и легко выполнить, а результаты могут быть получены в одном или двух рабочих дней. Пептид скрининг массив является универсальным и может быт...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peptide array	INTAVIS Bioanalytical Instruments
His-probe Antibody (H-3) HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-8036 HRP
EZ-ECL Kit	Biological industries	20-500-120
Skim Milk	Becton, Dickinson and Company	232100
LAS-3000 camera	FUJI film