Une intervention chirurgicale pour résection de la Rib souris: un modèle pour à grande échelle de réparation des os longs

Résumé

The overall goal of this procedure is to successfully resect a portion of bone from the rib of a mouse. The procedure was developed as a model to study large-scale long bone repair.

Résumé

Ce protocole introduit chercheurs à un nouveau modèle de grande échelle réparation osseuse en utilisant la nervure de la souris. La procédure indications suivantes: préparation de l'animal pour la chirurgie, l'ouverture de la paroi thoracique du corps, l'exposition de la nervure souhaitée dans les muscles intercostaux environnantes, excision de la section de nervure souhaitée sans provoquer un pneumothorax, et la fermeture des incisions. Par rapport aux os du squelette appendiculaire, les nervures sont très accessibles. En outre, aucun fixateur interne ou externe ne est nécessaire étant donné que les nervures adjacentes fournissent une fixation naturelle. La chirurgie utilise commercialement fournitures disponibles, est simple à apprendre, et bien toléré par l'animal. La procédure peut être réalisée avec ou sans enlever le périoste environnant et donc la contribution du périoste de réparation peut être évaluée. Les résultats indiquent que si le périoste est retenu, la réparation robuste se produit dans 1-2 mois. Nous nous attendons à ce que l'utilisation de ce protocolestimuler la recherche sur la réparation des côtes et que les conclusions faciliteront le développement de nouveaux moyens de stimuler la réparation osseuse dans d'autres endroits à travers le corps.

Introduction

Débilitante blessures squelettiques, l'arthrose chronique et les problèmes graves associés à la chirurgie reconstructive impact sur la productivité économique, bien-être familial, et la qualité de vie. Bien que de petites pauses et des lésions peuvent guérir assez bien, les humains ne sont pas capables de réparer des défauts importants et doivent donc compter sur les procédures de reconstruction pour restaurer la structure et la fonction. Reconstruction greffes allogéniques peut impliquer ou heterogeneic, os morcellized, échafaudages implantés, ou de distraction ostéogenèse. Malheureusement, non seulement il ya des facteurs persistants de morbidité associés à ces traitements, mais la force originale de l'os réparé est rarement atteint. Ainsi, de nouvelles approches cliniques sont nécessaires.

Un moyen de développer des méthodes innovantes pour traiter les défauts segmentaires est d'étudier les situations dans lesquelles la réparation à grande échelle se produit naturellement. Amphibiens célèbre peut régénérer éléments squelettiques, tandis que les mammifères sont considérées comme limitées dans eest la capacité. Cependant, depuis le début du 20 ^e siècle, quelques rapports de la régénération de la nervure humaine ont été publiées suggérant que les humains ne peuvent pas être limitées ^1-4. Actuellement ce phénomène est mieux connu par les chirurgiens plasticiens qui utilisent des matériaux de nervure pour la reconstruction mâchoire, le visage et l'oreille, mais il ne est pas plus largement appréciée ^5. Afin d'étudier cette réparation plus en détail, nous avons développé un modèle chirurgicale en utilisant la souris. En utilisant ce protocole, les chercheurs peuvent identifier les facteurs innés impliqués et utiliser cette information pour faciliter la cicatrisation osseuse dans d'autres endroits.

Il ya plusieurs avantages à utiliser les nervures comme un modèle pour l'étude de la réparation du squelette. Tout d'abord, les nervures entourant fournissent un fixateur naturel (par rapport à la résection du fémur ^6,7). Cela diminue le risque de morbidité des fixateurs internes et externes et simplifie la procédure chirurgicale. Deuxièmement, les couches musculaires minces des wa poitrinell prévoir un accès facile et une excellente visibilité qui font le test comparable à la commodité de la voûte du crâne résections ^8. Troisièmement, contrairement à la calottes qui forment par ossification dermique, la forme de nervures par ossification endochondrale et croître en longueur via l'extension à plaques de croissance situés à chaque extrémité d'une diaphyse central. Par conséquent, la réparation des nervures peut être plus comparable à la réparation des os longs du squelette appendiculaire. En outre, nous avons trouvé que, par rapport au fémur, le périoste de la nervure est plus épais et peut être plus facilement manipulé. Ainsi, les enquêteurs qui souhaitent doser la réparation osseuse dans le but d'étudier le périoste ou de tester des thérapies cellulaires, des agents pharmacologiques, et / ou échafaudages tissulaires peuvent trouver ce modèle chirurgicale utile. En résumé, ce modèle de résection costale fournit un contexte dans lequel l'étude à grande échelle de réparation naturelle de l'os chez les mammifères comme aucun tel modèle d'usage général qui existe actuellement.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures sont conformes à un protocole animale approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université de Californie du Sud.

1. Préparation pour l'intervention

1. Disposez les outils chirurgicaux et les fournitures nécessaires (stérilisée, articles 1 à 18 dans la liste des matériaux) et d'organiser un microscope à dissection et un fibre optique trans-illuminateur dans une hotte ou sur une table aspirante.
2. Placez une souris sexuellement matures (20-30 g, 1 - 3 mois) dans une chambre d'induction avec 4% d'isoflurane pour induire une anesthésie.
3. Confirmez l'anesthésie avec une patte et / ou un test queue de pincement.
4. Appliquer une pommade pour les yeux de la souris pour éviter la sécheresse des yeux pendant la chirurgie.
5. Déplacez la souris pour la platine du microscope. Placer la souris dans le cône de nez du tuyau d'entretien et de positionner latéralement. Fournir une poche chauffante adjacente à l'animal pour aider à maintenir la température du corps.
   PASE:. Position de la souris dépend de vos préférences personnelles et / ou l'impartialité du chirurgien, côté gauche ou à droite est très bien.
6. Réglez l'isoflurane à 2-3% pour l'entretien, et de regarder le taux de respiration.
7. Injecter la buprénorphine (0,05 mg / kg) sous-cutanée (de flanc latéral de la jambe) pour la douleur post-opératoire avec une aiguille 25 G. La jambe peut secousse qui est une réaction normale.

2. incision d'ouverture

1. Détecter la nervure souhaitée par palpation, et nettoyer la zone des cheveux avec un rasoir.
   REMARQUE: Ribs 8-10 sont recommandés depuis nervures 1-7 sont plus proches des poumons et 11-13 sont considérablement plus courte. Compter les côtes devrait commencer par la nervure plus rostrale numéro 1.
2. Préparer la zone avec une alternance de povidone-iode et de l'isopropanol (70%) pistonnage (3x est souvent recommandé par les protocoles d'utilisation des animaux).
3. Couper une incision de 2 cm à travers la peau, directement au-dessus et parallèlement à la nervure désirée avec des ciseaux de microchirurgie de taille moyenne. INCISe à travers les couches musculaires et adipeuses sous-jacents.
4. Placez tous les trois couches (peau, les muscles, la graisse) dans un enrouleur pour exposer la zone chirurgicale, tout en minimisant la taille de l'incision.

3. excision du Rib

1. Couper à travers les muscles intercostaux recouvrant la section désirée de la nervure avec un 5,0 mm scalpel. Position de cette incision autour de 5 mm à proximité de la commune chondrocostale car ce est là la nervure ne est pas aussi forte courbure. Séparez délicatement le muscle de l'os avec pince fine de pointe.
2. Pour créer une résection, tout en conservant le périoste chez l'animal, couper à travers le périoste, le long de la longueur de la nervure avec un scalpel 5,0 mm. Soigneusement séparer le périoste de l'os sous-jacent latéralement par pince fine de pointe. Procédez avec prudence, car le périoste est très délicate et a une consistance gélatineuse.
3. Suivant faire une coupe transversale à travers l'os à une extrémité avec micro-ciseaux fins. Si nécessaire, mesurer la résectionun réticule dans le microscope ou une jauge de type de règle. Puis soulevez délicatement l'os sur le périoste et couper l'autre extrémité.
   REMARQUE: Procédez avec prudence. Ce est l'étape la plus délicate, car tirant sans exciser la nervure ci-dessous va déchirer la membrane pleural et provoquer un pneumothorax. Si la membrane est déchirée pleural ce sera facilement évident que l'intérieur de la cavité thoracique devient visible.
4. Si le saignement se produit à la suite de la coupe de l'os, appliquer une pression à la fin de coupe avec un tampon de coton-tige pour 4-5 sec pour arrêter le saignement.
   NOTE: A l'occasion rare qui saignement persiste, il peut être nécessaire de se arrêter et euthanasier l'animal perte de sang importante et compromettront sa reconstitution (sans remplacement des liquides, le volume de sang maximum qui peut être sans risque être perdu est de 10% du volume total de sang ou 7.7 -. 8 ul / g pour une souris de 25 g, ce qui équivaut à environ 180 à 200 pi ^9).
5. Placer immédiatement la nervure enlevé dans4% PFA pour une analyse ultérieure.
   REMARQUE: si la résection à la fois de l'os et le périoste doit être effectuée, omettre l'incision du périoste et de la séparation (étape 3.2). Depuis le périoste est très étroitement attaché à la membrane pleurale procéder avec prudence, taquiner la nervure loin de la membrane pleurale avec des pinces pour éviter les déchirures.

4. Fermeture de l'incision

1. Suturer les muscles intercostaux sur le dessus de la douille périoste restant avec sutures 9-0 (2 sutures sont généralement suffisants). Passer les sutures directement au-dessus des extrémités de la nervure de coupe, pour agir comme indicateurs de l'emplacement de chirurgie.
2. Retirer l'écarteur. Suturer le muscle sus-jacente et de la graisse avec 9-0 sutures (3-4 sutures sont généralement suffisants). Chez la souris, en particulier avec des couches épaisses de muscle et / ou de la graisse, suturer chaque couche séparément (par exemple, une couche de fils de suture pour la couche musculaire et une couche de fils de suture pour la couche de gras).
3. Fermez lepeau avec des sutures 7-0 (4-5 sutures sont généralement suffisants).
4. Fixez l'incision avec une suture de la colle, de pincer les bords avec de grandes pinces.
5. Sevrer lentement la souris hors isoflurane d'abord se adapter à 1% pendant quelques minutes, puis se éteint.
6. Placez la souris sous une lampe de feu et laisser jusqu'à ce que la conscience est retrouvé, 5-10 min. Après reprend connaissance et tout au long de la période de guérison, la souris doit se déplacer et déambuler normalement et ne montrent aucun signe de détresse.

5. Récupération et analyse

1. Assurer la gestion de la douleur post-opératoire, y compris l'administration de la buprénorphine sous une forme orale de gélatine à 0,5 mg / kg toutes les 12 heures pendant 48 heures. L'administration orale ne nécessite pas de maîtriser l'animal qui pourrait causer de la douleur à la région thoracique.
2. Maintenir la souris dans une cage avec un accès libre à la nourriture et de l'eau pendant la période de guérison. Après l'incision est sec, les animaux femelles peuvent être co-logés tandis que le mâles doit rester isolé pour éviter les combats.
3. Après la période de cicatrisation, suivez la procédure approuvée pour l'euthanasie. Retirer la cage thoracique pour la fixation et l'analyse.

Résultats

Les animaux sont habituellement récupérer rapidement de cette procédure, l'incision guérit bien, et les animaux présentent un comportement normal. La procédure utilise les fournitures disponibles dans le commerce et après la pratique, peut être complété en moins de 1 h. Avant d'utiliser cette procédure pour générer des données expérimentales, il est important d'analyser la résection au point de temps 0 jour pour déterminer si des grands fragments d'os peuvent rester dans la zone de rése...

Discussion

Lors de la première apprendre ce protocole, déterminer où trouver l'incision initiale peut être difficile. Cependant, la pratique sur des souris euthanasiés aide le chirurgien apprendre où placer l'incision initiale et exposer la nervure souhaitée à réséquer. Travailler sur des cadavres améliore également les motricité fine requises pour supprimer la partie thoracique avec ou sans le périoste. En outre, quelqu'un de nouveau à cette procédure pourrait trouver manipuler les outils et fines sutu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium sized micro-dissection scissors (Vannas-Tübingen Spring Scissors 5 mm)	Fine Science Tools	15003-08
Fine micro-dissection scissors (Vannas Spring Scissors - 2mm Cutting Edge)	Fine Science Tools	15000-04	curved tip is beneficial
Micro-scalpel 5.0 mm	Fine Science Tools	10315-12	other fine scalpels can be substituted
Dumont 55 forceps	Fine Science Tools	11295-51
Retractor	Fine Science Tools	17004-05	adjustability is convenient
Micro-needle holders	Fine Science Tools	12060-01
9.0 nylon sutures (Ethilon), taper point best	Ethicon	2819G or similar	taper point best but reverse cutting is also good
7.0 prolene sutures (Prolene)	Ethicon	8700H or similar	6-0 can be used too, needle point can vary
Large forceps (Adson Forceps)	Fine Science Tools	11006-12	other brands are fine
Lubricant Eye Ointment (Akwa Tears)	Akorn	17478-062-35
Suture glue (GLUture Topical Tissue Adhesive)	Abbot	32046-01	has excellent working time
Shaver	Wahl	9918-6171 or similar
Clamp lamp	Zoo Med	LF-5
Infrared Bulb, 75W	Zoo Med	RS-75
RC2 Rodent Anesthesia System	VetEquip	922100
IsoFlo (Isoflurane)	Abbot	05260-05
Buprenorphine (Buprenex)	Reckitt Benckiser	12496-0757-1
Betadine	Purdue Frederick	67618015017
Flavored Gelatin, raspberry	Jell-O	B000E1FYL0	made up firm, to the consistency of 'jigglers'