Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Résumé

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.

Résumé

Les deux régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle ont un impact profond sur l'expression des gènes. Cependant, des essais de criblage à base de cellules couramment adoptées se concentrent sur la régulation transcriptionnelle, étant essentiellement destinées à l'identification de molécules de promoteur-ciblage. En conséquence, des mécanismes post-transcriptionnels sont en grande partie non couvert par l'expression du gène cible de développement de médicaments. Nous décrivons ici un essai à base de cellules visant à étudier le rôle de «région non traduite (3 'UTR 3) dans la modulation du sort de son ARNm, et à identifier des composés capables de le modifier. Le dosage est basé sur l'utilisation d'une construction de rapporteur luciférase contenant la 3 'UTR d'un gène d'intérêt intégré de façon stable dans une lignée cellulaire maladie pertinent. Le protocole est divisé en deux parties, avec l'accent initial sur le dépistage primaire visant à l'identification de molécules affectant l'activité de la luciférase après 24 h de traitement. La seconde partie du protocoledécrit la contre-criblage nécessaire de discriminer composés modulant l'activité de luciférase en particulier par la UTR 3 '. En plus du protocole détaillé et des résultats représentatifs, nous fournissons des considérations importantes sur le développement de l'essai et la validation du tube (s) sur la cible endogène. Le dosage du gène rapporteur décrit à base de cellules permettra aux scientifiques d'identifier des molécules modulant les taux de protéines par des mécanismes post-transcriptionnel dépendant d'un 'UTR 3.

Introduction

Pendant une longue période régulation transcriptionnelle de l'expression génique a été pensé pour jouer un rôle majeur si ce ne est le rôle exclusif dans le contrôle de la production de protéines. L'accumulation de preuves, cependant, indique que régulation post-transcriptionnelle contribue autant, sinon plus, que, la régulation transcriptionnelle de déterminer protéine cellulaire abondance ^1,2. Contrôle post-transcriptionnelle de l'expression génique est beaucoup plus complexe et élaborée que fut d'abord pensée. En fait, toutes les différentes étapes de contrôle post-transcriptionnel ont émergé pour être réglementés, y compris le traitement de l'ARNm, la localisation, le chiffre d'affaires, la traduction ³ ainsi que l'ARN réversible méthylation ⁴ nouvellement décrit. De nombreux processus de régulation post-transcriptionnels potentiellement affectés, le dosage décrit ci-dessous se concentre sur celles impliquant 'non traduite (3' UTR de l'ARNm 3). 3 'UTR affecte globalement ARNm sort principalement par interaction spécifique de pr liaison à l'ARNoteins et ARN non-codants à ses séquences régulatrices et / ou structures secondaires ^5. Par conséquent, de petites molécules qui modifient ces interactions ou interfèrent avec en amont des voies de transduction du signal se déplacera l'équilibre qui régit abondance des protéines. Cette approche thérapeutique est d'une importance particulière pour les pathologies humaines pour lesquelles la preuve existe montrant que des gènes de maladies pertinents sont soumis à régulation post-transcriptionnelle, qui représente ainsi une cible potentielle pour une intervention pharmacologique. Par conséquent, les systèmes permettant le dépistage des modulateurs de niveaux d'ARNm par interférence avec les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel dans un format à haut débit peuvent devenir des outils précieux dans l'identification de nouveaux traitements potentiels.

Le dosage de gène rapporteur à base de cellules décrit permet l'identification de composés capables de moduler l'ARNm sort par des mécanismes dépendant de son extrémité 3 'UTR. Il se compose de plusieurs c principaleomposantes (Figure 1) et nécessite quelques étapes préliminaires pour valider la faisabilité de l'essai. Tout d'abord, la construction de rapporteur est conçu pour inclure l'UTR en 3 'd'un gène d'intérêt. La 3 'UTR est fusionnée à l'extrémité d'un gène rapporteur tel que la luciférase de luciole (figure 1). Tout changement dans les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel exercées par la inséré 3 'UTR vont modifier la stabilité et / ou l'efficacité de traduction de ce transcrit chimérique, résultant en des niveaux de luciférase variés. Par conséquent, des changements dans l'activité de luciférase servent comme mesure indirecte de la régulation post-transcriptionnelle affectée du gène d'intérêt. Le deuxième composant du système est une construction rapporteur témoin, un plasmide d'expression qui exprime identique le même gène rapporteur, mais ne contient pas de 3 'UTR. Les deux plasmides rapporteurs peuvent être conçus dans le laboratoire en utilisant les protocoles classiques de biologie moléculaire ou achetés auprès de sources commerciales.

La sélection d'une lignée cellulaire appropriée est essentielle pour la construction de dosage. Quelle ligne de cellule est le modèle optimal dépend de nombreux facteurs, allant des exigences cliniques comme ressemblance maximale à la pathologie à des questions pratiques comme juste caractéristiques disponibilité, transfectabilité, et de croissance. Il est important, avant de procéder il faut se assurer que la fusion des 3 'UTR du gène rapporteur a un effet attendu sur le niveau de la transcription chimérique. L'absence de différence significative dans le signal de la luciférase à partir de la 3 'UTR-palier et le contrôle constructions rapporteurs transfecté de manière transitoire dans les cellules sélectionnées indiquerait que la 3' UTR ne est pas fonctionnelle dans ce modèle cellulaire, ce qui incite à rechercher d'autres possibles. Pour le format à haut débit, les 3 'UTR-porteurs et de contrôle luciférase constructions rapporteurs devraient être intégrés de manière stable dans la lignée cellulaire choisie. Utilisation d'un intégré de manière stable sur transitoirement transfectéeslignée cellulaire est préférable pour plusieurs raisons. Cela élargira le choix d'un modèle cellulaire incluant des lignées cellulaires difficiles à transfecter, diminuer la variabilité dans les données découlant des fluctuations de l'efficacité de transfection, calmer les coûts. En outre, sur les cellules de transfection transitoire sont très souvent surchargé avec un plasmide d'ADN qui conduit à la saturation du système. Dans ces paramètres une nouvelle augmentation de l'expression de journaliste peut être difficile, entraînant une diminution de sensibilité à l'égard des composés de régulation positive potentiels.

Enfin, lorsque tous les composants d'analyse sont mis en place, il est essentiel avant de passer au format à haut débit afin de déterminer la faisabilité de l'essai, ce est à dire, si l'activité luciférase peut être fait en amont et en réglementation spécifique via le inséré 3 ' UTR. Les meilleurs contrôles seraient rapportés de petites molécules pour moduler la stabilité de l'ARNm ou traduisibilité par UTR en 3 'd'intérêt. Si ceux-ci est ayantpas possible, les contrôles de substitution imitant l'effet désiré sont acceptées. Il peut se agir miARN ou des protéines liant l'ARN connus pour exercer leurs effets en se liant à la 3 'UTR de l'intérêt. L'évaluation de ces contrôles avant la projection primaire indique non seulement la fonctionnalité de l'essai développé, mais permet également à l'estimation de sa gamme dynamique, la sensibilité et la performance dans le format à haut débit.

En utilisant le protocole décrit nous avons criblé une bibliothèque composé ^6-2000. Neuroblastome, la tumeur solide extra plus courante de l'enfance, a été utilisé comme un modèle biologique et 3 'UTR de l'oncogène MYCN, dont l'amplification prédit fortement issue défavorable du neuroblastome, comme un gène cible ^7. La figure 2 présente les dispositif expérimental. La projection a été divisée en trois courses avec la taille du lot de 27 plaques projetés en une seule fois. Le lot de 27 plaques inclus bibliothèque Spectrum Collectionplaques n.1-n.8 + n.25 (première manche), n.9-n.16 + n.25 (deuxième manche) et n.16-n.24 + n.25 (troisième terme), chaque plaque projeté en trois exemplaires. Ainsi, une plaque de la bibliothèque (n.25) a été dosé dans les trois courses rendant possible la comparaison inter-terme. Le protocole ci-dessous décrit une seule série de neuf plaques de bibliothèque testés en triple exemplaire.

Protocole

NOTE: Le débit de ces systèmes de dosage dépend de l'équipement de laboratoire HTS disponibles. Ce protocole est facilitée par une EVO 200 robots Tecan Freedom, qui effectue la manipulation de liquides en format 96 puits. Miniaturisation au format 384 puits est également possible. Le système de manipulation de liquide robotisé est positionné sous une hotte à flux laminaire afin de maintenir des conditions aseptiques au cours de toutes les mesures expérimentales. Si aucune automatisation de liquide de traitement est disponible, le protocole peut être facilement adapté au format à faible débit.

Dépistage primaire

1. Jour 1: Préparer et cellules de semences

REMARQUE: Les cellules de semences à un rendement de 80% de confluence au moment de dosage de l'activité de la luciférase, ce est à dire, 48 h après l'ensemencement.

1. Remettre en suspension les cellules de neuroblastome trypsinisées CHP134-mycn3UTR à une concentration de 2 x 10 ⁵ cellules / ml dans du milieu RPMI contenant 10% de FBS et 1% de L-glutamine. Pour 27 plaques préparer au moins 250 ml de suspension cellulaire en tenant manipulation de liquides de compte, rigoles volumes morts et les étapes de pipetage répétées. Verser la suspension cellulaire dans le réservoir stérile et placez-le sur le bureau de robot.
2. Placez 9 à code-barres blanches plaques à 96 puits à fond plat et une boîte de 200 pi embouts de pipette stériles sur le bureau de robot. Mélanger la suspension de cellules par pipetage avant chaque étape de distribution pour éviter des cellules de décantation par gravité. Distribuer 75 pi de cellules dans chaque puits de plaques 9 pour obtenir une densité finale de 1,5 x 10 ⁴ cellules par puits.
3. Couvrir les plaques avec les couvercles et les laisser à l'extérieur de l'incubateur pendant 30 minutes pour permettre aux cellules de sédimenter au fond du puits. Ceci permet de minimiser les effets de bord.
4. Répétez les étapes 1.2 et 1.3 à deux reprises afin de préparer un nombre total de 27 plaques.
5. Placer les plaques à 37 ° C et 5% de CO ₂ et incuber pendant 24 heures.

2. Jour 2: traiter les cellules avec des composés Bibliothèque

MÉNAGEMENT "> Remarque: La petite bibliothèque de molécules de spectre Collection consiste en 2000 composés disposées en 8 rangées et 10 colonnes de 25 plaques à 96 puits à la concentration de 10 mM dans le DMSO Les puits sur les première et dernière colonnes sont laissés vides pour les contrôles. . essais de criblage de composés sont généralement effectuées à 1-10 uM concentration du composé ^8. Le protocole de dépistage décrit ici fixe 2 uM que la concentration de travail et 24 heures que le point de fin de dosage.

1. Décongeler neuf plaques de bibliothèque composé à la température ambiante.
2. Préparer deux creux avec du PBS stérile et% des solutions de DMSO-0,5 PBS et placez-les sur le bureau de robot. Pour chaque plaque bibliothèque, préparer et marquer en conséquence une plaque de dilution - d'un polypropylène de plaque à 96 puits à fond en U avec un volume de travail d'au moins 400 ul. Remplir chaque puits de colonnes 2-11 de plaques de dilution avec 398 pi de PBS stérile en utilisant les conseils fixes du gestionnaire liquide. Remplir les colonnes 1 et 12 avec 50 pi de PBS stérileavec 0,5% de DMSO de façon à reproduire la concentration en véhicule dans les puits témoins (0,02%).
3. Placez deux plaques bibliothèque, les plaques de dilution étiquetés en conséquence, deux boîtes de 50 ul embouts de pipette stérile et six cellules plaques sur le bureau de robot. Découvrez cellules plaques.
4. Pipet 2 ul de la solution mère 10 mM de l'une des deux plaques de la bibliothèque dans la plaque de dilution correspondant et bien mélanger. Cela se traduira par une concentration des composés intermédiaires de 50 uM. En utilisant la même série de conseils, passer 3 pi de la dilution de 50 uM dans 3 plaques à 96 puits avec des cellules blanches à code-barres. Cette dilution des résultats du régime en deux uM concentration de chaque composé testé de travail.
   REMARQUE: Pour éviter les manipulations inutiles avec les conseils, utilisez un ensemble complet de 96 conseils dès le début, même si les plaques de la bibliothèque ne contiennent que 80 composés. Ceci est possible car la première et la dernière colonne des plaques de bibliothèques sont vides.
5. Remplacez les embouts de pipette et répéter Step 2,4 pour la deuxième plaque de bibliothèque.
6. Couvrir les plaques de cellules et de les retourner à l'incubateur pendant 24 heures.
7. Répéter les étapes 2.3 à 2.6 plus deux fois pour les plaques de bibliothèque restantes.

3. Jour 3: Effectuez Luciferase Assay

REMARQUE: Avant d'effectuer le dosage de la luciférase, il est possible de multiplexer avec un dosage de viabilité cellulaire basé sur la réduction de la résazurine pour obtenir un indice de la viabilité des cellules de chaque puits ^9. Multiplexage luciférase et test de viabilité résultats d'analyses dans une réduction de signal de la luciférase qui, cependant, peut être ignoré si les cellules fournissent de haut niveau de l'activité luciférase assez. L'activité luciférase peut être détectée par une variété de réactifs de dosage de luciférase ^10,11 commerciales et artisanales avec signal luminescent stable.

1. Équilibrer le réactif de luciférase de choix reconstitué à température ambiante. Assurez-vous que le volume est suffisant pour toutes les plaques dosées. Pour 27 plaques 170 ml de réactif de luciférase devront tenant manipulation de liquide de compte, auges volume mort et des étapes répétées de pipetage. Verser le réactif de luciférase dans un réservoir et placez-le sur le bureau de robot.
2. Retirer neuf plaques avec des cellules de l'incubateur, placez-les sur le bureau de robot, découvrir et attendre équilibrée à la température ambiante. Ajouter 50 ul du réactif de luciférase par plaque et par la plaque. Entre les plaques, introduire un retard égal au temps de lecture de la luminescence une plaque. Ceci garantit que toutes les plaques sont mesurées à l'intérieur de l'intervalle de temps égal à partir de l'addition des réactifs.
3. Après une incubation de 30 min, placer la première plaque dans le luminomètre et mesurer la luminescence après une brève étape secouant. Répétez l'opération pour toutes les plaques. Enregistrer le code-barres de chaque plaque et l'associer au fichier de données correspondant pour éviter les erreurs résultant d'un grand nombre de plaques traitées.
4. Répétez les étapes 3.2 à 3.3 deux fois pour les 18 autres plaques avec des cellules.
5. Recueillir le réactif de luciférase restant et le stocker à -20 ° C.

4. Jour 4: Analyse des données

1. Processus données expérimentales en utilisant la normalisation de tous les échantillons à la moyenne des contrôles sur plaque traités avec le véhicule. Pour chaque composé bibliothèque, calculer la valeur moyenne de x et SD sur triple.
2. Sélectionnez jusqu'à-régulation et la régulation négative de résultats en fixant un seuil de X ± k × SD, où le X de valeur moyenne et SD sont calculés sur toutes les valeurs d'essai transformé, et k est une constante définie.
3. Sélectionnez un seuil arbitraire de coupure <20% des témoins traités avec le véhicule quand une réduction de signal de la luciférase est probablement associée à la toxicité de composé. Jeter les résultats ci-dessous de ce seuil permettra de réduire considérablement un certain nombre de hits faux-positifs dans le contre-dépistage.
   REMARQUE: Au lieu de normalisation axée sur le contrôle, les données expérimentales peuvent être traitées application score Z ou son analogue robuste B snoyau ^12. En outre, les approches statistiques alternatives pour la sélection de succès sont disponibles ^12.

5. Contre-dépistage

NOTE: Les composés identifiés dans l'écran primaire (étiquetés «hits») sont confirmées et évalués pour la spécificité par une contre-dépistage.

1. Cerise choisir les résultats sélectionnés des aliquotes stockées dans des tubes à code-barres 2D simples et créer de nouveaux "a frappé plaques", sauvant la mise en page correspondante. Ne oubliez pas de laisser positions libres pour les contrôles.
   NOTE: En l'absence d'un système picorage efficace, on pourrait tester à la fois le contrôle et la 3 'UTR cellules porteuses en parallèle dans le dépistage primaire. Dans ce cas, la sélection spécifique de composés ayant des effets sur la charge seulement introduit 3 'UTR sera possible après la projection primaire qui élimine la nécessité de contre-dépistage. Cependant, la projection parallèle dans deux lignées cellulaires doublera le dosagecoûts.
2. En suivant le protocole pour le dépistage primaire (section "Jour 1: Préparer et cellules de semences»), pour chaque «plaque hit" préparer trois plaques à 96 puits de chaque cellules stables CHP134-mycn3UTR et CHP134-CTRL.
3. En suivant le protocole pour le dépistage primaire (section «Jour 2: traiter les cellules avec Bibliothèque composés"), utiliser chaque plaque de succès pour traiter trois CHP134-mycn3UTR et trois plaques CHP134-CTRL à 2 uM concentration de travail.
   NOTA: L'écran du compteur décrit ici est réalisée en triple à la dose unique de 2 uM, il pourrait être avantageux de remplacer les répétitions standard et tester les résultats dans trois concentrations aussi des dilutions de 10 fois allant de 2 pM à 20 nM. L'application de cette approche permettrait non seulement de confirmer les données de l'écran primaire, mais aussi d'obtenir des données préliminaires dose-réponse sur les résultats primaires, en minimisant les taux de faux-positifs. Dans ce cas, un pipeline d'analyse différente doit être applied pour traiter les données expérimentales et confirmer les résultats.
4. En suivant le protocole pour le dépistage primaire (section «Jour 3: Effectuez Luciferase Assay"), mesurer l'activité de la luciférase dans toutes les plaques CHP134-mycn3UTR et CHP134-CTRL.
5. En suivant le protocole pour le dépistage primaire (section «Jour 4: Analyse des données"), normaliser les données expérimentales de puits traités à la moyenne des sur-plaque contrôles traités avec le véhicule et calculer la moyenne et l'écart par rapport aux répétitions. Pour chaque composé testé, calculer le facteur de variation de l'activité luciférase dans CHP134-mycn3UTR vs cellules CHP134-CTRL. Sélectionnez arbitraire changement fois les seuils de> 1,5 et la signification des valeurs p de <0,01.
   NOTE: Dans les paramètres de dosage décrites le paramètre déterminant pour la spécificité de succès est un facteur de variation significative de l'activité luciférase dans CHP134-mycn3UTR vs cellules CHP134-CTRL. Si nécessaire, on peut également évaluer la toxicité composé en effectuant en même temps un test de viabilité cellulaire sur la SEcomposés tionné. Cela pourrait être particulièrement bénéfique si les résultats primaires sont contre-examinés dans une analyse dose-réponse. Pour une dose unique, notre expérience indique une forte corrélation de l'activité luciférase réduite à une diminution de la viabilité des cellules ^6. Par conséquent, une diminution de l'activité luciférase dans les cellules cibles ainsi que des cellules de commande peut être considérée comme un indicateur de la toxicité du composé à la concentration testée.

Résultats

En utilisant l'approche décrite, nous avons criblé une bibliothèque 2000 composé de modulateurs potentiels de mécanismes de contrôle post-transcriptionnel exercée par la 3 'UTR du gène N-MYC. La figure 3 illustre les résultats de l'examen initial illustré par une plaque seule bibliothèque. signal de la luciférase affichée en pourcentage des contrôles traités avec le véhicule a été obtenu par mesure de l'activité luciférase dans des plaques en triple des cellu...

Discussion

This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.

The identification of primary hits is based ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture plate 96-well White	PerkinElmer	6005688
StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)	PerkinElmer	6008190
100 ml disposable trough for reagents	Tecan	10 613 048
300 ml disposable robotic reservoir	VWR	PB12001301
Robot tips DITI 50 μl Sterile	Tecan	30038607
Robot tips DITI 200 μl Sterile	Tecan	30038617
Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes	Thermo Scientific	3711
ONE-Glo Luciferase Assay System	Promega	E6120
RPMI	Lonza	BE12-918F
PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17-516F
L-Glutamine 200 mM	Lonza	BE17-605E
FBS	Lonza	DE14-801F
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
The Spectrum collection (compound library)	MicroSource Discovery Systems	N/A
Tecan Freedom EVO200 robot	Tecan	N/A
Tecan F200 multiplate reader	Tecan	N/A