후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

요약

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3’ UTR.

초록

전사와 전사 후 조절은 모두 유전자 발현에 지대한 영향을 미친다. 그러나, 일반적으로 채택 세포 기반 스크리닝 분석은 본질적으로 프로모터 대상 분자의 식별을 목표로하고, 전사 조절에 초점을 맞 춥니 다. 그 결과, 전사 후 기전은 주로 유전자 발현 표적 약물 개발에 의해 발견된다. 여기에서 우리는 그것을 수정할 수 화합물을 식별하는 자사의 mRNA의 운명의 변조의 3 '번역 영역 (3'UTR)의 역할을 조사하기위한 셀 기반 분석을 설명합니다. 분석은 안정 질병 관련 세포주에 통합 관심 유전자의 3 'UTR을 포함하는 루시퍼 라제 리포터 구조물의 사용에 기초한다. 프로토콜은 치료 후 24 시간 후 루시퍼 라제 활성에 영향을 미치는 분자 식별 목적 일차 스크리닝에서 초기 포커스로, 두 부분으로 분할된다. 프로토콜의 두 번째 부분설명 카운터 선별 특히 3 'UTR을 통해 루시퍼 라제 활성을 조절 화합물을 구별 할 필요가있다. 프로토콜 상세 및 대표적인 결과 외에, 우리는 분석법 개발 및 내인성 표적에 적중 (들)의 유효성에 대한 중요한 고려 사항을 제공한다. 셀 기반 기술 된 리포터 유전자 분석법 과학자 3 'UTR에 종속 전사 후 기전을 통해 단백질 수준을 조절 분자를 식별 할 수 있도록 할 것이다.

서문

유전자 발현의 장기간 전사 조절에 단백질 생산을 조절 배타적이지 않은 경우 중요한 역할을 담당하는 것으로 생각 하였다. 축적 된 증거 그러나, 전사 후 조절은 세포 단백질 풍부 ^1,2-를 결정하는만큼, 그렇지 않은 경우, 전사 조절 이상 기여 것을 나타낸다. 유전자 발현의 전사 후 제어는 제 생각에보다 훨씬 더 복잡하고 정교하다. 사실, 전사 후 제어 모든 다양한 단계는 mRNA의 프로세싱, 지역화, 회전율, 번역 ^3뿐만 아니라 새롭게 기재된 가역적 RNA 메틸화 ⁴ 포함한 조절되는 것으로 나왔다. 전사 후 조절 프로세스의 개수가 영향을받을 가능성에서, 분석은 후술 mRNA의 3 '비 번역 영역 (3'UTR)을 포함하는 것들에 집중한다. 3 'UTR는 크게 RNA 결합 홍보의 특정 상호 작용을 통해 주로 mRNA의 운명에 영향을 미칩니다규제 시퀀스 및 / 또는 보조 구조 ⁵ oteins 및 비 코딩 RNA를. 따라서, 이러한 상호 작용을 변경하거나 업스트림 신호 전달 경로를 방해 소분자 단백질 존재 량을 조절하는 밸런스를 이동한다. 이 치료 방법은있는 증거가 질병 관련 유전자를 따라서 약물 학적 개입의 대상이 될 가능성을 나타내는 전사 후 조절,을 실시한다 보여주는 존재하는 인간의 병리 특히 중요하다. 따라서, 높은 처리량 형식의 전사 후 조절 기전과의 간섭을 통해 mRNA 수준 '조절제의 스크리닝을 가능 시스템은 잠재적 인 신규 한 치료의 확인에 유용한 도구가 될 수있다.

셀 기반 기술 된 리포터 유전자 분석법은 3 'UTR에 의존 기전을 통해 mRNA의 운명을 조절 할 화합물의 식별을 허용한다. 그것은 몇 가지 주요한 C로 구성omponents (그림 1)과 몇 가지 예비 단계를 필요는 분석의 타당성을 검증합니다. 우선, 리포터 구조물은 관심 유전자의 3 'UTR을 포함하도록 설계된다. 3 'UTR은 개똥 벌레 루시퍼 라제 (도 1)와 같은 리포터 유전자의 말단에 융합된다. 삽입 된 3 'UTR을 발휘 전사 후 조절 메커니즘의 변경은 다양한 루시 페라 수준의 결과,이 키메라 성적 증명서의 안정성 및 / 또는 번역 효율을 변경합니다. 따라서, 루시 페라 제 활동의 변화는 관심의 유전자의 영향을받는 전사 후 조절의 간접 측정을 제공합니다. 시스템의 제 2 성분 제어 리포터 구조체 같은 리포터 유전자를 발현하지만 임의 3 'UTR을 포함하지 않는 동일한 발현 플라스미드이다. 두 개의 리포터 플라스미드는 종래의 분자 생물학 프로토콜을 사용하여 실험실에서 설계 또는 시판 처로부터 구입할 수있다.

적절한 세포주의 선택은 구조 분석에 중요하다. 어떤 세포주가 최적의 모델입니다 가용성, transfectability, 성장 특성 같은 단지 실제적인 문제에 대한 병리 최대 유사 같은 임상 적 요구 사항에 이르기까지 수많은 요인에 따라 달라집니다. 중요한 것은, 이전에 하나의 리포터 유전자 3 'UTR의 융합 키메라 성적의 수준에 예상되는 효과가 있는지 확인해야합니다 진행합니다. 3에서 루시 페라 제 신호에 유의 한 차이가 없으면 다른 사람의 검색하라는 메시지 UTR이 세포 모델에서 작동하지 않습니다 'UTR 베어링 및 제어 기자가 일시적으로 (3)가 있음을 나타냅니다 선택한 셀에 형질 구축'. 고 스루풋 포맷의 경우, 3 'UTR 베어링 및 제어 루시퍼 라제 리포터 구조물을 안정적으로 선택된 세포주에 통합되어야한다. 사용하여 안정적으로 일시적를 통해 통합 된 형질 전환세포계는 여러 가지 이유로 바람직하다. 이것은 비용을 가시고, 형질 전환 효율의 변동으로부터 발생하는 데이터의 변동을 감소 어려운 트랜 세포주를 포함한 셀룰러 모델의 선택 범위를 확장 할 것이다. 또한, 일시적인 형질 세포에 매우 자주 시스템의 포화에 이르는 DNA 플라스미드 오버로드됩니다. 이러한 설정에서 기자 발현의 추가 증가는 잠재적 인 상승 조절 화합물으로 감소 감도의 결과, 문제가 될 수 있습니다.

모든 분석 성분을 설정할 때 루시퍼 라제 활성이 참으로 상향 및 하향 조절 3 '삽입을 통해 구체적으로 될 수있는 경우 마지막으로, 그것은 분석, 즉의 타당성을 결정하기 위해 고 스루풋 포맷으로 이동하기 전에 중요 UTR. 가장 관심 컨트롤 3 'UTR을 통해 mRNA의 안정성 또는 번역 능력을 조절하는 것으로보고 소분자 것이다. 이러한를 갖는 경우가능하지, 원하는 효과를 모방 대리 컨트롤이 허용됩니다. 이러한 miRNA가 또는 관심의 3 'UTR에 결합을 통해 그 효과를 발휘하는 것으로 알려져 RNA 결합 단백질이 될 수 있습니다. 이러한 제어 평가 일차 스크리닝 분석법 개발의 기능을 나타내고, 또한 높은 스루풋 포맷의 동적 범위, 감도 및 성능 추정을 허용하지 전에 만.

설명 프로토콜을 사용하여 우리는 2,000 화합물 라이브러리 ⁽⁶⁾ 상영. 신경 모세포종, 유아기의 가장 흔한 두개 외 고형 종양은 생물학적 모델로서 사용하고, 증폭 MYCN 종양 유전자의 3 'UTR 강하게 표적 ^{유전자는 7} 아세포종의 불리한 결과를 예측한다. (2) 실험 레이아웃을 설명도. 심사는 하나의 실행에서 상영 27 판의 배치 크기로 3 실점으로 분할되었다. 27 판의 배치는 스펙트럼 컬렉션 라이브러리를 포함플레이트 N.1 - n.8 + n.25 (첫 번째 실행), n.9-n.16 + n.25 (두 번째 실행)과 n.16 - n.24 + n.25 (제 3 군), 각 판은 세중에서 상영. 따라서, 하나의 라이브러리 판 (n.25)이 가능한 간 실행 비교를 세 가지 실행 내에서 측정 하였다. 이 프로토콜은 아래 중으로 시험 9 라이브러리 판의 단일 실행에 대해 설명합니다.

프로토콜

참고 : 이러한 분석 시스템의 처리량이 가능한 HTS 실험실 장비에 따라 달라집니다. 이 프로토콜은 96- 웰 포맷으로 액체 취급을 수행 테칸 프리덤 EVO 로봇 (200)에 의해 용이하게된다. 384- 웰 포맷 소형화도 가능하다. 로봇 액체 핸들링 시스템은 모든 실험 단계에서 무균 상태를 유지하기 위해 층류 후드 아래에 배치된다. 어떤 자동화 액체 처리가 없다면, 프로토콜 용이 낮은 스루풋 포맷으로 구성 될 수있다.

기본 검사

1. 1 일 : 준비 및 종자 세포

주 : 종자 세포는 루시퍼 라제 활성, 즉 시드 후, 48 시간을 분석시 80 % 합류를 얻었다.

1. 재현 탁 10 % FBS, 1 % L- 글루타민을 함유하는 RPMI에서 2 × ¹⁰⁵ 세포 / ml의 농도로 CHP134-mycn3UTR 신경 아세포종 세포를 트립신 처리. 27 판은 적어도 250 ml의 준비 계정 액 처리 고려 세포 현탁액, 데드 볼륨 반복 피펫 팅 단계를 쓰루. 멸균 저수지에 세포 현탁액을 붓고 로봇 책상에 놓습니다.
2. 9 바코드 흰색 평면 바닥 96 웰 플레이트 및 로봇 책상에 200 ㎕를 멸균 피펫 팁 상자를 놓습니다. 중력 침강 세포를 피하기 위해 각각의 불출 단계 이전 피펫 팅 세포 현탁액을 혼합한다. 웰 당 1.5 × ¹⁰⁴ 세포의 최종 농도를 얻기 위해 9 플레이트의 각 웰에 세포를 75 μL 분주.
3. 뚜껑 판을 덮고 세포가 우물의 바닥에 침전 수 있도록 30 분 동안 인큐베이터 이외의 장소에 둡니다. 이 가장자리의 영향을 최소화 할 것이다.
4. 반복 판 (27)의 총 개수를 준비하기 위해 1.2 배 및 1.3 단계.
5. 37 ° C에서 접시를 놓고 5 % CO _2, 24 시간 동안 배양한다.

2. 제 2 일 : 도서관 화합물과 세포 치료

ntent "> 참고 : 스펙트럼 컬렉션 작은 분자 라이브러리 DMSO 10 mM의 농도에서 25 96 웰 플레이트에서 8 행 10 열로 정렬 2,000 화합물로 구성되어 첫 번째와 마지막 열에 우물 컨트롤 비어 있습니다. . 화합물 스크리닝 분석은 일반적으로 1-10 μM 화합물 농도 ^(8)에서 수행됩니다. 여기에 설명 된 검사 프로토콜은 작업 농도가 2 μM 및 분석 엔드 포인트로 24 시간을 해결합니다.

1. 실온에서 9 화합물 라이브러리 플레이트를 해동.
2. 멸균 PBS와 PBS-0.5 % DMSO 솔루션 두 골짜기를 준비하고 로봇 책상에 배치합니다. 각 라이브러리 플레이트를 들어, 준비하고 그에 따라 하나의 희석 판 레이블 - 적어도 400 μL의 작업 양을 가진 폴리 프로필렌 U-바닥 96 웰 플레이트를. 액체 핸들러의 고정 된 정보를 사용하여 멸균 PBS 398 ㎕를 희석 판 (11)에 열 2의 각 웰을 입력합니다. 입력 열 1 멸균 PBS의 12 50 μL대조군 웰의 농도 비히클 (0.02 %)를 재생하기 위해서는 0.5 % DMSO로.
3. 두 라이브러리 판, 대응 표시된 희석 판, 50 ㎕를 멸균 피펫 팁의 두 상자와 로봇 책상에 여섯 세포 판을 놓습니다. 세포 판을 폭로.
4. 피펫이 해당 희석 플레이트에서 두 개의 라이브러리 판 중 하나에서 10 mM의 주식 솔루션의 μL 잘 섞는다. 이 50 μM의 중간 화합물 농도가 발생합니다. 팁의 동일한 세트를 사용하여, 셀 3 바코드 백색 96- 웰 플레이트에서 50 μM 희석액 3 μL 분주. 각각의 농도를 작동하는 2 μM에서이 희석 방식 결과는 화합물을 테스트했다.
   참고 : 끝으로 불필요한 조작을 방지 라이브러리 판은 80 화합물을 포함하더라도, 처음부터 (96) 팁의 전체 세트를 사용합니다. 제 라이브러리 플레이트의 마지막 칼럼이 비어 있기 때문에 이것이 가능하다.
5. 피펫 팁을 교체하고 세인트 반복두 번째 라이브러리 플레이트 EP 2.4.
6. 세포 판을 덮고 24 시간 동안 인큐베이터에 반환.
7. 반복 나머지 라이브러리 판에 대한 2.3-2.6 두 번 더 단계를 반복합니다.

3. 주 3 : 루시퍼 라제 분석을 수행

주 : 루시퍼 라제 분석을 수행하기 전에, 각각의 웰 ^(9)로부터 세포 생존 지수를 얻기 위해 레사 주린 감소에 기초하여 세포 생존율 분석법로 다중화 할 수있다. 다중화 루시페라아제 및 생존 분석 세포는 루시퍼 라제 활성을 충분히 높은 수준을 제공하는 경우, 그러나, 무시 될 수 있다는 루시퍼 신호의 감소 분석 결과. 루시퍼 라제 활성은 안정한 발광 신호 상업 및 제 ^10,11 루시퍼 라제 분석 시약의 종류에 의해 검출 될 수있다.

1. 실온으로 선택 재구성 루시퍼 라제 시약을 평형. 볼륨이 모든 정량하여 플레이트 충분히 있는지 확인합니다. 27 판의 경우루시 페라 제 시약의 170 ml의 계정 액체 처리에 복용해야합니다, 죽은 볼륨과 반복 피펫 팅 단계를 쓰루. 저수지에 루시퍼 라제 시약을 붓고 로봇 책상에 놓습니다.
2. 인큐베이터에서 세포와 9 판을 제거 로봇 책상에 배치, 발견하고 실온으로 평형을 때까지 기다립니다. 판에 의해 웰 플레이트 당 루시퍼 라제 시약의 5​​0 μl를 추가합니다. 플레이트 사이에, 하나의 플레이트 발광 판독 시간과 동일한 지연을 도입. 이것은 모든 플레이트 시약 첨가로부터 동일한 시간 내에 측정되는 것을 보장한다.
3. 30 분 인큐베이션 후에, 루미에서 제 1 플레이트를 배치하고 간단히 진탕 공정 후에 발광을 측정한다. 모든 판을 반복합니다. 각 플레이트의 바코드를 기록하고 처리 판에서 발생하는 다수의 실수를 방지하기 위해 대응하는 데이터 파일에 연관.
4. 반복 세포와 나머지 18 판 두 번 3.2-3.3 단계를 반복합니다.
5. 나머지 루시 페라 제 시약을 수집하고 -20 ° C에서 보관합니다.

4. 주 4 : 데이터 분석

1. 에 판 차량 처리 컨트롤의 평균에 모든 샘플의 정상화를 사용하여 프로세스 실험 데이터. 각 라이브러리 화합물, 삼중 위에 평균값 X 및 SD를 계산.
2. 선택 조절 - 위 아래로 조절 평균 값 x와 SD는 모든 분석 처리 값에 대해 계산되는 SD, 및 K × K ± X의 임계 값을 설정하여 안타를 정의 상수이다.
3. 임의의 임계 컷오프 <루시퍼 신호의 감소는 아마도 화합물 독성과 연관된 차량 제어 처리의 20 %를 선택한다. 이 임계 값 아래 안타를 폐기하는 것은 크게 반대 검사에서 위양성 히트 수를 줄일 수 있습니다.
   참고 : 대신 제어 기반의 정상화, 실험 데이터는 Z 점수 또는 강력한 아날로그 B s을 (를) 적용 처리 할 수​​ 있습니다코어 ^(12). 또한, 히트 선택을위한 다른 통계 접근 방식은 ¹² 사용할 수 있습니다.

5. 카운터 검사

참고 : 기본 화면에서 확인 된 화합물을 확인하고 카운터 검사에 의한 특이성에 대한 평가 ( '히트'라는 레이블이 붙어 있음).

1. 체리는 해당 레이아웃을 저장, 단일 2D 바코드 튜브에 저장된 분량에서 선택한 안타를 선택하고 새로운 "판을 칠"만듭니다. 컨트롤에 대한 무료 위치를 떠날 것을 잊지 마십시오.
   주 : 효율적인 체리 픽킹 시스템의 부재에서 하나의 제어 및 일차 스크리닝 평행 3 'UTR - 내포 세포 모두를 테스트 할 수있다. 이 경우, 도입 된 3 'UTR에 의존 효과를 갖는 화합물의 특정 선택은 반대의 스크리닝 불필요 차 선별 후 가능할 것이다. 그러나, 두 개의 세포주에서 병렬 검사는 분석을 두 배로비용.
2. 차 선별을위한 프로토콜 (절 "1 일 : 준비 및 종자 세포")에 따라, 각각의 "히트 판"각 CHP134-mycn3UTR 및 CHP134-CTRL 안정적 세포의 세 96 웰 플레이트를 준비합니다.
3. 차 선별을위한 프로토콜 (절 "주 2 : 도서관 화합물과 세포 치료")에 따라, 농도를 작동하는 2 μM에서 세 CHP134-mycn3UTR 세 CHP134-CTRL 판을 치료하기 위해 각각의 히트 플레이트를 사용합니다.
   주 : 여기에서 설명 된 이의 화면이 μM의 단일 투여 량으로 3 회 반복 수행되는 동안, 그것은 표준 복제물 대체 2 μM 내지 20 nM의 범위의 10 배 희석 물로 3 농도 히트를 테스트하는 것이 유익 할 수도있다. 이 접근법을 적용하는 것은 단지 위양성 요금을 최소화 차 안타 예비 용량 - 반응 데이터를 획득하는 것도 기본 화면의 데이터를 확인하지만, 허용하지 않을 것이다. 이 경우, 서로 다른 파이프 라인 분석 애플리되어야에드 실험 데이터를 처리하고 안타를 확인합니다.
4. 차 선별을위한 프로토콜 (절 "주 3 : 루시퍼 라제 분석을 수행")에 따라, 모든 CHP134-mycn3UTR 및 CHP134-CTRL 판에서 루시 페라 제 활성을 측정합니다.
5. 차 선별을위한 프로토콜 (절 "주 4 : 데이터 분석") 다음에 판 차량 처리 컨트롤의 평균 처리 된 우물에서 실험 데이터를 정상화하고 반복 실험을 통해 평균과 SD를 계산합니다. 각 시험 화합물의 경우, CHP134-CTRL 세포 대 CHP134-mycn3UTR 루시퍼 라제 활동의 배의 변화를 계산한다. 임의의 배 변경 컷 - 오프> <0.01의 1.5 중요성 P-값을 선택합니다.
   참고 : 히트 특이성에 대한 결정 매개 변수가 CHP134-CTRL 세포 대 CHP134-mycn3UTR 루시퍼 라제 활동의 중요한 배의 변화 기술 분석 설정에서. 필요한 경우, 하나는 SE에서 동시에 세포 생존 분석을 수행하여 화합물의 독성을 평가할 수있다선택 된 화합물. 차 히트는 용량 반응 분석에서 카운터를 차단하는 경우에 특히 도움이 될 수 있습니다. 단일 투여를 들어, 우리의 경험은 ⁶ 세포 생존율이 감소하여 감소 된 루시퍼 라제 활성의 강한 상관 관계를 나타낸다. 따라서, 표적 세포뿐만 아니라 대조군 세포에서 루시퍼 라제 활성을 감소는 시험 농도에서 화합물 독성의 지표로 간주 될 수있다.

결과

설명 된 접근법을 사용하여, 우리는 MYCN 유전자의 3 'UTR 누두 전사 후 제어 메커니즘의 전위 조절제 위해 2,000 화합물 라이브러리를 스크리닝.도 3은 하나의 라이브러리 플레이트로 예시 일차 스크리닝의 결과를 도시도. 비히클 - 처리 된 콘트롤의 백분율로서 표시 루시페라아제 신호는 단일 라이브러리 플레이트 화합물로 처리-mycn3UTR CHP134 세포 중으로 판에 루시...

토론

This protocol describes a cell-based reporter-gene assay aiming at the identification of modulators that target 3’ UTR-dependent post-transcriptional processes. It encompasses the primary screening and the counter-screen and, if needed, can be accompanied by a cytotoxicity assay. The outcome of the primary screening is a number of valuable candidate compounds, whose reproducibility and specificity is further validated in the counter-screening.

The identification of primary hits is based ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture plate 96-well White	PerkinElmer	6005688
StorPlate 96-well U bottom (dilution plate)	PerkinElmer	6008190
100 ml disposable trough for reagents	Tecan	10 613 048
300 ml disposable robotic reservoir	VWR	PB12001301
Robot tips DITI 50 μl Sterile	Tecan	30038607
Robot tips DITI 200 μl Sterile	Tecan	30038617
Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes	Thermo Scientific	3711
ONE-Glo Luciferase Assay System	Promega	E6120
RPMI	Lonza	BE12-918F
PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17-516F
L-Glutamine 200 mM	Lonza	BE17-605E
FBS	Lonza	DE14-801F
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
The Spectrum collection (compound library)	MicroSource Discovery Systems	N/A
Tecan Freedom EVO200 robot	Tecan	N/A
Tecan F200 multiplate reader	Tecan	N/A