Visualisation des chondrocytes intercalation et directionnel prolifération clonale via Zebrabow analyse cellulaire dans le cartilage de l'embryonnaire Meckel

Résumé

L'organisation des cellules des os cranio-faciales a longtemps été supposé, mais jamais directement visualisées. Marquage des cellules multi-spectrale et en Live in vivo imagerie permet de visualiser le comportement des cellules dynamique dans la mâchoire inférieure du poisson zèbre. Ici, nous détaillons le protocole de manipuler Zebrabow poissons transgéniques et observons directement intercalation de cellules et les changements morphologiques des chondrocytes dans le cartilage de Meckel.

Résumé

Le développement des structures craniofaciales vertébrés exige une coordination précise de la migration cellulaire, la prolifération, l'adhérence et la différenciation. Modélisation du cartilage de Meckel, un premier pharyngée dérivé de voûte, implique la migration de la crête neurale crânienne (CNC) cellules et le cloisonnement progressif, la prolifération et l'organisation des chondrocytes différenciés. Plusieurs études ont décrit la migration CNC lors de la morphogenèse inférieure de la mâchoire, mais les détails de la façon dont les chondrocytes atteindre organisation dans la croissance et l'extension du cartilage de Meckel reste incertaine. Le SOX10 limitée et induite chimiquement recombinase Cre médiée par recombinaison génère des permutations des protéines fluorescentes distinctes (DP, YFP et CFP), en créant ainsi un marquage multi-spectrale de cellules souches et de leur descendance, ce qui reflète populations clonales distinctes. Utilisation confocale time-lapse photography, il est possible d'observer les chondrocytes behaviou au cours du développement du cartilage de Meckel le poisson zèbre.

Marquage cellulaire multispectrale permet aux scientifiques de démontrer extension des chondrocytes de Meckel. Pendant la phase d'extension du cartilage de Meckel, qui préfigure la mandibule, chondrocytes intercalent pour effectuer l'extension comme ils empilent dans une seule rangée de cellules en couches organisée. Échec de ce processus d'intercalation organisée à la médiation extension de cellules fournit l'explication mécanistique cellulaire pour mandibule hypoplasie que nous observons dans les malformations mandibulaires.

Introduction

Développement craniofaciale exige, les interactions cellulaires et tissulaires moléculaires complexes à conduire la prolifération cellulaire, migration et la différenciation ^{1,2, 3.} Ce processus étroitement régulé et complexe est soumis à des perturbations génétiques et environnementaux, tels que des malformations cranio-faciales sont parmi les malformations congénitales les plus courantes ^1-9. Bien que les interventions chirurgicales restent le pilier du traitement des anomalies crânio-faciales, la compréhension de la base de développement est essentiel d'innover futures thérapies. Par conséquent, l'étude de la morphogenèse et les mécanismes de la convergence et l'extension et l'intégration de cellules fournit de nouvelles indications sur la formation du squelette cranio-facial ^1.

Crânienne migration de la crête neurale et remplir le premier arc pharyngien, processus mandibulaires forment alors jumelés qui se prolongent pour former le cartilage de Meckel, qui préfigure la mandibule. Morphogenèse of cartilage de Meckel l'organisation nécessite prolifération des chondrocytes par directionnel, la polarisation et la différenciation cellulaires ^1,10. Cependant, la complexité de l'organisation des chondrocytes dans la croissance et l'extension du cartilage de Meckel reste incertaine. Comprendre le comportement dynamique de la cellule est essentielle pour comprendre les malformations congénitales affectant la taille mandibulaire, comme phénotypes mandibule hypoplasie ^11.

Embryons de poisson zèbre offrent de nombreux avantages développementaux et génétiques pour étude détaillée du cartilage de la morphogenèse de Meckel. Leur traçabilité génétique, la transparence, ex vivo et le développement rapide des avantages puissants de prêt bien pour l'observation du mouvement et de l'organisation cellulaire par l'imagerie en direct ^6. Utilisation des outils de la lignée de traçage, comme SOX10: lignée transgénique kaede, nous et d'autres avons délimité les origines de la crête neurale du squelette cranio-facial embryonnaire ^1,5. Using l'SOX10: ERT2-Cre avec le ubi: Zebrabow-M lignée transgénique, il est maintenant possible d'explorer les détails des mouvements cellulaires au cours du développement cranio-facial. Le Zebrabow-M, est une lignée transgénique conçu avec le promoteur de l'ubiquitine de conduire l'expression de différents fluorophores, chacun flanqué par des sites Lox ^8. Le fluorophore par défaut Zebrabow-M est rouge, exprimant RFP. Après induction de l'expression Cre, l'Zebrabow-M construire recombine et cellules expriment une combinaison de différents fluorophores (DP, CFP et YFP) créant expression multi-spectrale dans l'embryon. Toutes les cellules filles qui divisent des cellules marquées après l'événement de recombinaison par clonage sont ensuite marquées, de sorte que des populations de cellules qui dérivent de progéniteurs différentes sont juxtaposées par clonage étiquetés. En ce marquage cellulaire de clonage, les cellules prolifération et la migration à la résolution peuvent être suivies clonale (figure 1 et 2).

Protocole

Comité Massachusetts General Hospital institutionnel animal soin et l'utilisation (IACUC) a approuvé toutes les procédures sous le numéro # 2010N000106 protocole. Ceci est en conformité avec l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des animaux de laboratoire Care International (AAALAC) des lignes directrices.

1. Réactifs et matériaux Préparation

1. Préparer 1 L de 50X moyen E3 de l'embryon (voir tableau 1) et de préparer 1 L de milieu d'embryon E3 1X (voir tableau 2).
2. Préparer support d'embryon E3 avec du N-phénylthiourée (PTU) en ajoutant 30 mg de PTU à 1 L de 1X E3. Incorporer O / N afin d'assurer que le PTU dissolution complète. Stocker à température ambiante.
3. Pour préparer une solution de pronase, diluer 150 ul de la pronase (0,5 mg / ml) avec 15 ml de 1X E3. Cette quantité est suffisante pour 1 plat de Pétri. Utiliser immédiatement.
4. Préparer la solution de méthylcellulose.
   1. Préparer la solution E3-tricaïne en mélangeant 75 ml de 0,2% tricaïne avec 25 ml1X E3. Faire bouillir 3 g de méthylcellulose dans le 75 ml de solution E3-tricaïne.
   2. Compléter le volume final à 100 ml avec une solution E3-tricaïne. La solution finale de la méthylcellulose est visqueux et opaque avec une teinte jaunâtre. Stockage: RT abri de la lumière.
5. Tamoxifen stock et solution d'induction
   1. Préparer 5 mM solution stock tamoxifène par dissolution de 4-hydroxytamoxifène dans 100% d'éthanol. Les stocks en magasin à -80 ° C.
   2. Préparer une dilution fraîche de tamoxifène à la concentration de désir dans 1X E3 pour obtenir la solution d'induction. ATTENTION! S'il vous plaît consulter la fiche signalétique avant l'utilisation.
6. Préparer 1 L de 0,2% tricaïne selon le Tableau 3.
7. Obtenir diapositives confocale. Collez quatre lamelle (18 x 18) pour former un bloc puis placez 2 blocs sur une lamelle de 24 x 60 cm 2 en dehors pour permettre le montage de l'embryon dans le milieu.

2. Préparation d'embryons

1. Les lignées transgéniques.
   NOTE: Zebrabow-M était un don généreux du laboratoire de Alex Schier.
2. SOX10: Cre-ERT2
   REMARQUE: Générer le vecteur de ciblage pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre en utilisant des méthodes de clonage moléculaire standard et obtenu commercialement recombinaison technologie du clonage.
   1. Mélanger 5 'clone d'entrée (pENTR5'- sox10p) contenant 7.2Kb du promoteur SOX10, une passerelle clone moyenne (PME-ERT2-Cre), et un 3' clone d'entrée (pENTR3'-polyA) dans une réaction LR avec la destination de l'objectif vecteur pDestTol2- α-crystalline: YFP.
   2. Purifier construction pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre. Co-injecter la construction purifié (100 ng / ul) avec Tol2 transposase ARNm (50 ng / ul) dans des embryons WT (F0) au stade d'une cellule.
   3. Écran fondateurs F0 adultes pour la transmission de la lignée germinale repose sur une forte fluorescence jaune dans des embryons de F1.
3. SOX10: ERT2-Cre; Zebrabow-M
   1. Outcross l'Zebrabow-Mligne (2.1.1) avec le SOX10: lignée transgénique ERT2-Cre.
   2. Sélectionner des embryons présentant une forte expression de la DP omniprésente et marqueur d'objectif YFP et grandir eux jusqu'à adultes.

3. embryon Collection

1. Mettre en place plusieurs paires de SOX10: ERT2-Cre; Zebrabow-M poisson zèbre transgénique 17 heures-18 heures le jour 1.
2. Le lendemain, retirez les séparateurs dans la matinée et de recueillir les oeufs autour de midi.
3. Les transférer sur des boîtes de Pétri et ajouter 15 ml de la solution de pronase à dechorionate les embryons.
4. Incuber les embryons pendant 1 à 5 min jusqu'à environ 60% des embryons ont été dechorionated. Arrêter la réaction par décantation la solution de pronase et laver les embryons 3-4 fois avec le milieu E3 frais.
5. Incuber les embryons dechorionated dans E3 à RT O / N et laissez-les développer pour atteindre le stade 10 somites. Incuber 50-60 embryons par l'embrayage pour éviter la croissance de développement différent.

4. Traitement

1. Vérifiez stade de développement de l'embryon au microscope de champ lumineux pour assurer qu'ils sont au stade 10 somites.
2. En utilisant un microscope à fluorescence avec une protéine fluorescente (RFP) filtre rouge, isoler les embryons rouge vif.
3. Procéder à l'induction de la recombinaison Cre-en ajoutant 10 uM de solution hydroxytamoxifène pour la boîte de Pétri et incuber les embryons isolés à 28,5 ° C pendant 3 heures.
4. Décanter la solution tamoxifène et laver les embryons à plusieurs reprises avec l'E3.
   ATTENTION! jeter la solution tamoxifène dans un conteneur à déchets biologiques spéciaux.
5. Incuber les embryons à 28,5 ° CO / N.
6. Lorsque les embryons sont approximativement les 28-29 stade de somites (environ 24 heures après la fécondation), incuber les embryons à 28,5 ° C dans E3-PTU solution ci-après.
   REMARQUE: PTU est ici utilisée pour inhiber la formation de mélanophores dans les embryons en développement. Ce traitement est nécessaire pouréviter la distorsion du signal de fluorescence par mélanophores auto-fluorescent.
7. Incuber les embryons à 28,5 ° C

Sélection d'embryons 5.

1. Pour visualiser les structures cranio-faciales entièrement développés, sélectionner les embryons à 4 jours après la fécondation de l'intensité du signal Rouge et Cre marqueur d'expression positivité (jaune dans la rétine).
2. Anesthésier les embryons avec une solution E3 / 0,015% tricaïne. L'anesthésie est confirmée lorsque aucun des mouvements actifs ou de l'activité nageoire est observée lorsque aiguillonner doucement l'embryon.

6. Montage de l'embryon dans la méthylcellulose

1. Transférer l'embryon sélectionné pour l'imagerie dans une boîte de Pétri contenant une goutte de méthylcellulose et embaumer doucement l'embryon avec la méthylcellulose.
2. Sur une lame de confocale propre, placer une goutte de méthylcellulose fraîche et monter votre embryon sein de la goutte en utilisant une pointe microloader. Position embryon dorsale en prenant garde de ne pas toucherl'embryon directement.
3. Couvrir l'embryon monté avec une lamelle couvre-objet 25 x 25 et régler la position de l'embryon, si nécessaire par la manipulation de la lamelle.
4. L'embryon est maintenant prêt à l'image.

7. L'analyse par microscopie à fluorescence

1. Utilisez l'objectif 20x à sec de l'objectif (ouverture numérique de 0,75, la taille sténopé 2,0 um) pour focaliser l'embryon.
2. Appuyez sur le bouton L100 sur le microscope et sélectionner les canaux dans le logiciel.
3. Sélectionnez le bouton de configuration confocale et cliquez sur 'auto' et sélectionner les canaux suivants avant de fermer la fenêtre: CH1: PCP, CH2: GFP, CH3: DP ou mCherry
4. Allumez CH2 et CH3 avant de cliquer sur le bouton 'supprimer verrouillage'. Cliquez sur 'lecture' pour lancer la numérisation.
5. Concentrez-vous sur la structure d'intérêt, qui est le mieux fait en commençant avec ½ image / s et haute tension (HT) 150, puis en ajustant les paramètres en conséquence jusqu'à ce que la qualité d'image souhaitée est achieved. La demande de propositions serait plus brillante que les autres couleurs, donc ajuster la HV. Changez la position de Z à trouver à la fois YFP et les cellules positives DP.
6. Une fois réglé avec les paramètres, capturer l'image de votre embryon. Enregistrer votre image dans le format du logiciel d'imagerie et de format TIFF confocale pour le traitement d'image dans chaque canal dédoublé.
7. Ensuite, pour l'imagerie de la PCP, éteignez CH2 et CH3 et tourner sur CH1. Re-ajuster les paramètres comme dans l'étape 5 sans changer la zone de mise au point.
   REMARQUE: PCP peut être vraiment difficile à détecter en raison de signal de fond dans le canal bleu qui peut être contourné en ajustant la taille sténopé. Une taille plus grande sténopé permet une meilleure détection de la fluorescence en réduisant le signal / bruit de fond. Cependant, une plus grande sténopé réduiront effet confocal, compromettre la qualité d'image. Par conséquent, l'ajustement soigneux des paramètres est nécessaire pour obtenir la qualité d'image souhaitée et de l'intensité.
8. Capturez l'image et l'enregistrer dans le format à la fois (logiciel confocale et TIFF) pour le traitement de l'image. Les images peuvent alors être traitées en utilisant un logiciel commun de traitement d'image pour fusionner les calques et d'améliorer les paramètres de couleur comme décrit par Pan et ses collègues ^8.

Résultats

Visualisation traditionnel du cartilage par taches bleues toute la montagne Alcian a été inestimable dans l'observation du cartilage de Meckel développement et couramment utilisé pour visualiser finale cellulaire organisation ¹² (figure 1A). Pour approfondir l'analyse des chondrocytes développement des heures supplémentaires, en utilisant la lignée de traçage SOX10: Kaede lignées transgéniques nous a permis d'étudier la migration cellulaire, la convergence et l...

Discussion

Lignées transgéniques bleu Alcian et photoconvertible que décrit ci-dessus complète les uns aux autres pour définir le processus complexe de cartilage et le développement des os. Cependant, la migration cellulaire en direct et l'organisation pendant l'organogenèse a longtemps été supposé et indirectement démontré mais jamais visualisé. Zebrabow-M lignée transgénique couplé avec un cartilage Cre spécifique permet l'observation en direct simultanée de tous ces événements distincts impliqué...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pronase	Roche Life Sciences	10165921001	Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0262
PTU (N-Phenylthiourea)	Sigma-Aldrich	P7619
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
4-HydoxyTamoxifen	Sigma-Aldrich	T176
24 x 60 coverslips	Fisher Scientific	12-548-5P
18 x 18 coverslips	Fisher Scientific	12-540A
25 x 25 coverslips	Fisher Scientific	12-540C
pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit	Life technologies	K591-20
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Life Technologies	K2400-20
pENTR3'-pA	Tol2Kit	302
pDEST			Gift from Geoffrey Burns labs
Bright field microscope
Fluorescent microscope
Confocal microscope
Image processing software