Visualização de condrócitos Intercalation e Direcional Proliferação via Zebrabow Análise celular clonal na cartilagem de Meckel o Embryonic

Resumo

Organização celular dos ossos craniofaciais tem sido a hipótese, mas nunca diretamente visualizado. Rotulagem célula multi-espectral e in vivo ao vivo imaging permite a visualização do comportamento das células dinâmica no peixe-zebra maxilar inferior. Aqui, nós detalhe o protocolo para manipular Zebrabow peixes transgénicos e observar diretamente intercalação celular e alterações morfológicas de condrócitos na cartilagem de Meckel.

Resumo

Desenvolvimento das estruturas craniofaciais vertebrados requer uma coordenação precisa de migração celular, a proliferação, a adesão e a diferenciação. Padronização da cartilagem de Meckel, um primeiro arco derivado da faringe, envolve a migração das células da crista neural cranial (CNC) e do particionamento progressiva, proliferação e organização dos condrócitos diferenciados. Vários estudos têm descrito a migração CNC durante inferior morfogênese mandíbula, mas os detalhes de como alcançar os condrócitos organização no crescimento e extensão da cartilagem de Meckel permanece obscuro. O SOX10 restrito e Cre recombinase mediada por recombinação induzida quimicamente gera permutações de proteínas fluorescentes diferentes (RFP, YFP e PCP), criando, assim, um rótulo multi-espectral de células progenitoras e a sua descendência, que reflecte as populações clonais distintos. Usando fotografia confocal time-lapse, é possível observar os condrócitos behaviou durante o desenvolvimento da cartilagem do peixe-zebra de Meckel.

Rotulagem célula Multispectral permite aos cientistas demonstrar extensão de condrócitos de Meckel. Durante a fase de extensão da cartilagem de Meckel, o que prefigura a mandíbula, condrócitos intercalar para efetuar extensão como eles se comportam em uma fileira em camadas de uma única célula organizada. A falha deste processo de intercalação organizado para mediar extensão célula fornece a explicação mecanicista celular para mandíbula hipoplásica que observamos em malformações mandibulares.

Introdução

Desenvolvimento craniofacial requer, interacções celulares e teciduais moleculares complexas para conduzir a proliferação celular, migração e diferenciação ^{1,2, 3.} Este processo bem regulado e complexo está sujeito a perturbações genéticas e ambientais, de tal forma que deformidades craniofaciais estão entre as malformações congénitas mais comuns ^1-9. Enquanto intervenções cirúrgicas continuam a ser a base do tratamento para anomalias craniofaciais, compreender a base de desenvolvimento é essencial para inovar futuras terapias. Portanto, estudar a morfogênese e os mecanismos para a convergência e extensão e integração de células proporciona novos insights sobre a formação do esqueleto craniofacial ^1.

Cranial migração e de crista neural preencher o primeiro arco faríngeo, processos mandibulares então formar pares que se estendem para formar cartilagem de Meckel, o que prefigura a mandíbula. Morfogênese of cartilagem de Meckel exige organização dos condrócitos via proliferação direcional, polarização e diferenciação celular ^1,10. No entanto, a complexidade da organização dos condrócitos no crescimento e extensão da cartilagem de Meckel permanece obscuro. Entender o comportamento de células dinâmica é fundamental para compreender malformações congênitas que afetam o tamanho da mandíbula, como fenótipos mandibulares hipoplásicos ^11.

Zebrafish embriões oferecem muitas vantagens de desenvolvimento e genéticos para estudo detalhado da cartilagem de Meckel morfogênese. Sua rastreabilidade genética, transparência, ex vivo e rápido desenvolvimento são vantagens poderosas emprestando-lhe bem para observação do movimento celular e organização de imagens ao vivo ^6. Usando ferramentas de rastreamento de linhagem, tais como: SOX10 linhagem transgênica kaede, nós e outros delinearam as origens da crista neural do esqueleto craniofacial embrionário ^1,5. Using a SOX10: ERT2-Cre com o ubi: linhagem transgênica Zebrabow-M, é agora possível explorar detalhes de movimentos celulares durante o desenvolvimento craniofacial. O Zebrabow-H, é uma linha transgénica desenvolvida com o promotor da ubiquitina que conduz a expressão de fluoróforos diferentes, cada um flanqueado por locais lox ^8. O fluoróforo padrão Zebrabow-M é Vermelho, expressando RFP. Após indução da expressão de Cre, o Zebrabow-H construir recombina e células expressam uma combinação de diferentes fluoróforos (RFP, CFP e YFP), criando expressão multi-espectral no embrião. Todas as células filhas que dividem a partir das células marcadas após o evento de recombinação são então clonalmente marcado, de modo que as populações de células que derivam de diferentes progenitoras justapostas são clonalmente marcado. Por esta marcação celular clonagem, células proliferação e migração com resolução clonal pode ser seguido (Figura 1 e 2).

Protocolo

Cuidado e Uso Comitê Massachusetts General Hospital Institucional Animal (IACUC) aprovou todas as operações sob o protocolo de número # 2010N000106. Isso está em conformidade com a Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International (AAALAC) orientações.

1. Os reagentes e materiais de preparação

1. Prepare 1 L de 50X meio de embrião E3 (Ver Tabela 1) e preparar-se 1 L de meio de embrião E3 1X (Ver Tabela 2).
2. Prepare meio embrião E3 com N-feniltioureia (PTU) por adição de 30 mg de PTU a 1 L de 1X E3. Agitar O / N para assegurar que o PTU se ter dissolvido completamente. Armazenar à temperatura ambiente.
3. Para preparar a solução de pronase, diluir 150 uL de pronase (0,5 mg / ml) com 15 ml de 1X E3. Este montante é suficiente para uma placa de Petri. Utilizar imediatamente.
4. Prepare solução de metilcelulose.
   1. Preparar a solução E3-tricaina por mistura de 75 ml de 0,2% com 25 ml tricaina1X da E3. Ferver 3 g de metilcelulose em 75 ml de solução E3-tricaina.
   2. Completar o volume final de 100 ml com solução E3-tricaina. A solução final metilcelulose é viscosa e opaco com uma tonalidade amarelada. Armazenamento: RT protegido contra a luz.
5. Estoque Tamoxifen e solução de indução
   1. Prepare 5 mM de solução stock de tamoxifeno por dissolução de 4-hidroxitamoxifeno em etanol a 100%. Estoque armazenar a -80 ° C.
   2. Preparar fresco diluição de Tamoxifen à concentração desejo em 1X E3 para obter a solução de indução. CUIDADO! Por favor, consultar o MSDS, antes de usar.
6. Prepare 1 L de 0,2% tricaina conforme indicado na Tabela 3.
7. Obter lâminas confocal. Cole quatro lamela (18 x 18) em conjunto para formar um bloco, em seguida, colocá-2 em blocos de 24 x 60 cm de distância lamela 2 para permitir a montagem do embrião no meio.

2. Preparação de Embriões

1. Linhagens transgênicas.
   NOTA: Zebrabow-M foi uma oferta generosa do laboratório de Alex Schier.
2. SOX10: ERT2-Cre
   NOTA: Gerar o vector alvo pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre usando métodos de clonagem molecular padrão e comercialmente obtido recombinação tecnologia de clonagem.
   1. Combinar 5 'clone de entrada (pENTR5'- sox10p) contendo o promotor de 7.2Kb SOX10, um clone meio Gateway (PME-ERT2-Cre), e uma 3' do clone de entrada (pENTR3'-poliA) numa reacção com LR destino lente vetor pDestTol2- α-cristalina: YFP.
   2. Purificar construto pDestTol2- SOX10: ERT2-Cre. A co-injectar o construto purificado (100 ng / ul) com Tol2 ARNm da transposase (50 ng / ul) em embriões de WT (F0) no estádio de uma célula.
   3. Tela fundadores F0 adultos para a transmissão da linha germinal com base na forte fluorescência amarela em embriões de F1.
3. SOX10: ERT2-Cre; Zebrabow-M
   1. Outcross o Zebrabow-Mline (2.1.1) com a SOX10: linhagem transgênica ERT2-Cre.
   2. Selecionar embriões que apresentam uma forte expressão RFP onipresente e marcador lente YFP e cultivá-las até adultos.

Coleção 3. Embryo

1. Configure vários pares de SOX10: ERT2-Cre; Zebrabow-M peixes-zebra transgénicos cinco horas - seis horas no Dia 1.
2. No dia seguinte, retire os divisores de manhã e recolher os ovos em torno de meio-dia.
3. Transferi-los para placas de petri e adicionar 15 ml da solução de pronase a dechorionate os embriões.
4. Incubar os embriões de 1 a 5 min, até cerca de 60% dos embriões foram dechorionated. Parar a reacção por decantação da solução de pronase e lavar os embriões 3-4 vezes com meio fresco E3.
5. Incubar os embriões dechorionated na E3 na RT O / N e deixá-los a desenvolver para chegar à fase 10 somitos. Incubar 50-60 embriões por embreagem para evitar o crescimento de desenvolvimento diferente.

4. Tratamento

1. Verifique estágio de desenvolvimento dos embriões no âmbito de um campo de microscópio de luz para garantir que eles estão em fase de 10 somitos.
2. Usando um microscópio de fluorescência com uma proteína fluorescente (RFP) filtro vermelho, isolar os embriões vermelhos brilhantes.
3. Proceda à indução da Cre-recombinação pela adição de 10 uM de solução hidroxitamoxifeno numa placa de Petri e incubou-se os embriões isolados a 28,5 ° C durante 3 h.
4. Decantar a solução tamoxifeno e lavar os embriões várias vezes com E3.
   CUIDADO! descartar a solução tamoxifeno em um recipiente especial resíduos biológicos.
5. Incubar os embriões a 28,5 ° CO / N.
6. Quando os embriões são aproximadamente a 28-29 fase somites (cerca de 24 horas após a fertilização), incubar os embriões a 28,5 ° C na E3-PTU solução a seguir.
   NOTA: o PTU é aqui utilizado para inibir a formação de melanóforos nos embriões em desenvolvimento. Este tratamento é necessárioevitar a distorção do sinal de fluorescência por melanóforos auto-fluorescente.
7. Incubar os embriões a 28,5 ° C

5. Seleção de Embriões

1. Para visualizar as estruturas craniofaciais totalmente desenvolvidas, seleccionar os embriões em 4 dias após a fertilização para a intensidade do sinal vermelho e Cre marcador expressão positividade (amarelo na retina).
2. Anestesiar os embriões com uma solução de E3 / 0,015% tricaina. A anestesia é confirmado quando há movimentos ativos ou atividade fin é observado quando cutucando delicadamente o embrião.

6. Montagem do embrião em metilcelulose

1. Transferir o embrião seleccionado para a imagem latente numa placa de Petri contendo uma gota de metilcelulose e embalsamar suavemente o embrião com metilcelulose.
2. Em um slide confocal limpo, coloque uma gota de metilcelulose fresco e montar o seu embrião dentro da gota utilizando uma ponta microloader. Posição embrião dorsal tomando cuidado para não tocaro embrião directamente.
3. Cobrir o embrião montadas com uma lamela de 25 x 25 e ajustar a posição do embrião, se necessário através da manipulação da lamela.
4. O embrião está agora pronto para a imagem.

7. Análise por Microscopia de Fluorescência

1. Use a objetiva de 20x lente seca (abertura numérica 0,75; tamanho pinhole 2,0 mm) para focar o embrião.
2. Pressione o botão L100 no microscópio e selecionar os canais do software.
3. Selecione o botão de configuração confocal e clicar em 'auto' e selecionar as seguintes canais antes de fechar a janela: Ch1: PCP, Ch2: GFP, Ch3: RFP ou mCherry
4. Ligue CH2 e CH3 antes de clicar no botão "remover interlock". Clique em 'play' para iniciar a digitalização.
5. Concentre-se em estrutura de interesse, que é o melhor feito por começando com moldura ½ / seg e alta tensão (HV) 150 e, em seguida, ajustar as configurações de acordo até a qualidade de imagem desejada é achieved. A RFP seria mais brilhante do que as outras cores, por conseguinte, ajustar o HV. Mude a posição Z para encontrar tanto YFP e células positivas RFP.
6. Uma vez definido com as configurações, capturar a imagem de seu embrião. Salvar a imagem no formato confocal formato de software de imagem e TIFF para processamento de imagem em cada canal de divisão.
7. Em seguida, para a imagem latente PCP, desligue CH2 e CH3 e ligue Ch1. Re-ajustar as configurações como no passo 5 sem mudar a área de foco.
   NOTA: PCP pode ser muito difícil de detectar devido ao sinal de fundo em azul canal que pode ser contornado, ajustando o tamanho pinhole. Um tamanho maior pinhole permite uma melhor detecção de fluorescência, reduzindo ruído / sinal de fundo. No entanto, uma pinhole maiores reduzirá efeito confocal, comprometer a qualidade da imagem. Portanto, é necessário um ajuste cuidadoso das configurações para obter a qualidade de imagem desejada e intensidade.
8. Capturar a imagem e salvá-lo no formato de ambos (software confocal e TIFF) para processamento de imagens. As imagens podem então ser processados ​​usando software de processamento de imagem comum para mesclar camadas e melhorar as configurações de cores como descrito por Pan e colegas ^8.

Resultados

Visualização cartilagem tradicional pela montagem Alcian manchas azuis inteiras tem sido inestimável para observar o desenvolvimento da cartilagem de Meckel e comumente usado para visualizar celular organização ¹² (Figura 1A) final. Para analisar melhor os condrócitos em desenvolvimento horas extras, linhagem rastreamento usando SOX10: linhagens transgênicas Kaede nos permitiu estudar a migração de células, a convergência ea extensão em embriões vivos ^2,12

Discussão

Linhas transgénicas e azul Alcian photoconvertible como descrito acima complementa uns aos outros para definir o processo complicado de cartilagem e desenvolvimento ósseo. No entanto, a migração celular ao vivo e organização durante a organogénese tem sido a hipótese e, indiretamente, mas nunca demonstrou visualizado. A linha transgénica Zebrabow-H acoplado com uma cartilagem Cre específica permite a observação vivo simultânea de todos estes eventos distintas envolvidas na formação do osso e cartilagem. E...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pronase	Roche Life Sciences	10165921001	Prepare 500 μl stock aliquots at 50 mg/ml
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0262
PTU (N-Phenylthiourea)	Sigma-Aldrich	P7619
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
4-HydoxyTamoxifen	Sigma-Aldrich	T176
24 x 60 coverslips	Fisher Scientific	12-548-5P
18 x 18 coverslips	Fisher Scientific	12-540A
25 x 25 coverslips	Fisher Scientific	12-540C
pENTR5'-TOPO TA Cloning Kit	Life technologies	K591-20
pENTR/D-TOPO Cloning Kit	Life Technologies	K2400-20
pENTR3'-pA	Tol2Kit	302
pDEST			Gift from Geoffrey Burns labs
Bright field microscope
Fluorescent microscope
Confocal microscope
Image processing software