Isolement et caractérisation de souris Antral ovocytes Basé sur Nucleolar Organisation chromatine

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour la caractérisation des ovocytes de souris antraux basés sur une organisation nucléolaire.

Résumé

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures.

Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.

Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Introduction

Antraux ovocytes entièrement développés (GV, vésicule germinale) isolés du compartiment de l'antre de l'ovaire sont couramment utilisés à des fins différentes, tels que, par exemple, l'étude des mécanismes moléculaires et cellulaires derrière la maturation in vitro jusqu'au stade métaphase II.

Malgré leurs belles apparence ovocytes plus antre, mais pas tous, sont en mesure de compléter la méiose et atteindre le stade de blastocyste; En fait, dans de nombreuses espèces de mammifères, dont les humains ^1,2, environ 30% d'entre eux arrêter leur développement au stade 2 cellules, si la fécondation se produit ^3-5. À ce jour, peu de paramètres sont utilisés pour distinguer entre les ovocytes capables de soutenir le développement embryonnaire de ceux qui sont incapables de le faire.

Par exemple, crésyle coloration au bleu (BCB) est une méthode valide pour trier les ovocytes sur la base de l'activité de glucose-6-phosphate déshydrogénase, bien que l'utilité de cette méthode de tri associées à la coloration ou + BCB est BCB-encore dépendants ^6-8 laboratoire.

Une autre méthode bien établie réside dans leur organisation de la chromatine: si colorées avec des colorants intercalants de l'ADN (comme Hoechst33342), 70% des ovocytes antraux montre un anneau de colorant positive autour du nucléole et sont appelés Entouré Nucléole (SN), tandis que les 30% restants montrer un des signaux positifs plus tachetées et sont appelés pas entouré Nucléole (NSN) ^3-5. Récemment, nous avons montré que l'absence de réseaux cytoplasmiques ⁹ (de CPL, sites de stockage importants pour l'ARNm et des ribosomes d'origine maternelle dans les deux ovocytes et des embryons de mammifères) ^{10 et la} régulation à la baisse de MATER (essentiel pour la formation CPL ^11), avec la présence de gouttelettes de lipides dans leur cytoplasme ^9,12, peuvent être d'autres causes liées à l'incapacité des ovocytes NSN à aller au-delà du stade 2 cellules.

Malheureusement, quelques techniques peuvent être appliquées pour trier SN antre et ovocytes RSN et,pour cette raison, le développement d'une méthode moins invasive (sans coloration nucléaire, les procédures de fixation ou de manipulation aux pipettes bouche) pourrait devenir très important d'augmenter les taux de développement de l'embryon à la fois humaine et animale.

Dans cet article, nous détaillons le protocole simple et rapide utilisé pour isoler annonce SN de tri et RSN ovocytes antre de souris femelles et elle est adressée à tous les scientifiques intéressés par l'étude de la gamétogenèse femelle, la maturation des ovocytes et le développement de l'embryon.

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Protocole

Ce protocole est réalisée en conformité avec les principes directeurs du européenne (UE) 63/2010 et 26/2014) (lois italiennes de protection des animaux utilisés pour la recherche scientifique. Cervicale dislocation euthanasie est utilisé pour ovaires isolement et elle est effectuée par des experts et des personnes énumérées dans le protocole approuvé couvrant cette étude formé.

1. Les animaux

1. Maintenir adultes 3- à des souris femelles de 6 semaines, âgé dans une salle à température contrôlée et l'humidité (avec des phases de 12L: 12D et nourris ad libitum).
2. Injecter les souris par voie intraperitoneale avec 2,5 UI de gonadotrophine Pregnant Mare sérique (PMSG) pour stimuler la croissance folliculaire en imitant les effets de l'hormone folliculo-stimulante (FSH). Isoler les ovaires pour les ovocytes antraux collecte de 48 heures plus tard. Euthanasier la souris femelle préalablement injecté avec PMSG, selon vos directives institutionnelles.
3. Supprimer rapidement les ovaires de la cavité du corps et placez-les dans le plat de Pétri suiteaining milieu M2 pour l'isolation des ovocytes ultérieure (voir section 3).
   1. Faire une incision sur la peau recouvrant la paroi abdominale suivie par une incision dans le péritoine à l'aide des ciseaux de dissection stériles. Ouvrir l'incision pour exposer l'abdomen, le cran se déplacer d'un côté à l'aide des pinces stériles et localiser les trompes utérines, formant une forme en V à partir de la vessie.
   2. Respecter les ovaires situés sous les reins. Maintenez chaque tube avec pince stérile et faire une petite incision au bas des ovaires pour les libérer. Transfert des deux ovaires au fond d'une boîte de Pétri contenant le milieu pré-équilibrée.

2. Hormone Préparation

1. Diluer PMSG (disponible en différentes concentrations sous licence) avec une solution saline isotonique stérile pour obtenir une concentration de travail de 2,5 UI d'hormone par 0,1 ml pour un volume d'injection approprié.
   REMARQUE: Les solutions d'hormone doivent être aliquotées dans 0,5 ml tubes et conservés à -20 ° C jusqu'au jour d'utilisation. Ne gardez pas aliquotes dilué de plus de trois mois à -20 ° C. Une fois décongelé, si les injections sont effectuées en série, stocker les aliquotes de solutions d'hormones à +4 ° C et les utiliser dans les 4 jours.

3. Antral ovocytes Isolement

Pour l'isolement de bon ovocytes:

1. Equilibrer milieu M2 ¹³ (M2) à 5% de CO ₂ et 37 ° C pendant au moins 1 heure avant de procéder à l'isolement d'ovocytes. Préparer deux boîtes de Petri (35 mm x 10 mm), l'une avec 1 ml de M2 ​​pour ponction des ovaires et l'autre avec de petites gouttes (20 ul) de M2 ​​recouvert d'huile minérale (~ 1,5 ml) pour le transfert des ovocytes après isolement à partir de la ovaire (voir 3,4-3,6). Gardez les deux boîtes de Pétri dans l'incubateur à 5% de CO _{2 et} 37 ° C jusqu'à ce que prêt à être utilisé.
2. Utilisez un stéréomicroscope pendant les procédures d'isolement de ovocytes.
3. Préparer fines pipettes bouche de verre pour recueillir les ovocytes par la stretchhing pipettes Pasteur en verre maintenues horizontalement (en maintenant les extrémités de la pipette avec les deux mains), au cours d'une flamme verticale venant du brûleur Bunsen (figure 1).
   1. Une fois le verre commence à fondre, prendre la pipette de la flamme et effectuer un mouvement de traction rapide pour obtenir la pipette souhaitée. Fermement couper le verre dépassement proche de la pointe de la pipette avec les ongles pour ajuster la longueur et le diamètre du capillaire interne étroite. Assurez-vous que le capillaire mince a un diamètre interne de 100 um ~, légèrement plus grande que le diamètre de l'ovocyte (~ 80 um).
   2. Pour la bouche pipette, connectez une extrémité du tube d'aspiration à la pipette tiré par aide d'une pointe appropriée et placer l'autre extrémité dans la bouche, en le fixant avec les dents.
4. Recueillir les ovaires en utilisant des pinces stériles et les déposer au fond d'une boîte de culture cellulaire de Petri (35 mm x 10 mm). Couvrir avec 1 ml de M2 ​​préalablement équilibrées à 37 ° Cet 5% de CO ₂ (Figure 2).
5. Percer délicatement les follicules antraux des ovaires avec une aiguille insuline seringue stérile pour libérer ovocytes antraux en M2 (figure 3).
6. Doucement bouche Déposer le ovocytes à travers une pipette Pasteur étroite pour éliminer les cellules folliculaires et tout autre débris de tissu possible (figure 4A), puis de les régler au fond de petites gouttes (20 pi) de M2 couverts avec de l'huile minérale approprié pour la culture d'embryons (précédemment préparé; figure 4B).
   NOTE: Il est important d'enlever toutes les cellules du cumulus attachés à la zone pellucide des ovocytes par pipetage continu à travers plusieurs et différentes gouttes de M2. Effectuer cette étape aussi vite que possible pour éviter des modifications du pH du milieu.

4. Antral ovocytes coloration avec Hoechst33342

REMARQUE: ovocytes antraux peut être distinguée de SN (Entouré Nucléole), NSN (Non Entouré Nucléole) oude toute autre forme intermédiaire, en fonction de leur organisation de la chromatine après coloration avec la concentration de supravital Hoechst33342 (ou d'autres marqueurs spécifiques pour les bases AT) ^14. En fait, les ovocytes SN montrent un anneau Hoechst positif autour de la nucléole tandis que le NSN ne le font pas, d'où son nom.

Pour la coloration de ovocytes appropriée:

1. Transférer les ovocytes en utilisant une pipette en bouche gouttes de Hoechst33342 (20 pi) dilué dans M2 à la concentration supravital de 50 ng / ul pendant 10 min dans l'obscurité.
2. Après l'incubation avec Hoechst33342, transférer chaque ovocyte unique avec une pipette de la bouche au bas de petites gouttes (5 pi) de M2 ​​couverts avec de l'huile minérale, pour le tri sur la base organisation de la chromatine (SN ou NSN). Utilisez toute microscope à fluorescence équipé d'un filtre Hoechst33342 (d'onde d'émission 486 nm) pour visualiser la configuration de la chromatine des ovocytes.
   REMARQUE: Selon le type de microscope à fluorescence utilisé, it peut devenir impératif d'utiliser à fond de verre boîte de Pétri pour l'acquisition d'image. La microscopie confocale Olympus Fluoview Fv10i lorsqu'il est équipé d'un porte-échantillon pour boîte de 35 mm nécessite verre seulement bas-plats pour l'acquisition d'image, avec une épaisseur standard 0,17 mm et une gamme de 0,13 à 0,21 mm acceptables.
3. Exciter les ovocytes pour pas plus de 5-10 secondes, probablement assez de temps pour visualiser la présence ou l'absence d'un anneau autour de la nucléole (Figure 5).
4. Après le tri, la culture de la SN de l'antre et ovocytes RSN en M2 à 5% de CO _{2 et} 37 ° C pour induire la maturation in vitro ou les conserver dans des tampons appropriés pour des analyses moléculaires ou cellulaires.

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Résultats

Les images suivantes montrent la méthode utilisée pour isoler les ovocytes antraux à partir d'ovaires de souris, à partir de pipettes préparation au tri des ovocytes au moyen d'Hoechst33342. Cette méthode est assez simple et peut être effectuée dans n'importe quel laboratoire équipé d'un _incubateur à CO 2, un stéréomicroscope et un microscope à fluorescence équipé du filtre adapté à l'observation de la Hoechst33342 La figure 1 repr...

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Discussion

Ce protocole décrit la méthode utilisée pour isoler et classer l'antre de la souris ovocytes GV. Il n'y a pas des étapes cruciales notamment pour souligner, à quelques exceptions près. Premièrement: cette procédure doit être effectuée aussi rapidement que possible à: a) maintenir la vitalité des ovocytes et b) d'éviter les changements de pH dans le moyen utilisé. Deuxièmement: ovocytes doivent être brièvement excité (5-10 sec) pour Hoechst33342 pour éviter les dommages de la chromatine et ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PMSG	Sigma	G4527
EmbrioMax M2	Millipore	MR-015-PD
Hoechst33342	Thermo Scientific	62249
Mineral Oil	Sigma	M8410
Cell Culture Dish 35mmx10mm	Corning	430165
µ-Dish 35mm, high glass bottom	Ibidi	81158
Pipette Pasteur Borosilicate	Corning	7095D-9
Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes	Sigma	A5177