Implantation et enregistrement de Wireless Électrorétinogramme et potentiel évoqué visuel chez des rats conscients

Résumé

Nous montrons les procédures d'implantation et d'enregistrement chirurgicales pour mesurer des signaux électrophysiologiques visuels de l'oeil (électrorétinogramme) et le cerveau (visuel potentiel évoqué) chez des rats conscients, ce qui est plus analogue à la condition humaine où les enregistrements sont effectués sans anesthésie confond.

Résumé

L'électrorétinogramme-plein champ (ERG) et potentiel évoqué visuel (VEP) sont des outils utiles pour évaluer la rétine et de l'intégrité de la voie visuelle dans les deux paramètres cliniques et de laboratoire. Actuellement, les mesures ERG et VEP précliniques sont effectués avec l'anesthésie pour assurer des placements d'électrodes stables. Cependant, la présence de l'anesthésie a été montré pour contaminer les réponses physiologiques normales. Pour surmonter ces facteurs confusionnels d'anesthésie, nous développons une nouvelle plate-forme pour tester ERG et VEP chez des rats conscients. Les électrodes sont implantés chirurgicalement sous-conjonctivale sur l'oeil pour analyser l'ERG et épidurale sur le cortex visuel pour mesurer la VEP. Une gamme d'amplitude et de sensibilité / paramètres de synchronisation sont analysés à la fois l'ERG et VEP à accroître les énergies lumineuses. Les signaux ERG et VEP sont présentés pour être stable et reproductible pendant au moins 4 semaines après l'implantation chirurgicale. Cette capacité à enregistrer des signaux ERG et VEP sans anesthésie déconcerte dans les s précliniquesise devrait fournir une traduction de qualité supérieure à des données cliniques.

Introduction

L'ERG et VEP sont peu invasive dans des outils in vivo pour évaluer l'intégrité des voies rétiniennes et visuelles respectivement en laboratoire et en clinique. Le plein champ ERG donne une forme d' onde caractéristique qui peut être décomposé en différentes composantes, chaque élément représentant différentes classes de cellules de la voie ^1,2 rétinienne. Le classique-plein champ ERG forme d' onde est constitué d'une pente initiale négative (a-ondes), qui a été montré pour représenter photorécepteur activité post exposition à la lumière ^2-4. L'une onde est suivie par une forme d' onde positif substantiel (b-ondes) qui reflète l' activité électrique de la rétine centrale, principalement les cellules ON-bipolaires ^5-7. En outre, on peut faire varier l' énergie lumineuse et inter-impulsion-intervalle pour isoler cône à partir des réponses de la tige ^8.

Le flash VEP représente des potentiels électriques de la tige du cortex et du cerveau visuel en réponse à une stimulation lumineuse de la rétine^9,10. Cette forme d' onde peut être décomposé en composants précoces et tardifs, avec le composant début reflétant l' activité des neurones de la voie rétino-geniculo-striée ^11-13 et la fin du composant représentant le traitement cortical effectué dans diverses strates V1 chez le rat ^11,13. Par conséquent la mesure simultanée de l'ERG et VEP renvoie l'évaluation complète des structures impliquées dans la voie visuelle.

À l'heure actuelle, afin d'enregistrer l'électrophysiologie chez l'animal, l'anesthésie est utilisé pour permettre le placement stable d'électrodes. Il y a eu des tentatives pour mesurer ERG et VEP chez des rats conscients ^14-16 , mais ces études employé une installation filaire, ce qui peut être lourd et peut conduire à un stress des animaux en restreignant le mouvement des animaux et le comportement naturel ^17. Avec les récents progrès dans la technologie sans fil, y compris l'amélioration de la miniaturisation et de la vie de la batterie, il est maintenant possible de mettre en œuvre une approche de télémétrie pour ERG und 'enregistrement de VEP, ce qui diminue le stress associé à des enregistrements filaires et l'amélioration de la viabilité à long terme. Entièrement intériorisées stables implantations de sondes télémétriques ont prouvé leur efficacité pour la surveillance chronique de la température, de la pression artérielle ^18, l' activité ¹⁹ ainsi que l' électroencéphalographie ^20. Ces avancées technologiques contribueront également à la répétabilité et la stabilité des enregistrements conscients, ce qui augmente l'utilité de la plate-forme pour les études chroniques.

Protocole

Éthique déclaration: Les expérimentations animales ont été menées en conformité avec le Code australien pour le soin et l' utilisation des animaux à des fins scientifiques (2013). approbation éthique des animaux a été obtenue auprès du Comité d'éthique animale, Université de Melbourne. Les matériaux sont ici pour des expériences de laboratoire, et non destinés à un usage médical ou vétérinaire.

1. Electrodes Préparation

Remarque: un émetteur à trois canaux est utilisé pour l'implantation chirurgicale qui permet à deux ERG et l'enregistrement d'une VEP être réalisée simultanément. Les trois actifs et trois électrodes inactives doivent être pré-façonné en forme d'anneau avant l'implantation afin d'attacher à l'œil. Pour des fins d'identification, le fabricant a fermé électrodes actives dans la moitié blanche, gaines en plastique demi de couleur tandis que les électrodes inactives sont couverts dans des gaines colorées pleines. L'électrode de masse (gaine en plastique transparent) est laissée inchangée. Pour tous électr actifs et inactifsconduite odes étapes 1.1, 1.2, 1.3 et 1.7.

1. Défaites la double électrode en acier inoxydable brin avec deux pinces à pointe fines.
2. Coupez l'un des brins d'acier inoxydable (environ 1 cm de la pointe), laissant un seul brin plus droite reste à façonner l'électrode annulaire.
3. Pliez le seul brin d'acier inoxydable sur lui-même et la torsion, formant un anneau lisse à la pointe de l'électrode.
4. Pour l'ERG électrodes actives mode cette boucle ~ 0,2 - 0,5 mm de diamètre par torsion de la base de la boucle (aux fins décrites ici, la forme de deux électrodes actives dans cette façon d'enregistrer ERG des deux yeux), et pour l'ERG inactif et électrodes VEP font le diamètre de la boucle ~ 0,8 mm de diamètre (dans cet exemple, le faire pour une électrode de VEP active et les trois électrodes inactives).
5. Accrocher la VEP électrode circulaire actif autour d'une vis en acier inoxydable (diamètre 0,7 mm, longueur 3 mm) pour l'électrode repose contre la tête de vis.
6. Hook les 3 électrodes inactives (2 ERG, 1 VEP) autour d'une seconde vis en acier inoxydable (diamètre 0,7 mm, longueur 3 mm).
7. Tirez le manchon en plastique vers l'avant sur les extrémités pointues du brin deux en acier inoxydable pour réduire l'irritation.
8. Stériliser les émetteurs de télémesure par trempage dans glutaraldéhyde à 2% pendant plus de 10 heures à environ 25 ° C. Ensuite, rincez l'émetteur avec une solution saline stérile 3 fois.

2. Transmetteur Implantation

1. Préparation des animaux
   1. Désinfecter la zone chirurgicale avant l'expérimentation par nettoyage à l'éthanol 70%. Autoclave tout le matériel chirurgical avant l'utilisation et l'entretien du matériel de chlorhexidine lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation lors de la chirurgie. Couvrir l'animal avec un drap chirurgical pendant une intervention chirurgicale afin de maintenir un environnement stérile. Vérifiez que tous les expérimentateurs portent des masques chirurgicaux, des gants et des blouses stériles.
   2. Induire une anesthésie avec 1,5 à 2% d'isoflurane, à un taux de 3 L / min et débit entretenir cetnis à 1,5 à 2% à 2 L / min tout au long de la chirurgie. Confirmer une profondeur suffisante de l'anesthésie par l'absence d'un réflexe de la pédale lors de pincer le muscle entre les orteils.
   3. Rasez 40 mm Surface x 30 mm sur l'abdomen au-dessus de l'aine au sternum.
   4. Rasez 30 mm Surface x 20 mm sur le front, postérieure aux yeux et antérieure aux oreilles.
   5. Désinfecter les deux zones rasées. Pour la zone de front désinfecter avec 10% de povidone-iode à trois reprises (éviter l'utilisation d'antiseptiques à base d'alcool pour la zone près de l'œil, étant compatible avec la norme de pratique établie par l'Association des technologues chirurgicaux). Sur l'abdomen désinfecter avec 10% de polyvidone iodée et 70% d'éthanol.
   6. Appliquer 1 goutte de proximétacaïne à la cornée pour l'anesthésie topique supplémentaire.
   7. Appliquer 1 goutte de carboxyméthylcellulose sodique à la cornée pour éviter le dessèchement des yeux.
2. L' implantation chirurgicale
   1. Faire une incision de 10 mmsur la tête le long de la ligne médiane verticale entre les oreilles avec un scalpel chirurgical.
   2. Faire une incision de 5 mm sur l'abdomen à travers la couche de peau le long de la ligne médiane au-dessous du sternum.
   3. Tunnel à 5 ​​mm de diamètre canule sous-cutanée de l'incision abdominale à l'incision de la tête.
   4. Passer les fils d'électrodes (3 actifs et inactifs) 3 de l'émetteur à travers la canule de l'abdomen à la tête.
   5. Laisser l'électrode de référence à la base de l'émetteur et couvrir la pointe de l'électrode avec de la gaze aseptique.
   6. Couvrir les pointes d'électrodes (3 actifs et inactifs) 3 avec de la gaze aseptique.
   7. Fixer la tête du rat à une plate-forme stéréotaxique.
   8. Prolongez l'incision de front à 30mm de longueur avec des ciseaux chirurgicaux.
   9. Exposer zone chirurgicale en rétractant la peau lâche avec 2 sutures (3 - 0) à ~ 3 et 9 heures.
   10. Grattez le périoste recouvrant le crâne à l'aide de gaze stérilisée pour exposer Bregma, lambda et midline sutures.
   11. Percez deux trous dans le crâne à la VEP active (7 mm ventral bregma 3 mm en dehors de la ligne médiane) et inactive (5 mm rostrale à bregma sur la ligne médiane) coordonnées stéréotaxiques.
   12. Fixer VEP électrodes actives et inactives avec des vis pré-joint en acier inoxydable (diamètre 0,7 mm, longueur 3 mm) au crâne avec un petit tournevis à ~ 1 mm de profondeur dans les trous préformés. Cette ancre la vis à l'os sans endommager le tissu cortical sous-jacent.
   13. Pour implanter les électrodes actives ERG utilisent un 8-0 suture de se rétracter temporairement la paupière supérieure.
   14. Insérez un 16 à 21 G canule sous-cutanée derrière l'oeil à travers le fornix conjonctival supérieur.
   15. Retirez l'aiguille de guidage.
   16. Nourrissez l'électrode active à travers le cathéter en plastique raccourci du front vers l'oeil. Ensuite, retirer le cathéter en plastique.
   17. Utiliser un fil de suture temporaire (8-0), qui est enfilée à travers la boucle d'électrode, afin d'empêcher les electrode de se rétracter de nouveau dans le tunnel.
   18. Faire une incision de 0,5 mm sur la conjonctive supérieure à 12 heures, de 1 mm en arrière du limbe. Utilisez dissection pour exposer la sclérotique sous-jacent.
   19. Implanter un 8 - 0 suture immédiatement derrière le limbe à la moitié de l'épaisseur scléral - 0 ou 9.
   20. Retirer suture temporaire ERG électrode active.
   21. Ancrer l'électrode active ERG à la demi-scléral épaisseur suture en liant 3 noeuds consécutifs assurant la pointe de l'électrode est situé à proximité du limbe.
   22. Fermez le volet conjonctival en utilisant 1 à 2 sutures interrompues (8 - 0 à 9 - 0). Assurez-vous que la conjonctive recouvre complètement l'électrode ERG pour améliorer le confort.
   23. Retirer la paupière rétracter suture.
   24. Répétez la procédure pour l'oeil controlatéral.
   25. Appliquer le gel de cyanoacrylate sur le crâne pour sécuriser toutes les vis en acier inoxydable et les fils d'électrodes. Assurer les électrodes actives ERG ne sont pas tirés trop serré avant de fixer à enmouvements oculaires capables.
   26. Fermez la blessure à la tête au moyen d'un non-absorbable 3-0 suture.
   27. Tournez rongeur pour exposer la zone abdominale. Allonger dermique incision abdominale à 40 mm le long de la ligne blanche avec des ciseaux chirurgicaux.
   28. Faire une incision de 35 mm à travers la paroi du muscle interne pour exposer la cavité abdominale intérieure.
   29. L'utilisation de deux sutures (3 - 0) fixer le corps de l'émetteur à droite paroi abdominale interne de l'animal. Éviter tout contact avec le foie.
   30. Boucle l'électrode de masse et de sécurité dans cette forme avec une suture (3 - 0). Placez-le flottant librement dans la cavité abdominale.
   31. Fermez le péritoine en utilisant une suture continue (3 - 0).
   32. Fermer l'incision de la peau en utilisant des sutures interrompues (3 - 0).
3. Les soins post-opératoires
   1. Surveiller l'animal jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Maison de l'animal seul après la chirurgie.
   2. Administrer carprOfen sous-cutanée pour l'analgésie (5 mg / kg) une fois par jour pendant 4 jours.
   3. Ajouter des antibiotiques oraux prophylactiques (Enrofloxin, 5 mg / kg) à l'eau potable pendant 7 jours après la chirurgie.
   4. Appliquer une pommade anti-inflammatoire à des sites d'incision de la peau pour réduire l'irritation pour les 7 premiers jours après la chirurgie.

3. Conduite ERG et VEP Recordings chez des rats conscients

1. adapter foncé animaux pendant 12 heures avant l'ERG et VEP enregistrements
2. Effectuer toutes les manipulations expérimentales sous éclairage faible rouge (17,4 cd.m ^-2, λ _max = 600 nm)
3. Appliquer une anesthésie topique (0,5% de proximétacaïne) et dilatant (0,5% tropicamide) tombe à la cornée.
4. Guide du rongeur conscient en fait sur mesure, restrainer claire.
   Remarque: La longueur de ce tube en matière plastique peut être ajustée pour s'adapter à des rats de tailles différentes avec le diamètre global fixé à 60 mm. L'extrémité avant de l'appareil est effilée pour réduire au minimum la tête moDépla et contient des perforations pour permettre une respiration normale. Ce front conique permet un alignement et la stabilisation de la tête et les yeux du rat à l'ouverture de la sphère de Ganzfeld. A noter que le rongeur a été acclimatés au dispositif de retenue (3 à 5 fois) avant l'intervention chirurgicale.
5. Placer le rongeur en face de la cuvette Ganzfeld avec les yeux alignés avec l'ouverture de la cuvette.
6. Allumez l'émetteur inhabitation en passant un aimant au sein de ~ 5 cm de l'émetteur. Vérifiez que l'émetteur est en vérifiant le voyant d'état LED sur la base du récepteur.
7. Recueillir des signaux sur une gamme d'énergies lumineuses (ie, -5,6 à 1,52 log cd.sm ^-2) comme décrit précédemment ^21. En bref, plusieurs signaux moyenne aux niveaux de gradateur de lumière (~ 80 répétitions) et moins aux énergies plus lumineux lumineuses (~ 1 répétition). Peu à peu, d'allonger l'intervalle de 1 à 180 secondes interstimulus de dimmest au niveau de lumière la plus brillante.
8. Pour isoler la tige ERGet les réponses du cône utilisent un paradigme double flash ^8. Par exemple, lancer deux flashs à 1,52 log cd.sm ^-2 avec un intervalle msec 500 inter-stimulus entre les deux.
9. Pour enregistrer des signaux VEP, moyenne 20 répétitions aux énergies plus lumineux lumineux (ie, 1,52 log cd.sm ^-2, 5 sec d' intervalle inter-stimulus).
10. Pour évaluer la stabilité des implants, qui est évaluée par le signal de la variabilité dans le temps, conduire ERG et VEP enregistrements 7, 10, 14, 21 et 28 jours après la chirurgie.
11. Après la période expérimentale, les rats euthanasie par injection intracardiaque de pentobarbiturate (1,5 ml / kg) après la kétamine: anesthésie xylazine (12: 1 mg / kg).

Résultats

La réponse du photorécepteur est analysée en ajustant une gaussienne retardée du bord d' attaque de la branche descendante initiale de la réponse ERG aux 2 derniers énergies lumineuses (1,20, 1,52 log csm ^-2) pour chaque animal, basé sur le modèle de Lamb et Pugh ^22, formulé par Hood et Birch ^23. Cette formule renvoie une amplitude et d' un paramètre de sensibilité (figure 1C et 1D, respectivement). Une...

Discussion

En raison de la nature très peu invasive de l'électrophysiologie visuelle, et VEP enregistrements d'ERG chez des patients humains sont effectuées dans des conditions conscientes et ne nécessitent l'utilisation d'anesthésiques topiques pour le positionnement des électrodes. En revanche, électrophysiologie visuelle dans des modèles animaux est classiquement réalisée sous anesthésie générale pour permettre le placement des électrodes stables en éliminant les mouvements oculaires volontaires e...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioamplifier	ADInstruments	ML 135	Amplifies ERG and VEP signals
Carboxymethylcellulose sodium 1.0%	Allergan	CAS 0009000-11-7	Maintain corneal hydration during surgery
Carprofen 0.5%	Pfizer Animal Health Group	CAS 53716-49-7	Post-surgery analgesia, given with injectable saline for fluid replenishment
Chlorhexadine 0.5%	Orion Laboratories	27411, 80085	Disinfection of surgical instrument
Cyanoacrylate gel activator	RS components	473-439	Quickly dries cyanoacrylate gel
Cyanocrylate gel	RS components	473-423	Fix stainless screws to skull
Dental burr	Storz Instruments, Bausch and Lomb	E0824A	Miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws
Drill	Bosch	Dremel 300 series	Automatic drill for trepanning
Enrofloxin	Troy Laboratories		Prophylactic antibiotic post surgey
Ganzfeld integrating sphere	Photometric Solutions International		Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size
Gauze swabs	Multigate Medical Products Pty Ltd	57-100B	Dries surgical incision and exposed skull surface during surgery
Isoflurane 99.9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery
Kenacomb ointment	Aspen Pharma Pty Ltd		To reduce skin irritation and itching after surgery
Luxeon LEDs	Phillips Lighting Co.		For light stimulation, twenty 5 W and one 1 W LEDs, controlled by Scope software
Needle (macrosurgery)	World Precision Instruments	501959	for suturing abdominal and head surgery, used with 3 - 0 suture, eye needle, cutting edge 5/16 circle Size 1, 15 mm
Needle holder (macrosurgery)	World Precision Instruments	500224	To hold needle during abdominal and head surgery
Needle holder (microsurgery)	World Precision Instruments	555419NT	To hold needle during ocular surgery
Optiva catheter	Smiths Medical International LTD	16 or 21 G	Guide corneal active electrodes from skull to conjunctiva
Povidone iodine 10%	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml
Powerlab data acquisition system	ADInstruments	ML 785	Acquire signal from telemetry transmitter, paired to telemetry data converter
Proxymetacaine 0.5%	Alcon Laboratories	CAS 5875-06-9	Topical ocular analgesia
Restrainer	cutom made		Front of the restrainer is tapered to minimize head movement, length can be adjusted to accommodate different rat length, overall diameter is 60 mm.
Scapel blade	R.G. Medical Supplies	SNSM0206	For surgical incision
Scissors (macrosurgery)	World Precision Instruments	501225	for cutting tissue on the abodmen and forhead
Scissors (microsurgery)	World Precision Instruments	501232	To dissect the conjunctiva for electrode attachment
Scope Software	ADInstruments	version 3.7.6	Simultaneously triggers the stimulus via the ADI Powerlab system and collects data
Shaver	Oster	Golden A5	Shave fur from surgical areas
Stainless streel screws	MicroFasteners	L001.003CS304	0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length
Stereotaxic frame	David Kopf	Model 900	A small animal stereotaxic instrument for locating the implantation landmarks on the skull
Surgical drape	Vital Medical Supplies	GM29-612EE	Ensure sterile enviornment during surgery
Suture (macrosurgery)	Ninbo medical needles	3-0	for suturing abdominal and head surgery, sterile silk braided, 60 cm
Suture needle (microsurgery)	Ninbo medical needles	8-0 or 9-0	for ocular surgery including, suturing electrode to sclera and closing conjunctival wound, nylon suture, 3/8 circle 1 × 5, 30 cm
Telemetry data converter	DataSciences International	R08	allows telemetry signal to interface with data collection software
Telemetry Data Exchange Matrix	DataSciences International		Gathers data from transmitters, pair with receiver
Telemetry data receiver	DataSciences International	RPC-1	Receives telemetry data from transmitter
Telemetry transmitter	DataSciences International	F50-EEE	3 channel telemetry transmitter
Tropicamide 0.5%	Alcon Laboratories		Iris dilation
Tweezers (macrosurgery)	World Precision Instruments	500092	Manipulate tissues during abdominal and head surgery
Tweezers (microsurgery)	World Precision Instruments	500342	Manipulate tissues during ocular surgery