L'impianto e la registrazione di Wireless Elettroretinogramma e potenziale visivo evocato ratto conscio

Riepilogo

Mostriamo le procedure di impianto e di registrazione chirurgiche per misurare i segnali elettrofisiologici visivi dall'occhio (elettroretinogramma) e il cervello (visivo potenziale evocato) nei ratti coscienti, che è più simile alla condizione umana in cui le registrazioni sono effettuate senza anestesia confonde.

Abstract

L'elettroretinogramma pieno campo (ERG) e potenziali evocati visivi (PEV) sono strumenti utili per valutare retina e l'integrità via visiva sia in ambito clinico e di laboratorio. Attualmente, le misure ERG e PEV preclinici sono eseguiti con l'anestesia per garantire posizionamento degli elettrodi stabili. Tuttavia, la presenza di anestesia ha dimostrato di contaminare le normali risposte fisiologiche. Per superare questi confonde anestesia, sviluppiamo una nuova piattaforma per saggiare ERG e PEV nei ratti coscienti. Gli elettrodi sono impiantati chirurgicamente sotto-conjunctivally sull'occhio per saggiare la ERG e epidurale sopra la corteccia visiva per misurare il VEP. Una gamma di ampiezza e di sensibilità / parametri di temporizzazione sono analizzati sia per la ERG e PEV ad aumentare le energie luminose. I segnali ERG e PEV sono dimostrato di essere stabile e ripetibile per almeno 4 settimane impiantazione post-chirurgico. Questa capacità di registrare i segnali ERG e PEV senza anestesia confonde nelle s precliniciEtting dovrebbe fornire la traduzione superiore ai dati clinici.

Introduzione

L'ERG e VEP sono minimamente invasiva in strumenti vivo per valutare l'integrità delle vie della retina e visivi, rispettivamente, sia in laboratorio e clinica. Il tutto campo ERG produce una forma d'onda caratteristica che può essere suddiviso in diverse componenti, con ogni elemento che rappresentano diverse classi di cellule del ^1,2 percorso della retina. Il classico pieno campo ERG forma d'onda consiste di una pendenza iniziale negativo (a onda), che ha dimostrato di rappresentare fotorecettori attività post esposizione alla luce ^2-4. L'a-onda è seguita da una sostanziale forma d'onda positiva (b-wave), che riflette l'attività elettrica di retina centrale, prevalentemente le cellule ON-bipolari ^5-7. Inoltre, si può variare l'energia luminosa e inter-stimolo-intervallo per isolare cono dalle risposte asta ^8.

Il flash VEP rappresenta potenziali elettrici del tronco della corteccia cerebrale e visiva in risposta alla stimolazione della retina luce^9,10. Questa forma d'onda può essere suddiviso in componenti precoce e tardiva, con la componente precoce che riflette l'attività dei neuroni della via retino-genicolo-striata ^11-13 e alla fine del componente che rappresenta l'elaborazione corticale esibito in varie lamine V1 nei ratti ^11,13. Pertanto la misurazione simultanea del ERG e PEV ritorna valutazione globale delle strutture coinvolte nel percorso visivo.

Attualmente, al fine di registrare elettrofisiologia negli animali, anestesia viene impiegato per consentire il posizionamento stabile di elettrodi. Ci sono stati tentativi di misurare ERG e PEV nei ratti coscienti ^14-16 ma questi studi impiegata una configurazione cablata, che può essere ingombrante e può portare a stress degli animali, limitando il movimento degli animali e il comportamento naturale ^17. Con i recenti progressi nella tecnologia wireless, tra cui una maggiore miniaturizzazione e la durata della batteria, è ora possibile implementare un approccio telemetria per ERG und registrazione VEP, diminuendo lo stress associato con le registrazioni cablate e migliorare la redditività a lungo termine. Implantologia stabili completamente interiorizzato di sonde di telemetria hanno dimostrato di essere efficace per il monitoraggio cronico della temperatura, la pressione del sangue ^18, l'attività ¹⁹ così come elettroencefalografia ^20. Tali progressi nella tecnologia sarà anche aiutare con ripetibilità e stabilità delle registrazioni coscienti, aumentando l'utilità della piattaforma per gli studi cronici.

Protocollo

Etica dichiarazione: Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con il Codice australiano per la cura e l'uso di animali a scopi scientifici (2013). approvazione etica animale è stato ottenuto dal Comitato Etico degli animali, Università di Melbourne. I materiali sono qui per esperimenti di laboratorio solo, e non destinati ad uso medico o veterinario.

1. Gli elettrodi Preparazione

Nota: Un trasmettitore a tre canali è usato per l'impianto chirurgico che consente 2 ERG e la registrazione 1 VEP essere condotta simultaneamente. I tre attivi e non attivi tre elettrodi devono essere pre-modellato in una forma ad anello prima dell'impianto in modo da collegare ad occhio. Ai fini dell'identificazione, il produttore ha racchiuso elettrodi attivi a metà bianco, guaine in plastica colorata mezzo mentre gli elettrodi inattive sono coperti in guaine colorate piene. L'elettrodo di massa (guaina di plastica trasparente) viene lasciato inalterato. Per tutti elettr attivo e inattivocondotta odi i punti 1.1, 1.2, 1.3 e 1.7.

1. Districare il doppio elettrodo di acciaio inossidabile flessibile con due belle pinze a punta.
2. Tagliare uno dei filoni in acciaio inox (circa 1 cm dalla punta), lasciando un unico filo più lungo rettilineo rimanente per modellare l'elettrodo ad anello.
3. Piegare il singolo filo di acciaio inossidabile di nuovo su se stesso e torsione, formando un anello liscio sulla punta dell'elettrodo.
4. Per elettrodi attivi moda ERG questo ciclo ~ 0,2 - 0,5 mm di diametro ruotando la base del ciclo (per gli scopi descritti qui, modellare due elettrodi attivi in ​​questo modo per registrare ERG da entrambi gli occhi), e per la ERG inattivo e elettrodi PEV rendono il diametro anello ~ 0,8 mm di diametro (in questo esempio, fare questo per un elettrodo VEP attiva e tutte tre elettrodi inattive).
5. Agganciare circolare VEP elettrodo attivo intorno una vite acciaio inossidabile (diametro 0,7 mm lunghezza 3 mm) per l'elettrodo appoggia contro la testa della vite.
6. Hook i 3 elettrodi inattivi (2 ERG, 1 PEV) intorno una seconda vite in acciaio inox (diametro 0,7 mm lunghezza 3 mm).
7. Tirare il manicotto di plastica in avanti sopra le estremità taglienti del filo in acciaio inox a due per ridurre l'irritazione.
8. Sterilizzare i trasmettitori telemetrici immergendola in 2% glutaraldeide per più di 10 ore a circa 25 ° C. Risciacquare il trasmettitore con soluzione salina sterile per 3 volte.

2. Trasmettitore impianto

1. Preparazione degli animali
   1. Disinfettare l'area chirurgica prima sperimentazione pulendo con il 70% di etanolo. Autoclave tutte apparecchi chirurgici prima dell'uso e mantenere in apparecchiature clorexidina quando non in uso durante la chirurgia. Coprire l'animale con un telo chirurgico durante l'intervento chirurgico per mantenere un ambiente sterile. Assicurarsi che tutti gli sperimentatori indossano maschere chirurgiche, guanti e camici sterili.
   2. Indurre l'anestesia con 1,5 - 2% isoflurano, ad una portata di 3 l / min e manutenzione suned a 1,5 - 2% a 2 L / min durante l'intervento chirurgico. Confermare la sufficiente profondità di anestesia dall'assenza di un riflesso pedale sul pizzicare il muscolo tra le dita.
   3. Rasatura a 40 mm Area x 30 mm sopra l'addome dall'alto all'inguine allo sterno.
   4. Rasatura 30 mm Area x 20 mm sopra la fronte, posteriormente agli occhi e anteriore alle orecchie.
   5. Disinfettare le due aree rasate. Per la zona della fronte disinfettare con 10% povidone-iodio tre volte (evitare l'uso di antisettici a base alcolica per l'area vicino all'occhio, essere coerente con la norma di condotta stabilito dalla Association of tecnologi chirurgici). Sopra l'addome disinfettare con 10% di iodio povidone e il 70% di etanolo.
   6. Applicare 1 goccia di proximetacaina alla cornea per ulteriori anestesia topica.
   7. Applicare 1 goccia di sodio carbossimetilcellulosa alla cornea per evitare l'essiccazione degli occhi.
2. impianto chirurgico
   1. Effettuare una incisione 10 millimetrisulla testa lungo la linea mediana verticale tra le orecchie con un bisturi chirurgico.
   2. Eseguire un'incisione 5 mm addome attraverso lo strato di pelle lungo la linea mediana sotto lo sterno.
   3. Tunnel a 5 mm di diametro cannula sottocutanea dall'incisione addome per l'incisione testa.
   4. Far passare i fili degli elettrodi (3 attivi e 3 inattivo) del trasmettitore attraverso la cannula dall'addome alla testa.
   5. Lasciare l'elettrodo di riferimento con la base del trasmettitore e coprire la punta dell'elettrodo con garza asettica.
   6. Coprire le punte degli elettrodi (3 attivi e inattivi 3) con garza asettica.
   7. Fissare la testa del topo ad una piattaforma stereotassico.
   8. Estendere l'incisione fronte a 30 mm di lunghezza con le forbici chirurgiche.
   9. Esporre area chirurgica ritraendo la pelle sciolto con 2 punti di sutura (3 - 0) a ~ 3 e 09:00.
   10. Raschiare il periostio sovrastante il cranio con garza sterile per esporre Bregma, lambda e della linea mediana suture.
   11. Praticare due fori attraverso il cranio al VEP attiva (7 millimetri ventrale a Bregma 3 millimetri laterale a linea mediana) e inattivi (5 mm rostrale al Bregma sulla linea mediana) stereotassica coordinate.
   12. Fissare VEP elettrodi attivi e inattivi con le viti pre-attached in acciaio inox (diametro 0,7 mm lunghezza 3 mm) per il cranio con un piccolo cacciavite a ~ 1 mm di profondità nei fori predefiniti. Questo ancora la vite all'osso senza danneggiare il tessuto corticale sottostante.
   13. Per impiantare gli elettrodi attivi ERG utilizzare un 8-0 sutura per rientrare temporaneamente la palpebra superiore.
   14. Inserire un 16 a 21 G cannula sottocutanea da dietro l'occhio attraverso la fornice congiuntivale superiore.
   15. Rimuovere l'ago guida.
   16. Feed l'elettrodo attivo attraverso il catetere di plastica accorciata dalla fronte verso l'occhio. Quindi rimuovere il catetere di plastica.
   17. Utilizzare una sutura temporanea (8 - 0.), che viene infilato attraverso il loop elettrodo, per evitare che i electrode dalla scomparsa di nuovo nel tunnel.
   18. Eseguire un'incisione 0,5 millimetri sulla congiuntiva superiore a ore 12, 1 mm dietro limbus. Utilizzare smussa per esporre la sclera sottostante.
   19. Impiantare un 8-0 o 9-0 sutura immediatamente dietro il limbus a metà spessore sclerale.
   20. Rimuovere sutura temporanea da ERG elettrodo attivo.
   21. Ancorare l'elettrodo attivo ERG alla metà sclerale sutura spessore legando 3 nodi consecutivi che assicurano la punta dell'elettrodo è situato vicino al limbus.
   22. Chiudere lo sportello congiuntivale con 1 o 2 punti staccati (8 - 0 a 9 - 0). Assicurarsi che la congiuntiva copre completamente l'elettrodo ERG per migliorare il comfort.
   23. Rimuovere la palpebra scomparsa di sutura.
   24. Ripetere la procedura per l'occhio controlaterale.
   25. Applicare il gel cianoacrilato sul cranio per fissare tutte le viti inox e fili degli elettrodi. Assicurarsi che gli elettrodi attivi ERG non sono tirati troppo stretto prima di fissare a eni movimenti degli occhi capaci.
   26. Chiudere la ferita alla testa con un non-assorbibile 3-0 di sutura.
   27. Ruotare roditore per esporre zona addominale. Allungare l'incisione cutanea addominale a 40 mm lungo la linea alba con le forbici chirurgiche.
   28. Effettuare una incisione 35 millimetri attraverso la parete muscolare interna per esporre la cavità addominale interna.
   29. Utilizzando due punti di sutura (3 - 0) fissare il corpo del trasmettitore a parete addominale interna lato destro dell'animale. Evitare il contatto con il fegato.
   30. Loop l'elettrodo di massa e sicuro in questa forma con una sutura (3-0). Posizionarlo libero di fluttuare nella cavità addominale.
   31. Chiudere il peritoneo con una sutura continua (3-0).
   32. Chiudere l'incisione pelle con punti staccati (3 - 0).
3. Cure post-operatorie
   1. Monitorare l'animale fino a che non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Casa l'animale singolarmente dopo l'intervento.
   2. somministrare carprofen sottocutanea per l'analgesia (5 mg / kg) una volta al giorno per 4 giorni.
   3. Aggiungere antibiotici per via orale profilattici (Enrofloxin, 5 mg / kg) per l'acqua potabile per 7 giorni dopo l'intervento chirurgico.
   4. Applicare una pomata antinfiammatoria per siti di incisione della pelle per ridurre l'irritazione per i primi 7 giorni dopo l'intervento chirurgico.

3. Comportamento ERG e PEV Recordings nel ratto conscio

1. Scuro adattarsi animale per 12 ore prima di registrazioni ERG e PEV
2. Condurre tutte le manipolazioni sperimentali sotto illuminazione fioca rosso (17,4 cd.m ^-2, λ _max = 600 nm)
3. Applicare anestesia topica (0,5% proximetacaina) e dilatando (0,5% tropicamide) scende alla cornea.
4. Guida il roditore consapevole in una misura, restrainer chiaro.
   Nota: La lunghezza di questo tubo di plastica può essere regolata per accogliere ratti di dimensioni diverse con il diametro complessivo fissato a 60 mm. L'estremità anteriore del dispositivo è rastremato per minimizzare mo testavimento e contiene perforazioni per consentire la respirazione normale. Questo fronte affusolata consente l'allineamento e la stabilizzazione della testa e gli occhi del ratto all'apertura della sfera Ganzfeld. Si noti che il roditore è stato acclimatato al dispositivo di immobilizzazione (da 3 a 5 volte) prima di un intervento chirurgico.
5. Posizionare il roditore anteriore della ciotola Ganzfeld con gli occhi allineati con l'apertura del contenitore.
6. Accendere il trasmettitore a permanenza passando un magnete all'interno di ~ 5 cm del trasmettitore. Verificare che il trasmettitore è acceso controllando la luce LED di stato sulla base del ricevitore.
7. Raccogliere segnali su un intervallo di energie luminose (cioè, -5.6 a 1,52 log cd.sm ^-2) come descritto in precedenza ^21. In breve, più segnali medi a livello commutazione luce (~ 80 ripetizioni), inferiore a energie più luminosi luminosi (~ 1 ripetizione). A poco a poco allungare l'intervallo interstimulus da 1 a 180 secondi dal più debole al livello di luce più brillante.
8. Per isolare l'asta ERGe le risposte cono utilizzano un paradigma twin-Flash ^8. Ad esempio, avviare due flash a 1,52 log cd.sm ^-2 con un intervallo di 500 msec inter-stimolo in-between.
9. Per registrare i segnali VEP, media di 20 ripetizioni alle energie più luminoso luminosi (cioè 1,52 log cd.sm ^-2, 5 sec intervallo inter-stimolo).
10. Per valutare la stabilità dell'impianto, che viene valutato dalla variabilità del segnale nel tempo, condurre ERG e PEV registrazioni 7, 10, 14, 21 e 28 giorni post-intervento chirurgico.
11. Dopo periodo sperimentale, eutanasia topi mediante iniezione intracardial di pentobarbiturate (1,5 ml / kg) dopo ketamina: anestesia xilazina (12: 1 mg / kg).

Risultati

La risposta fotorecettore viene analizzato montando una gaussiana ritardata al bordo anteriore del tratto discendente iniziale della risposta ERG gli ultimi 2 energie luminose (1,20, 1,52 log CSM ^-2) per ciascun animale, in base al modello di agnello e Pugh ^22, formulato da Hood e Birch ^23. Questa formula restituisce una ampiezza ed un parametro di sensibilità, (Figura 1C e 1D, rispettivamente). Una funzione iperbolica f...

Discussione

A causa della natura mini-invasiva di elettrofisiologia visiva, ERG e PEV registrazioni in pazienti umani sono condotte in condizioni coscienti e richiedono solo l'uso di anestetici topici per il posizionamento degli elettrodi. Al contrario, elettrofisiologia visiva nei modelli animali è convenzionalmente condotto in anestesia generale per consentire il posizionamento degli elettrodi stabile, eliminando gli occhi del corpo e movimenti volontari. Tuttavia, anestetici generali comunemente utilizzati alterano le rispo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioamplifier	ADInstruments	ML 135	Amplifies ERG and VEP signals
Carboxymethylcellulose sodium 1.0%	Allergan	CAS 0009000-11-7	Maintain corneal hydration during surgery
Carprofen 0.5%	Pfizer Animal Health Group	CAS 53716-49-7	Post-surgery analgesia, given with injectable saline for fluid replenishment
Chlorhexadine 0.5%	Orion Laboratories	27411, 80085	Disinfection of surgical instrument
Cyanoacrylate gel activator	RS components	473-439	Quickly dries cyanoacrylate gel
Cyanocrylate gel	RS components	473-423	Fix stainless screws to skull
Dental burr	Storz Instruments, Bausch and Lomb	E0824A	Miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws
Drill	Bosch	Dremel 300 series	Automatic drill for trepanning
Enrofloxin	Troy Laboratories		Prophylactic antibiotic post surgey
Ganzfeld integrating sphere	Photometric Solutions International		Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size
Gauze swabs	Multigate Medical Products Pty Ltd	57-100B	Dries surgical incision and exposed skull surface during surgery
Isoflurane 99.9%	Abbott Australasia Pty Ltd	CAS 26675-46-7	Proprietory Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery
Kenacomb ointment	Aspen Pharma Pty Ltd		To reduce skin irritation and itching after surgery
Luxeon LEDs	Phillips Lighting Co.		For light stimulation, twenty 5 W and one 1 W LEDs, controlled by Scope software
Needle (macrosurgery)	World Precision Instruments	501959	for suturing abdominal and head surgery, used with 3 - 0 suture, eye needle, cutting edge 5/16 circle Size 1, 15 mm
Needle holder (macrosurgery)	World Precision Instruments	500224	To hold needle during abdominal and head surgery
Needle holder (microsurgery)	World Precision Instruments	555419NT	To hold needle during ocular surgery
Optiva catheter	Smiths Medical International LTD	16 or 21 G	Guide corneal active electrodes from skull to conjunctiva
Povidone iodine 10%	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml
Powerlab data acquisition system	ADInstruments	ML 785	Acquire signal from telemetry transmitter, paired to telemetry data converter
Proxymetacaine 0.5%	Alcon Laboratories	CAS 5875-06-9	Topical ocular analgesia
Restrainer	cutom made		Front of the restrainer is tapered to minimize head movement, length can be adjusted to accommodate different rat length, overall diameter is 60 mm.
Scapel blade	R.G. Medical Supplies	SNSM0206	For surgical incision
Scissors (macrosurgery)	World Precision Instruments	501225	for cutting tissue on the abodmen and forhead
Scissors (microsurgery)	World Precision Instruments	501232	To dissect the conjunctiva for electrode attachment
Scope Software	ADInstruments	version 3.7.6	Simultaneously triggers the stimulus via the ADI Powerlab system and collects data
Shaver	Oster	Golden A5	Shave fur from surgical areas
Stainless streel screws	MicroFasteners	L001.003CS304	0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length
Stereotaxic frame	David Kopf	Model 900	A small animal stereotaxic instrument for locating the implantation landmarks on the skull
Surgical drape	Vital Medical Supplies	GM29-612EE	Ensure sterile enviornment during surgery
Suture (macrosurgery)	Ninbo medical needles	3-0	for suturing abdominal and head surgery, sterile silk braided, 60 cm
Suture needle (microsurgery)	Ninbo medical needles	8-0 or 9-0	for ocular surgery including, suturing electrode to sclera and closing conjunctival wound, nylon suture, 3/8 circle 1 × 5, 30 cm
Telemetry data converter	DataSciences International	R08	allows telemetry signal to interface with data collection software
Telemetry Data Exchange Matrix	DataSciences International		Gathers data from transmitters, pair with receiver
Telemetry data receiver	DataSciences International	RPC-1	Receives telemetry data from transmitter
Telemetry transmitter	DataSciences International	F50-EEE	3 channel telemetry transmitter
Tropicamide 0.5%	Alcon Laboratories		Iris dilation
Tweezers (macrosurgery)	World Precision Instruments	500092	Manipulate tissues during abdominal and head surgery
Tweezers (microsurgery)	World Precision Instruments	500342	Manipulate tissues during ocular surgery