Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

Résumé

blessures rénales survenant à partir de néphrotoxines, qui comprennent des médicaments allant des antibiotiques aux agents chimiothérapeutiques, peuvent entraîner des troubles complexes dont la pathogénie reste mal compris. Ce protocole montre comment zebrafish peut être utilisé pour la modélisation de la maladie de ces conditions, qui peuvent être appliquées à l'identification des mesures néphroprotecteurs.

Résumé

Les reins sont susceptibles de nuire à l'exposition aux produits chimiques qu'ils filtrent de la circulation sanguine. Cela peut conduire à des blessures d'organes associée à une diminution rapide de la fonction rénale et le développement du syndrome clinique connu comme l'insuffisance rénale aiguë (IRA). Les agents pharmacologiques utilisés pour traiter des circonstances médicales allant de l'infection bactérienne au cancer, lorsqu'ils sont administrés seuls ou en combinaison avec d'autres médicaments, peuvent initier AKI. Zebrafish sont un modèle animal utile pour étudier les effets chimiques sur la fonction rénale in vivo, car ils forment un rein embryonnaire composé d'unités fonctionnelles du nephron qui sont conservés avec les vertébrés supérieurs, y compris les humains. En outre, le poisson zèbre peut être utilisé pour réaliser des écrans génétiques et chimiques, qui permettent d'élucider les aspects cellulaires et moléculaires de AKI et élaborer des stratégies thérapeutiques telles que l'identification de molécules néphroprotecteurs. Ici, nous montrons comment microinjection dans leembryon de poisson zèbre peut être utilisé comme un paradigme pour les études de néphrotoxine.

Introduction

AKI est une perte soudaine de la fonction rénale qui peut conduire à des conséquences dévastatrices sur la santé ^1. AKI est un important problème de santé dans le monde entier en raison de sa forte incidence d'environ 20% chez les patients hospitalisés, avec des taux encore plus élevés de 30-50% dans les cas de soins intensifs et les personnes âgées, et les taux de 50-70% ^1-3 de mortalité. Malheureusement, la prévalence de l'AKI a augmenté et devrait grimper encore au cours de la prochaine décennie, en partie à cause de la diversité des facteurs qui peuvent induire des AKI, qui comprennent le stress post-opératoire, l'ischémie, et l'exposition à néphrotoxines tels que les antibiotiques et des médicaments chimiothérapeutiques ^4.

Insuffisance rénale aiguë implique des lésions cellulaires soudaine dans le rein, se produisant fréquemment dans néphrons, qui sont les unités fonctionnelles essentielles, et sont constitués d'un filtre à sang et un tube segmentée qui draine l' urine dans les conduits collecteurs centraux ^1. Quand un nombre important de néphrons sontendommagé pendant AKI, les effets immédiats comprennent une interruption de la clairance des déchets de la circulation, et l' écoulement de fluide réduite ou abrogée par néphrons en raison de l' obstruction de morts et mourants cellules ^1. Au fil du temps, l' obstruction tubulaire peut conduire à une dégénérescence des néphrons entières, ce qui réduit de façon permanente la fonction rénale ^1. Altérations physiologiques dans le rein suivantes AKI impliquent également des événements inflammatoires complexes qui peuvent conduire à la cicatrisation chronique ^1.

En dépit de ces résultats, les néphrons ont une certaine capacité à subir la régénération après AKI qui reconstitue l'épithélium tubulaire ^5,6. Bien qu'il y ait eu une compréhension moléculaire croissante des néphrons régénération, les mécanismes restent insaisissables à bien des égards et nécessitent la poursuite des recherches ^7. Le degré auquel les résultats AKI dans les lésions rénales permanentes reste également inconnu. Les recherches actuelles suggèrent le potentiel de régénération pour le rein est lele plus élevé suivant les cas moins graves de AKI, alors que les épisodes plus prononcés ou répétées conduisent à une maladie rénale chronique (CKD) et aboutir à phase terminale de maladie rénale (STIR) qui nécessite une transplantation ou une dialyse ^8,9 sauver la vie. En outre, les personnes souffrant déjà de CKD sont à un risque encore plus élevé de contracter un épisode sévère de AKI ^8,9. Pris ensemble, il est clair que la poursuite de la recherche fondamentale et clinique est essentiel de comprendre, traiter et prévenir AKI.

La recherche avec des modèles animaux a joué un rôle dans l' appréciation de la progression des altérations locales et environnementales qui se produisent pendant AKI ^10. Pour développer cette compréhension ainsi que de développer de nouvelles thérapies, le modèle animal zebrafish a été utilisé dans une variété de façons ^11,12. Les néphrons du rein zebrafish, à la fois dans l'embryon et l' adulte, présentent un degré élevé de conservation des mammifères ^13-16. En outre, une lésion épithéliale néphron dans zebrafish ressemble au processus chez les vertébrés supérieurs, de sorte que la destruction locale de cellules tubulaires est suivie par une prolifération intratubulaire et le rétablissement de l' architecture des néphrons ^17-19. Dans l'embryon, cependant, d' importants dégâts tubule des néphrotoxines comme le cisplatine est associé à létalité ^20,21. Par comparaison, les adultes survivent AKI poisson zèbre et présentent des capacités de régénération de fond dans le rein. Par exemple, suite à une exposition à l'antibiotique gentamicine aminoglycoside, zebrafish régénérer tubule lésions épithéliales et développer de nouvelles unités de néphrons ainsi ^22-24. Bien que ces études AKI induite par la gentamicine ont fourni des renseignements précieux, la compréhension des lésions rénales à partir de divers néphrotoxines reste critique pour apprécier les effets et la réponse aux différents types de dommages ^25.

L'embryon de poisson zèbre, en raison de sa taille, la transparence et la traçabilité génétique, présente de nombreux avantages pour les études de néphrotoxine ^{25, où la méthode de microinjection 20,21 est utilisé pour administrer la molécule (s) pour enquête. Néphrons sont formés par 24 heures après la fécondation (HPF) et commencent à filtrer le sang d'environ 48 HPF 26,27. Ainsi, la formation rapide et la fonction du rein embryonnaire facilite l'analyse expérimentale. Cependant, le processus de microinjection a des défis techniques et il peut y avoir une courbe d'apprentissage abrupte à la maîtrise de la technique. Dans cet article, vidéo, nous décrivons comment effectuer microinjections et de fournir des conseils de dépannage afin d'améliorer le taux d'injections réussies.}

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Protocole

Les procédures pour travailler avec des embryons de poisson zèbre décrits dans le présent protocole ont été approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'Université de Notre Dame.

1. Préparation des solutions

1. Faire une solution 50x stock de E3 médias d'embryons en mélangeant 73,0 g NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g de CaCl _2, et 9,95 g MgSO ₄ à 5 litres d'eau distillée, et conserver à la température ambiante.
2. Pour la culture des embryons de poisson zèbre, diluer la solution 50x stock de E3 médias d'embryons disponibles à une solution de travail 1x avec de l'eau distillée, puis ajouter 200 pi de 0,05% de bleu de méthylène à chaque 1 L de 1x E3 à agir comme un fongicide, et conserver à TA.
3. Faire une solution de pigmentation de blocage de l'E3 médias d'embryons avec 0,003% de 1-phényl-2-thiourée (PTU) en combinant 40 ml de 50x E3 actions avec 0,06 mg PTU. Ensuite, porter le volume à un total de 2 L avec de l'eau distillée.
4. Agiter le O E3 / PTU / N à la température ambiante pour obtenir la poudre PTU en solution. Puis stocker l'E3 / PTU àTA.
   Note: L'E3 / PTU a une durée de vie d'environ une semaine, et des solutions plus âgés seront moins efficaces pour bloquer le développement de la pigmentation chez les larves de poisson zèbre.
5. Préparer une solution anesthésique de 0,2% tricaïne (MS-222) en ajoutant 1 g de tricaïne à 500 ml d'eau distillée et d'ajuster le pH à 7,2 avec 1 M de Tris, pH 9,5.
6. Préparer pour préparer une solution de méthylcellulose à 2% pour l' imagerie en plaçant une solution de 1 x E3 (pas de bleu de méthylène), avec ^1/10 volume de 0,2% Tricaine ajouté à 4 ° C.
   Remarque: La solution méthylcellulose est une solution épaisse, claire qui est utilisée pour stabiliser doucement embryons vivants pour la microscopie. Après les manipulations sont effectuées les embryons peuvent être lavés dans 1x E3 pour dissoudre le méthylcellulose sans blesser l'animal et permettant la microscopie à des stades ultérieurs dans le même échantillon.
7. Une fois refroidi à 4 ° C, agiter la solution 1x E3 / Tricaine vigoureusement sur une plaque d'agitation et ajouter graduellement la quantité appropriée de méthylepoudre de cellulose tout en continuant à remuer vigoureusement. ajouter graduellement la poudre à la solution pour empêcher la formation d'agrégats insolubles de méthylcellulose.
8. Après tout, la poudre est mélangée dans la solution de méthylcellulose / E3 / tricaïne de 2%, agiter la solution composite dans le 4 ° C chambre froide O / N.
   Remarque: La température froide est préférable pour dissoudre complètement la poudre. Si la solution est pas claire après une nuit, agiter pendant une journée de travail supplémentaire et / ou une seconde O / N.
9. Pour éliminer les bulles d'air de la méthylcellulose à 2% / solution / de tricaïne E3, aliquote le mélange dans 1,5 ml tubes et essorage à grande vitesse (12 000 xg) à 4 ° C pendant 30 min ou jusqu'à 2 heures.
10. Placer la solution / E3 / Tricaine de méthylcellulose à 2% à 4 ° C pour une conservation à long terme.
    Note: Avant l'utilisation, des aliquotes doivent être pré-chauffé à la température ambiante pour travailler avec les échantillons de poisson zèbre.

2. Préparation des outils

1. Préparer un outil embryon manipulateur, utilisé pour popositionne- embryons pour la microinjection, en attachant une pointe de chargement de gel à l'extrémité d'une aiguille droite de dissection 5 ", et le fixer avec du ruban adhésif ou superglue.
2. Préparer des aiguilles de microinjection à l'aide d'un extracteur d'aiguille, en plaçant d'abord un feu brillant 10 cm en verre borosilicate avec des filaments dans l'instrument et fixer le verre borosilicate en serrant les poignées.
3. Tirez le verre borosilicate à la mode des aiguilles fines effilées. Utilisez les paramètres suivants: la chaleur 540, tirer 245, vitesse 200, et le temps 125.
4. La place des aiguilles à l'intérieur d'une boîte de Pétri, de les suspendre sur une bande de pâte à modeler pour protéger les pointes d'aiguille, et de garder le plat couvert pour éviter l'accumulation de poussière.
5. Pour terminer la préparation de l'aiguille pour microinjections, utilisez un bord de lame de rasoir ou une pince fine pour couper l'extrémité tirée de l'aiguille pour créer une pointe d'injection angulaire forte avec un diamètre d'environ 0,05-0,1 mm.
6. Pour rendre le plateau de micro-injection, préparer une solution à 1,5% d'agarose / E3 dans un 100 ml Erlenmeyer de et dissoudre l'agarose en chauffant l'E3 à ébullition dans un four micro-ondes puis laisser refroidir à température ambiante pendant environ 10 min.
7. Verser la solution d'agarose / E3 refroidi dans une boîte de Pétri pour faire une fondation avec une profondeur d'environ 0,5 cm. Lorsque cela est solidifiée verser une seconde couche ayant une profondeur d'environ 0,3 cm et insérer le moule préfabriqué embryon de puits et permettre l'agarose se solidifie à température ambiante.
   Remarque: Lors de l'introduction du moule dans la couche / E3 supérieure d'agar, en plaçant le moule dans la gélose à un angle pour diminuer le nombre de bulles d'air.
8. Lorsque l'ensemble du plateau de microinjection a mis, soulever l'embryon préfabriqué et la moisissure lentement et avec précaution en utilisant un scoopula, puis remplir le plat avec une solution E3 et conserver à 4 ° C.

3. Embryo Préparation

1. Mettre en place des réservoirs d'accouplement de poisson zèbre en plaçant des séparateurs dans des chambres d'accouplement et remplir avec de l'eau du système.
2. Placer un poisson de chaque côté du diviseur deuch que chaque chambre d'accouplement contient une femelle et un poisson mâle, et couvrir chaque chambre d'accouplement.
3. Le lendemain matin, enlever les diviseurs pour permettre la ponte.
4. Vérifiez le poisson au bout d'environ 30 minutes, et après le retour des adultes à l'aquarium, de recueillir leurs embryons en faisant passer l'eau du réservoir d'accouplement à travers un outil de crépine fil-maille fine.
5. Inversez la crépine sur une boîte de Pétri et rincer à l'E3 pour recueillir les embryons.
6. Incuber les embryons à 28,5 ° CO / N.
7. Lorsque les embryons ont atteint le stade 24-26 somites ^26, transvaser la plupart des médias E3 puis dechorionate en ajoutant 100 pi de 50 mg / ml de pronase à chaque plat d'embryons et l' incubation du plat à température ambiante (23 ° C) pendant environ 15 min.
   Remarque: Il faudra environ 24-25 heures à partir du moment de la fécondation pour les embryons atteignent le stade 24-26 somites si elles sont recueillies de la manière décrite et incubé O / N à 28,5 ° C.
8. Remplissez le plat avecE3 puis agiter doucement pour déloger les chorions des embryons.
9. Décanter le E3 / pronase et rincer le plat avec 25 ml d'E3 frais. Répétez l'étape de rinçage pour éliminer tous les pronase.
10. Pour bloquer le développement de la pigmentation, transvaser l'E3 et le remplacer par 25 ml de frais E3 / PTU lorsque les embryons ont atteint 24 heures après la fécondation.
    Remarque: Pour des expériences sur plusieurs jours, remplacer la solution E3 / PTU avec un milieu frais une fois par jour pour garder le plat propre.

4. microinjection de Solution néphrotoxine

1. Le jour de l'injection, la préparation de la solution de néphrotoxine souhaitée avec la commande d'un véhicule approprié.
2. Vortex ou mélanger doucement pour assurer la drogue (s) est / sont en solution, en vérifiant les côtés du tube et le haut de la colonne d'eau.
   Remarque: Les solutions de néphrotoxine peuvent être préparés pour contenir des quantités infimes de dextran conjugué fluorescence pour surveiller l'efficacité de microinjection et également évaluer la clairance rénale au subseqsouligne le temps uent ^20,28.
3. Chargez une aiguille de microinjection garnie de ~ 2-3 pi du néphrotoxine en enfilant une pointe de chargement de gel fine dans le dos de l'aiguille et de suspendre l'aiguille verticalement avec un morceau de ruban adhésif pour permettre à la solution pour remplir la pointe de l'aiguille taillée par gravité.
4. Une fois que la pointe de l'aiguille est plein, fixer l'aiguille chargée dans le micromanipulateur.
5. Tester le volume de micro-injection en plaçant une goutte d'huile minérale sur un micromètre et injecter dans l'huile pour évaluer la taille des gouttelettes. Un volume d'injection de 500 pl a un diamètre de 0,1 mm.
6. Retirer le plat d'embryons de l'incubateur, et anesthésier en ajoutant environ 5 ml de 0,2% Tricaine à l'antenne de l'embryon.
7. Pour assurer une anesthésie complète, toucher doucement l'embryon avec la pointe de l'outil embryon manipulateur. Le manque de mouvement indique anesthetization suffisante.
8. Après anesthésie réussie, transférer les embryons dans le moule d'injection avec un transfer pipette.
9. Manœuvrer chaque embryon dans un puits différent du moule placer la tête dans la zone la plus profonde du puits de telle sorte que le tronc repose le long de la dépression et la queue colle jusqu'à sortir de la dépression.
10. Insérez l'aiguille remplie dans le micromanipulateur et positionner la pointe de l'aiguille à côté d'un embryon.
11. Insérez délicatement l'aiguille dans le récipient de queue en déplaçant la manette vers l'avant et appuyer sur la pédale pour fournir la microinjection.
    Remarque: l'injection réussie peut être mesurée en observant le liquide entrer circulation. En outre, la co-injection du dextran nephrotoxicant conjugué fluorescent permet au chercheur de vérifier l'injection avec succès à la suite de la procédure.
12. Tirez doucement sur la manette pour retirer l'aiguille de l'embryon.
13. Après l'injection, transférer les embryons à un plat propre et rincer pour enlever le Tricaine et remplacer avec des produits frais E3 / PTU.
14. Incuber l'embryon jusqu'au point de temps souhaité pour évaluers morphologie, qui peut être documenté par la photographie dans un milieu de montage de la méthylcellulose, ou un procédé pour l'analyse expérimentale comme souhaité.
    Remarque: La récupération des embryons doit être évaluée afin de déterminer le pourcentage de personnes ayant un oedème, qui indique généralement une lésion rénale.

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Résultats

Une station de microinjection mis en place comprend un stéréomicroscope, micromanipulateur et régulateur de pression (figure 1A). Transillumination de la plaque d'injection est préférable d'afficher des échantillons au cours de cette procédure (figure 1B). Préparation de l'aiguille d'injection consiste à tirer le verre borosilicate approprié, suivie par la préparation de l'arête de coupe et, enfin, avec chargement par l...

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Discussion

Un nombre varié d'agents thérapeutiques ont été associés à AKI ^29. Il y a eu des progrès importants travaux de recherche dans la compréhension des dommages induits par de nombreux composés individuels, tels que la gentamicine aminoglycoside ³⁰ et le cisplatine chimiothérapeutique largement utilisé ^31,32. Certains changements pathologiques impliqués dans ces conditions, cependant, restent l'objet d'une étude en cours. Un défi émergent reste à comprendre comment...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	American Bioanalytical	AB01915
Potassium Chloride	American Bioanalytical	AB01652
Calcium Chloride	American Bioanalytical	AB00366
N-Phenylthiourea (PTU)	Aldrich Chemistry	P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)	Fluka Analytical	A5040
Borosilicate glass	Sutter Instruments Co.	BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instruments Co.	Mo. P097
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60 mm x 15 mm	VWR	25373-085
100 mm x 15 mm	VWR	25373-100
(microinjection tray) 150 mm x 15 mm	VWR	25373-187
Low Temperature Incubator	Fischer Scientific	11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010
Micrometer	Ted Pella, Inc.	2280-24