Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

Resumo

lesões renais decorrentes de nefrotoxinas, que incluem drogas que variam de antibióticos para quimioterápicos, pode resultar em doenças complexas, cuja patogênese permanece incompletamente compreendida. Este protocolo demonstra como peixe-zebra pode ser utilizado para modelar doenças destas condições, que podem ser aplicados para a identificação de medidas renoprotetor.

Resumo

Os rins são suscetíveis a danos causados ​​por exposição a produtos químicos que filtram da corrente sanguínea. Isso pode levar a lesões de órgãos associada a um rápido declínio da função e desenvolvimento da síndrome clínica conhecida como lesão renal aguda (LRA) renal. Os agentes farmacológicos usados ​​para tratar condições médicas que variam de infecção bacteriana para cancro, quando administrados individualmente ou em combinação com outras drogas, pode iniciar LRA. Os peixes-zebra são um modelo animal útil para o estudo dos efeitos químicos sobre a função renal, in vivo, uma vez que formam um rim embrionário composta de unidades de nefrónios funcionais que são conservados com vertebrados superiores, incluindo seres humanos. Além disso, o peixe-zebra pode ser utilizado para realizar telas genéticos e químicas, que fornecem oportunidades para elucidar as facetas celulares e moleculares de AKI e desenvolver estratégias terapêuticas tais como identificação de moléculas nefroprotector. Aqui, demonstramos como microinjeção noembrião do peixe-zebra pode ser utilizado como um paradigma para estudos nefrotoxina.

Introdução

LRA é uma perda abrupta da função renal que pode conduzir a consequências devastadoras saúde ^1. AKI é uma questão importante de saúde em todo o mundo devido à sua alta incidência de aproximadamente 20% entre os pacientes hospitalizados, com taxas ainda maiores de 30-50% em casos de cuidados críticos e os idosos, e as taxas de mortalidade de 50-70% ^1-3. Infelizmente, a prevalência de AKI tem vindo a aumentar e está projetado para aumentar ainda mais durante a próxima década, em parte devido à diversidade de fatores que podem induzir AKI, que incluem stress pós-operatório, isquemia e exposição a nefrotoxinas como antibióticos e ⁴ fármacos quimioterapêuticos.

LRA envolve dano celular súbita dentro do rim, que ocorre comumente na nefrónios, que são as unidades funcionais essenciais, e são constituídos por um filtro de sangue e um túbulo segmentada que drena a urina em condutas de recolha central ^1. Quando um número significativo de néfrons sãodanificada durante LRA, os efeitos imediatos incluem uma interrupção na depuração de resíduos a partir da circulação, e reduzida ou abolida através de fluxo de fluido nefrónios devido à obstrução de células mortas e moribundas ^1. Ao longo do tempo, a obstrução tubular pode levar à degeneração de nefrónios inteiras, o que reduz de forma permanente da função renal ^1. Alterações fisiológicas no rim seguintes AKI também envolvem eventos inflamatórios que podem levar a cicatrizes crônica ^1.

Apesar destes resultados, néfrons têm alguma capacidade de se submeter a regeneração após AKI que reconstitui a ^5,6 epitélio tubular. Embora tenha havido uma compreensão molecular crescente de regeneração néfron, os mecanismos são ainda imperceptíveis em muitos aspectos e necessitam continuou investigação ^7. O grau em que LRA resulta em dano renal permanente também permanece desconhecida. A investigação actual sugere o potencial de regeneração para o rim é omaior seguinte casos menos graves de AKI, enquanto episódios mais pronunciados ou repetidas levar à doença renal crônica (DRC) e culminam com doença renal terminal (DRT) que requer transplante ou diálise ^8,9 salva-vidas. Além disso, os indivíduos que já sofrem de doença renal crônica têm um risco ainda maior de contrair um episódio grave de AKI ^8,9. Tomados em conjunto, é claro que continuou pesquisa básica e clínica é vital para compreender, tratar e prevenir a AKI.

A pesquisa com modelos animais tem sido fundamental para apreciar a progressão de alterações locais e ambientais que ocorrem durante AKI ^10. Para expandir este entendimento, bem como desenvolver novas terapias, o modelo animal peixe-zebra foi empregada em uma variedade de formas ^11,12. Os nefrónios do rim do peixe-zebra, tanto no embrião e do adulto, apresentam um elevado grau de conservação com mamíferos ^13-16. Além disso, lesão epitelial nephron em zebrafish se assemelha ao processo em vertebrados superiores, em que a destruição local de células tubulares é seguida pela proliferação intratubular e restabelecimento da arquitectura nefrónios ^17-19. No embrião, no entanto, grandes danos túbulo das nefrotoxinas como cisplatina está associado com letalidade ^20,21. Em comparação, os adultos de peixe-zebra sobreviver AKI e exibem capacidades regenerativas substantivas no rim. Por exemplo, após a exposição ao antibiótico aminoglicósido gentamicina, peixe-zebra regenerar dano epitelial dos túbulos e crescer novas unidades de nefrónios bem como ^22-24. Embora esses estudos LRA induzida por gentamicina ter fornecido informações valiosas, entendendo dano renal de diversas nefrotoxinas permanece crítica para apreciar os efeitos e resposta a diferentes tipos de danos ^25.

O embrião de peixe-zebra, devido ao seu tamanho, transparência e rastreabilidade genética, tem muitos benefícios para estudos nefrotoxina ^{25, em que o método de microinjecção 20,21 é utilizado para administrar a molécula (s) para a investigação. Néfrons são formados por 24 horas após a fertilização (hpf) e começar a filtrar o sangue por cerca de 48 hpf 26,27. Assim, a rápida formação e a função do rim embrionário facilita a análise experimental. No entanto, o processo de microinjeção tem desafios técnicos e não pode haver uma curva de aprendizagem para dominar a técnica. Neste artigo de vídeo, que descrevem como realizar e proporcionar microinjections dicas de resolução de problemas, a fim de aumentar a taxa de sucesso de injecções.}

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Protocolo

Os procedimentos para trabalhar com embriões de peixe-zebra descritos neste protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Notre Dame.

1. Preparação de Soluções

1. Adicione uma solução de estoque de 50x E3 meios embrião por mistura de 73,0 g de NaCl, 3,15 g de KCl, 9,15 g _{de CaCl2,} e 9,95 g de _MgSO4 em 5 L de água destilada, e armazenamento à temperatura ambiente.
2. Para a cultura de embriões de peixe-zebra, dilui-se a solução 50x estoque de E3 estoque meios embrião para uma solução de trabalho de 1 x com água destilada, depois adicionar 200 mL de 0,05% de azul de metileno para cada uma L de 1x E3 para actuar como um fungicida, e armazenar a RT.
3. Adicione uma solução de bloqueio de pigmentação E3 meios embrião com 0,003% de 1-fenil-2-tioureia (PTU) através da combinação de 40 ml de solução stock 50x E3 com 0,06 mg PTU. Em seguida, levar o volume a um total de 2 L com água destilada.
4. Agita-se a O E3 / PTU / N à temperatura ambiente para obter o pó PTU na solução. Em seguida, armazenar o E3 / PTU naRT.
   Nota: O E3 / PTU possui uma vida útil de aproximadamente uma semana, e as soluções mais antigas vai ser menos eficaz em bloquear o desenvolvimento de pigmentação em larvas de peixe-zebra.
5. Adicione uma solução anestésica de 0,2% tricaina (MS-222) por adição de 1 g de tricaina a 500 ml de água destilada e ajustar o pH a 7,2 com Tris 1 M, pH 9,5.
6. Prepare-se para fazer uma solução de metilcelulose a 2% para imagiologia por colocação de uma solução de 1x E3 (sem azul de metileno), com ^1/10 do volume de 0,2% tricaina adicionado a 4 ° C.
   Nota: A solução de metilcelulose é uma solução de espessura, claro que é usado para estabilizar suavemente embriões vivos para microscopia. Depois de manipulações são realizados os embriões podem ser lavados em 1x E3 para dissolver a metilcelulose sem ferir o animal e permitindo a microscopia em fases posteriores na mesma amostra.
7. Quando arrefecida a 4 ° C, agita-se a solução 1x E3 / tricaina vigorosamente numa placa de agitação e adicionar gradualmente a quantidade apropriada de cloridrato depó de celulose, continuando a agitar vigorosamente. Gradualmente adicionar o pó à solução para prevenir a formação de agregados insolúveis de metilcelulose.
8. Depois que todo o pó é misturado na solução de metilcelulose / E3 / tricaina 2%, agita-se a solução de composto em 4 ° C, a sala de frio S / N.
   Nota: A temperatura fria é melhor para dissolver completamente o pó. Se a solução não for límpida após uma noite, agita-se durante um dia de trabalho adicional e / ou um segundo S / N.
9. Para remover as bolhas de ar a metilcelulose a 2% / solução / tricaina E3, aliquota-se a mistura em tubos de 1,5 ml e giram a alta velocidade (12.000 xg) a 4 ° C durante 30 min ou até 2 horas.
10. Coloque a solução / E3 / tricaina metilcelulose a 2% a 4 ° C para armazenamento a longo prazo.
    Nota: Antes do uso, alíquotas deve ser pré-aquecido até à temperatura ambiente para trabalhar com os espécimes de peixe-zebra.

2. Preparação de Ferramentas

1. Prepare uma ferramenta embrião manipulador, usado para positioning embriões para microinjecção, anexando uma ponta de carga do gel na ponta de uma "agulha de dissecação 5 linear e seguro com fita ou supercola.
2. Prepare agulhas microinjeção usando um extrator de agulhas, colocando primeiro um fogo polido 10 centímetros de vidro de borosilicato com filamento no instrumento e fixe o vidro de borosilicato, apertando os punhos.
3. Puxe o vidro de borosilicato de moda finas agulhas-cônicos. Utilize as seguintes definições: aquecer 540, puxe 245, velocidade 200 e 125 tempo.
4. Coloque as agulhas dentro de uma placa de Petri, suspendendo-os em uma tira de massa de modelar para proteger as pontas das agulhas, e manter o prato coberto para evitar o acúmulo de poeira.
5. Para terminar de preparar a agulha para microinjeções, use uma borda lâmina de barbear ou uma pinça fina para cortar o final puxou da agulha para criar uma ponta de injecção angular afiada com um diâmetro de cerca de 0,05-0,1 mm.
6. Para fazer com que o tabuleiro de microinjecção, preparar uma solução de 1,5% de agarose / E3 em um 100 ml frasco Erlenmeyer e dissolver a agarose por aquecimento a E3 a uma fervura num forno de microondas, em seguida, deixa-se arrefecer à temperatura ambiente durante cerca de 10 min.
7. Verter a solução de agarose / E3 arrefecida para uma placa de Petri de fazer uma base com uma profundidade de aproximadamente 0,5 cm. Quando isso tiver solidificado derramar uma segunda camada com uma profundidade de aproximadamente 0,3 cm, e inserir o molde pré-fabricado e embrião bem permitir que a agarose solidificar à temperatura ambiente.
   Nota: Quando da inserção do molde para a camada / E3 de agar de topo, colocando o molde em agar em um ângulo para diminuir o número de bolhas de ar.
8. Quando a bandeja toda a microinjecção definiu, levante o embrião pré-fabricada bem moldar para fora lentamente e com cuidado usando um scoopula, em seguida, encher o prato com solução E3 e armazenar a 4 ° C.

3. Preparação de Embriões

1. Configurar tanques de acasalamento de peixe-zebra, colocando divisórias em câmaras de acasalamento e encha com água do sistema.
2. Coloque um peixe de cada lado da divisória such que cada câmara de acasalamento contém uma fêmea e um macho peixes, e cubra cada uma das câmaras de acasalamento.
3. Na manhã seguinte, retire os divisores para permitir a desova.
4. Verifique o peixe depois de aproximadamente 30 minutos, e depois de voltar os adultos para o aquário, recolher os seus embriões, passando a água do tanque de acasalamento por meio de uma ferramenta de filtro fino de arame.
5. Inverter a peneira sobre uma placa de Petri e enxaguar com E3 para recolher os embriões.
6. Incubar os embriões a 28,5 ° CO / N.
7. Quando os embriões atingiram o estádio de 24-26 somito ^26, decanta-se a maior parte dos meios de comunicação e, em seguida, E3 dechorionate por adição de 100 ul de 50 mg / mL de pronase para cada prato de embriões e incubando o prato à TA (23 ° C) durante aproximadamente 15 min.
   Nota: Vai levar cerca de 24-25 horas a partir do momento da fertilização para os embriões para chegar à fase 24-26 somite se forem recolhidas através do método descrito e incubadas O / N a 28,5 ° C.
8. Encha o prato comE3 e, em seguida, agite cuidadosamente para desalojar os córions dos embriões.
9. Decantar o E3 / pronase e lavar o prato com 25 ml de E3 fresco. Repita etapa de lavagem para remover toda a pronase.
10. Para bloquear o desenvolvimento da pigmentação, decantar o E3 e substituir com 25 ml de fresco E3 / PTU quando os embriões tenham atingido 24 horas após a fertilização.
    Nota: Para experiências abrangendo vários dias, substitua a solução E3 / PTU com meios frescos uma vez por dia para manter o prato limpo.

4. Solução de Microinjeção nefrotoxina

1. No dia da injecção, preparar a solução nefrotoxina desejado, juntamente com o controlo de veículo apropriado.
2. Vortex ou misturar suavemente para assegurar a droga (s) é / são em solução, verificando os lados do tubo e o topo da coluna de água.
   Nota: As soluções nefrotoxina pode estar preparado para conter pequenas quantidades de dextrano conjugado fluorescente para monitorar a eficiência de microinjeção e também avaliar a depuração renal em subseqtempo uentes aponta ^20,28.
3. Carregar uma agulha de microinjecção aparado com ~ 2-3 ul da nefrotoxina enfiando uma ponta de carregamento de gel fina na parte de trás da agulha e suspender a agulha na vertical, com um pedaço de fita para permitir que a solução para encher a extremidade da agulha cortada por gravidade.
4. Uma vez que a ponta da agulha está cheio, fixar a agulha carregada no micromanipulador.
5. Testar o volume microinjecção, colocando uma gota de óleo mineral para uma lâmina de micrómetro e injectar no óleo a avaliar o tamanho de gotícula. Um volume de injecção de 500 pl tem um diâmetro de 0,1 mm.
6. Remover o prato de embriões a partir do incubador, e anestesiar por adição de cerca de 5 ml de 0,2% tricaina ao prato embrião.
7. Para garantir anesthetization completa, tocar suavemente embrião com a ponta da ferramenta embrião manipulador. A falta de movimento indica anesthetization suficiente.
8. Após anestesia com sucesso, transferir embriões para o molde de injecção com um transfpipeta er.
9. Manobrar cada embrião dentro de um poço diferente do molde colocando a cabeça na área mais profunda do poço de tal forma que o tronco repousa ao longo da depressão e da cauda fura acima fora da depressão.
10. Inserir a agulha introduzida no micromanipulador e posicionar a ponta da agulha ao lado de um embrião.
11. Gentilmente inserir a agulha para dentro do vaso cauda movendo o joystick para a frente e pressionar o pedal para entregar a microinjecção.
    Nota: injeção de sucesso pode ser medido observando o líquido entra na circulação. Além disso, a co-injecção do nephrotoxicant com dextrano conjugado por fluorescência permite que o pesquisador para verificar a injecção subsequente de sucesso para o procedimento.
12. Gentilmente puxe o joystick para remover a agulha do embrião.
13. Após a injeção, transferir os embriões para um prato limpo e lavar para remover o tricaina e substituir com frescos E3 / PTU.
14. Incubar o embrião para o ponto de tempo desejado para avaliars morfologia, a qual pode ser documentadas por fotografia em meios de montagem de metilcelulose, ou um processo para a análise experimental como desejado.
    Nota: Recuperação de embriões devem ser avaliadas para determinar a percentagem de indivíduos com edema, que normalmente indica lesão renal.

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Resultados

Uma estação de microinjecção configurar inclui um estereomicroscópio, micromanipulador e regulador de pressão (Figura 1A). Transiluminação da placa de injecção é preferível para visualizar amostras durante este procedimento (Figura 1B). Preparação da agulha de injecção implica puxar o vidro de borosilicato apropriado, seguida por preparação da borda de corte e, finalmente, com back-carregar a agulha. Optimamente, a ponta da agulha é ch...

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Discussão

Um número diverso de agentes terapêuticos têm sido associados com LRA ^29. Tem havido avanços significativos na compreensão de investigação do dano induzido por muitos compostos individuais, tais como a gentamicina aminoglicósido ³⁰ e a cisplatina quimioterapêutico largamente utilizado ^31,32. Algumas alterações patológicas envolvidos nestas condições, no entanto, continuar a ser objecto de estudo em curso. Um desafio emergente continua a compreensão de como múltiplas droga...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	American Bioanalytical	AB01915
Potassium Chloride	American Bioanalytical	AB01652
Calcium Chloride	American Bioanalytical	AB00366
N-Phenylthiourea (PTU)	Aldrich Chemistry	P7629
Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)	Fluka Analytical	A5040
Borosilicate glass	Sutter Instruments Co.	BF100-50-10
Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instruments Co.	Mo. P097
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Magnesium Sulfate	Sigma-Aldrich	M7506
Methylene Blue	Sigma-Aldrich	M9140
Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:
60 mm x 15 mm	VWR	25373-085
100 mm x 15 mm	VWR	25373-100
(microinjection tray) 150 mm x 15 mm	VWR	25373-187
Low Temperature Incubator	Fischer Scientific	11 690 516DQ
Micro Dissecting Tweezer	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010
Micrometer	Ted Pella, Inc.	2280-24