Réalisé Conditionnement des protéines dans la membrane externe de vésicules<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Conception, production et purification

Résumé

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Résumé

Un intérêt croissant pour l'application des techniques de biologie synthétique pour programmer des vésicules de la membrane externe (OMV) conduisent à des applications très intéressantes et uniques pour OMV où nanoparticules traditionnelles se révèlent trop difficiles à synthétiser. A ce jour, toutes les bactéries à Gram négatif ont été montrés pour produire OMV démontrant l'emballage d'une variété de marchandises qui comprend des petites molécules, des peptides, des protéines et du matériel génétique. Sur la base de leur cargaison diverse, OMV sont impliqués dans de nombreux processus biologiques allant de la communication cellulaire pour le transfert de gènes et la fourniture de facteurs de virulence en fonction de laquelle les bactéries produisent le OMV. ont seulement récemment OMV bactérienne devenue accessible pour une utilisation dans un large éventail d'applications à travers le développement des techniques de contrôle et de conditionnement direct de protéines recombinantes dans OMV. Ce protocole décrit un procédé pour la production, la purification et l'utilisation de l'enzyme conditionnée OMV permettant une meilleure overaproduction ll d'enzyme recombinante, une augmentation de vésiculation, et amélioré la stabilité de l'enzyme. l'utilisation réussie de ce protocole va entraîner la création d'une souche bactérienne qui produit simultanément une protéine recombinante et la dirige pour l'encapsulation d'OMV en créant une liaison entre la protéine synthétique et d'une protéine recombinante d'ancrage de la membrane externe. Ce protocole détaille également les méthodes pour isoler OMV à partir de cultures bactériennes ainsi que des techniques de manipulation appropriées et des choses à considérer lors de l'adaptation de ce protocole d'utilisation pour d'autres applications uniques telles que: la livraison de médicaments pharmaceutiques, les diagnostics médicaux, et à l'assainissement de l'environnement.

Introduction

Nous présentons ici une méthode pour la conception, la production et la purification des bactéries vésicules de membrane externe de l'enzyme chargée (OMV). OMV sont petites, principalement unilamellaires, protéoliposomes qui varient en taille de 30 à 200 nm de ^1,2. Toutes les bactéries Gram-négatives et Gram-positives qui ont été étudiés à ce jour ont démontré la libération des deux OMV ou vésicules extracellulaires (EV) à partir de leur surface ^3,4. Le mécanisme précis par lequel OMV sont produites doivent encore être complètement élucidé en raison des populations bactériennes diverses qui les ainsi que les fonctions variables qu'ils servent sécrètent. OMV a été démontré que pour transporter un large éventail de marchandises à partir de petites molécules, des peptides et des protéines au matériel génétique servant une variété de signalisation complexe, translocation du gène, et les fonctions de virulence ^5,6.

Les mécanismes exacts de OMV biogenèse ne sont pas bien caractérisées, et semblent différer entre les espèces bactériennes. Malgré thide fait, nous avons mis au point un procédé pour améliorer l'efficacité de l'emballage d'une protéine recombinante dans OMV en créant une liaison entre une protéine synthétique d'intérêt et d'une protéine endogène très abondant à la membrane externe bactérienne et OMV ultérieure. En l'absence d'une liaison synthétique, ou une affinité incorporée artificiellement entre la protéine exprimée de manière recombinante et OMV l'efficacité de l' emballage est très faible observée ^7. Ce résultat est à prévoir que l'incorporation des protéines au sein de l'OMV soit se produit par hasard encapsulation par hasard au moment précis de la formation OMV à la surface bactérienne ou par emballage dirigé par des mécanismes qui ne sont pas bien comprises. Un certain succès a été observé dans l'emballage de protéines simplement par-dessus l'expression dans l'espace périplasmique qui repose sur l'encapsulation de hasard, mais l'emballage efficace est hautement la protéine dépendante avec des protéines d'emballage à haute efficacité par rapport à d'autres eà ne pas emballer du tout ^8-10. En utilisant des techniques de biologie synthétique communs , nous avons cherché à concevoir Escherichia coli (E. coli) pour produire simultanément, ensemble et sécrètent une enzyme active d'intérêt dans OMV qui contourne les limites des connaissances actuelles sur la façon dont OMV sont formés et comment la cargaison est sélectionnée par les bactéries pour emballage.

Aux fins de cette application, un système de la protéine bioconjugaison scission a été choisi comme le lien synthétique de choix pour faciliter l'emballage directionnel dans le OMV. Comme le nom l'indique, un système de bioconjugaison protéine intermédiaire est constituée de deux domaines de sous-unités complémentaires qui interagissent les unes avec les autres. Les domaines protéiques split sélectionnés aux fins de ce protocole sont désignées sous le nom de SpyCatcher (SC) et SpyTag (ST) domaine et sont dérivées de la pyogenes fibronectine-binding protein Streptococcus (FBAB) ^11. Ce système de protéines de division est inhabituel en ce worsque les deux sous-unités sont dans la proximité d'une liaison isopeptidique forme spontanément entre les extrémités proximale aspartique résidus d'acides aminés acides et la lysine en créant une liaison covalente. Formation d' une liaison isopeptidique ne nécessite pas l'addition de protéines chaperons, des enzymes catalytiques, ou des cofacteurs et peut facilement se produire à la température ambiante (RT) et sur une large gamme de conditions physiologiquement pertinentes ^12.

Comme une preuve de concept, phosphotriestérase (PTE) (EC 3.1.8.1) de Brevundimonas diminuta a été sélectionné pour être emballé dans E. coli dérivé OMV ^13. PTE contient un site actif Zn / Zn binucléaire et a la capacité de décomposer les organophosphates par une réaction d'hydrolyse convertissant aryldialkylphosphates en dialkylphosphates et alcools aryliques ^14. L'exposition aux organophosphorés altère le bon fonctionnement des neurotransmetteurs en inhibant l'hydrolyse de l'acétylcholine par l'acétylcholinestérase au neuromusculaires jonctions makincomposés g organophosphorés dérivés extrêmement dangereuses ^15. L' exposition prolongée ou significative aux organophosphorés entraîne fréquemment des convulsions incontrôlables et provoque généralement la mort par asphyxie. Bien que PTE présente l'activité catalytique la plus élevée vers paraoxone, un insecticide très puissant, il est également capable d'hydrolyser un large éventail d'autres pesticides et V / G de type agents neurotoxiques chimiques ^16. Pour faciliter l'emballage d'OMV, un plasmide bactérien a été conçu qui code pour un produit de construction génique qui contient un promoteur inductible, une séquence de localisation périplasmique et un site de clonage multiple courte en amont de la séquence du gène SC. Insertion du gène de SDT entre le leader et la séquence SC a permis la création d'un commutateur génétique qui cible la protéine de fusion SDT-SC vers l'espace périplasmique pour le conditionnement d'OMV. Alors que les efforts décrits ici portent sur SDT, le gène de l'enzyme est interchangeable et peut être facilement remplacée par une autre séquence de gène de facemballage ilitate d'une autre enzyme ou d'une protéine.

La deuxième partie de la liaison synthétique, une protéine de la membrane externe abondant (OmpA) est choisi pour présenter la séquence peptidique ST. Bien que le choix de la protéine d'ancrage peut varier, il est essentiel que la protéine possède un domaine permissif qui se présente dans l'espace périplasmique, tolère la construction de fusion sans induire une cytotoxicité, est connu pour être présent dans OMV et ne regroupe pas quand il est recombinaison produite. OmpA est une protéine de 37,2 kDa transmembranaire porine qui est connu pour être fortement exprimé dans la membrane externe des bactéries et après ¹⁷ OMV. Elle est impliquée dans le transport de petites molécules, <2 nm de diamètre, à travers la membrane bactérienne ^18. Natif OmpA possède deux domaines structurellement uniques, un motif de fût transmembranaire bêta et une partie C-terminale periplasmically soluble connu pour interagir avec le peptidoglycane ^19. Dans le mutant OmpA-ST fusion designed ici la partie C-terminale de l'OmpA a été supprimé et le ST a été fusionné à l'extrémité N- face periplasmically ou C-terminales. Suppression de la partie périplasmique de OmpA diminue le nombre d'interactions entre la membrane externe et le peptidoglycane entraînant la déstabilisation de la membrane conduisant à l' hyper-vesiculation ^7. Gnomique OmpA a été maintenue en plus du exprimé de manière recombinante OmpA-ST construction brute pour atténuer la déstabilisation de la membrane.

Protocole

1. Préparation de Plasmides

1. Préparer un plasmide (par exemple, pET22) contenant la protéine d'ancrage (OmpA) fusionné à un domaine de liaison biorthogonal (dénommé dans le présent protocole d' ancrage-ST), marqueur d'épitope (comme 6xHis, myc ou FLAG balises pour la purification et l' identification), tag périplasmique de localisation, la résistance aux antibiotiques, et l' origine de réplication appropriée en fonction de la souche bactérienne sélectionnée ^7.
   1. Extraire l'ADN plasmidique à partir de cultures d'une nuit en utilisant un kit d'isolement d'ADN disponible dans le commerce en suivant le protocole du fabricant.
2. Préparer un plasmide (par exemple, pACYC184) contenant l'enzyme / protéine (PTE) à emballer dans le OMV fusionné au domaine de liaison bioorthogonal complémentaire à celle de la protéine d'ancrage (dénommé dans le présent protocole comme enzyme-SC), épitope tag, balise de localisation périplasmique, la résistance aux antibiotiques qui est différente de la protéine d'ancrage plasmide approprié et origdans la réplication sur la base de la souche bactérienne sélectionnée ^7.
   1. Extraire l' ADN plasmidique à partir de cultures d'une nuit en utilisant un kit d'isolement d'ADN disponible dans le commerce en suivant le protocole du fabricant ^7.

2. Génération d'un OMV Packaging E. coli Culture

1. Le plasmide Isolation
   1. On purifie les plasmides codant pour l'enzyme SC construction et d' ancrage ST construit à partir de lignées cellulaires d'entretien séparés en utilisant un kit d'isolement de plasmide commercial selon le protocole du fabricant ^7. Déterminer la concentration d'ADN et de pureté en mesurant l'absorbance à 260 nm et 280 nm.
2. Co-transformation
   1. Sélectionner une souche de E. coli qui est disponible dans le commerce pour faciliter l' expression de la protéine.
      REMARQUE: BL21 (DE3), les cellules ont été utilisées ici. Lysogène T7 est nécessaire pour l'expression de la construction d'ancre ST, qui repose sur le promoteur T7 et l'ARN polymerase T7 pour protexpression ein. L' utilisation d'autres souches bactériennes requiert soit la présence du gène de la T7 lysogène ou l'utilisation d'un plasmide autre que pET22 ^7.
   2. Diluer l'ADN plasmidique purifié à des concentrations molaires équivalentes puis les transformer en cellules bactériennes compétentes, via une transformation de choc thermique ou l'électroporation suivant le protocole du fabricant pour les cellules compétentes choisies.
   3. Plate transformé cellules sur Luria-Bertani (LB) des plaques d'agar avec de l'ampicilline (pET22) et chloramphénicol (pACYC184) contenant un antibiotique; deux présents à des concentrations finales de 25 ug / ml.
   4. Placer le récipient de culture à 37 ° C pendant une nuit pour isoler uniquement les clones contenant les deux plasmides.
      NOTE: Les colonies qui survivent à la sélection des antibiotiques seront utilisés pour toutes les futures préparations OMV. Des antibiotiques (ampicilline et de chloramphénicol) seront ajoutées à toutes les cultures liquides pour maintenir une pression sélective et de garantir la présence des deux plasmides.

3. OMV production

1. Expansion des colonies
   1. Inoculer 5 ml de milieu de culture (habituellement Terrific Broth (TB) ou LB) contenant des antibiotiques aux concentrations mentionnées ci-dessus (étape 2.2.3) avec une colonie unique à partir des plaques de sélection décrites au point 2.2.4.
   2. Effectuer une dilution 1: 100 pli de la culture de départ pendant la nuit dans des flacons de culture à chicanes.
      REMARQUE: Utiliser un volume de médias entre 250-500 ml.
   3. Maintenir la culture à 37 ° C sous agitation à 250 tours par minute pour faire en sorte que l'aération suffisante de la culture est atteinte.
2. Induction de chaque plasmide
   1. Permettre à la culture de bactéries de croître jusqu'à une DO ₆₀₀ de 0,6 à 0,8, environ 3 heures après l' inoculation de la croissance du flacon de croissance primaire.
   2. Pour améliorer le rendement final des PTE-SC vésicules chargées, centrifuger l'ensemble de la culture à 7000 xg pendant 15 min. Remettre en suspension le culot cellulaire dans préchauffée, milieu de culture frais.
      NOTE: Cette optional étape permet de supprimer tout OMV vide qui sont présents dans les milieux de culture avant PTE-SC induction.
   3. Faire une solution stock de 20% de L-arabinose dans l'eau et le filtre stérile en utilisant un filtre de 0,22 um. solution de L-arabinose conserver à 4 ° C pendant 2-4 semaines.
   4. Ajouter la solution de L-arabinose dans le flacon de culture à une concentration finale de 0,2% pour initier la production SDT-SC.
      NOTE: Cela permet de précharger l'espace périplasmique avec PTE-SC avant de promouvoir l'augmentation vesiculation par induction du mutant OmpA-ST.
   5. Préparer une solution à 1 M isopropyl β-D-thiogalactopyranoside 1 (IPTG) dans de l'eau stérile et de filtrage utilisant un filtre de 0,22 um.
      NOTE: IPTG doit être utilisé immédiatement une fois hydraté. Des portions aliquotes de l'IPTG peuvent être stockés congelés pendant 3-6 mois et peuvent être décongelées immédiatement avant l'utilisation.
   6. Ajouter de l'IPTG après une période d'incubation de 3 heures supplémentaires à une concentration finale de 0,5 mM pour amorcer la production de l'OmpA-ST.
   7. Laisser le culture à croître pendant un 8-14 heures supplémentaires à 37 ° C tout en agitant.

4. OMV Purification

1. L'élimination des bactéries intactes
   1. Centrifuger le milieu de culture bactérienne pendant 15 minutes à 7000 g à 4 ° C pour sédimenter les bactéries intactes.
   2. Décanter, et enregistrer, les médias du haut du poste de centrifugation culot cellulaire en faisant attention à ne pas perturber le culot cellulaire.
   3. Répétez les étapes 4.1.1 et 4.1.2 pour un cycle de centrifugation supplémentaire pour assurer que toutes les bactéries intactes sont retirés de milieux de culture en étant sûr de transvaser et enregistrer les médias.
2. Enlèvement d'agrégats de protéines
   1. purifier davantage les milieux de culture bactérienne en utilisant un filtre de 0,45 um à membrane pour éliminer les bactéries résiduelles et le grand matériel cellulaire indésirable.
      REMARQUE: Utiliser un matériau de membrane biologiquement compatible pour recouvrements plus élevés et plus faible adsorption des protéines telles que l'acétate de cellulose (CA) ou polyfluorure de vinylidène (PVDF). volumes de filtre Seringue de moins de 100 ml et les volumes de filtre à vide de plus de 100 ml.
      1. Pour filtre seringue, dessiner un milieu de culture stérile dans 10-50 ml seringue. Fixer le filtre à 0,45 pm extrémité Luer de la seringue. Enfoncer plongeur et de recueillir accréditives dans un nouveau navire.
      2. Pour aspirer le filtre, le transfert du milieu de culture à un appareil de filtration stérile. Fixer l'unité la pompe à vide ou couler aspirateur pour générer aspiration. Transfert milieu filtré à nouveau navire.
3. L'isolement des OMV par ultracentrifugation
   1. Ajouter les milieux de culture filtré dans des tubes de centrifugation en faisant attention à l'équilibre des tubes opposés dans la centrifugeuse.
   2. Bouletage à ~ 150 000 xg pendant 3 heures à 4 ° C dans une ultracentrifugeuse à l'aide du rotor correspondant correspondant à l'instrument et les tubes étant utilisés.
   3. Décanter le milieu de culture appauvri OMV du culot OMV, en faisant attention de ne pas perturber le culot OMV, immédiatement à la fin of centrifugation en permettant le culot OMV de rester dans les médias adoucira le culot en réduisant la récupération OMV.
      NOTE: Ce culot sera légèrement brun et en fonction du montant de départ de la culture bactérienne peut ou peut ne pas être visible à l'oeil nu. Aspirer les médias directement à partir de la partie supérieure du tube de centrifugation est également une option en gardant à l'esprit que les médias plus retirés du OMV granulés plus pur l'échantillon final OMV sera.
   4. Enregistrez le surnageant centrifugé pour un test ultérieur dynamique diffusion de la lumière (DLS) pour vérifier que les particules OMV ont été complètement déchargées par les médias.
   5. Ajouter 0,5 à 1 ml de solution saline tamponnée phosphate filtré (PBS) à pH 7,4 ou 100 mM de N -cyclohexyl-2-aminoéthanesulfonique acide (CHES) , du tampon stérile à pH 8,0 , au culot OMV qui lui permet de les incuber pendant 30 min à température ambiante. Assurez-vous que la pastille ne se dessèche pas.
      NOTE: Extremes dans la force de solution ionique, le pH et la température peut entraîner une diminution de la solubilité OMV et promouvoir totalisationtion.
   6. Déposer avec soin la solution purifiée OMV du tube de centrifugeuse, en mélangeant doucement pour assurer la totalité du culot a été solubilisé.

5. OMV Caractérisation

1. Utilisez un logiciel DLS ou de suivi des nanoparticules disponibles dans le commerce en suivant les protocoles du fabricant fourni propres à chaque instrument pour déterminer la distribution de taille OMV et la concentration des particules.
   NOTE: Ici, la distribution de taille OMV et la concentration a été déterminée en utilisant NanoSight LM10 Tracking Nanoparticules et NTA 2.3 Logiciel d'analyse.
   1. Ouvrez le logiciel.
   2. Allumez microscope et nettoyer toutes les surfaces de l'unité de microscope et le suivi des nanoparticules.
   3. Ajouter ~ 0,5 ml d'échantillon OMV directement à la fenêtre de visualisation du dispositif de suivi des particules à travers le raccord Luer avec un 1 ml seringue stérile en étant sûr de couvrir la totalité de la fenêtre de visualisation sans injecter les bulles d'air dans le système.
   4. Lieu til nanoparticule unité de suivi sur la scène du microscope et allumer le laser.
   5. Cliquez sur "Capture" dans le logiciel.
   6. Réglez la mise au point du microscope et en scène pour visualiser les particules sur l'écran de prévisualisation présente dans la fenêtre du logiciel.
   7. Réglez le "obturateur de caméra» et «Gain de caméra" jusqu'à ce que les particules lumineuses sont clairement visualisées sur un fond sombre.
   8. Régler la durée de capture à 60 sec.
   9. Cliquez sur "Enregistrer".
   10. Lorsque vous êtes invité, entrée la température / de l'appareil de l'échantillon, l'étiquette de l'échantillon, et enregistrer les données vidéo à la fin de l'exécuter dans chaque dossier utilisateur désigné.
   11. Conservez tous les paramètres d'analyse (seuil de détection, Blur, Min Longueur du rail, taille des particules Min attendu) sur la détection automatique en mode et cliquez sur "Séquence de processus."
       NOTE: Consultez le manuel pour savoir comment chaque paramètre peut être réglé indépendamment pour fins résultats d'analyse de hauteur.
   12. Répartition de la taille des particules de la fiche et de particules / ml Concentration tel que déterminé par le logiciel.
       NOTE: Une OMV gamme de taille hydrodynamique typique se situe entre 30-200 nm avec une concentration de particules / ml de ~ 10 x 10 ^8.
2. Teneur en protéines de détermination OMV
   1. Utilisez SDS-PAGE standard et des protocoles de transfert de Western pour évaluer OMV pureté, la production d'enzymes, et la réticulation efficacité SC-ST ^7.
      NOTE: Réticulation l' efficacité ne sera pas 100% ^7.

6. Vérification de l'enzyme Conditionnement

1. PTE Essai d'activité
   1. Effectuer toutes les dosages enzymatiques dans un tampon approprié, tel que CHES 100 mM (pH 8) à 25 ° C, soit dans une cuvette ou dans une plaque multiplexé bien 96/384.
   2. Ajouter 5 ul d'un mélange 1: 1000 dilution de paraoxone dans un tampon CHES 90 ul de CHES et 5 ul d'OMV purifié (~ 36 fois concentré par rapport à la concentration d'OMV présent dans les milieux de culture).
      Attention: Paraoxon est un pesticide toxiqueet doit être manipulé par le fabricant et les directives institutionnelles.
   3. Prenez les lectures d'absorbance à intervalles réguliers (tous les 20 sec pour ~ 2 heures de temps de réaction total) à 405 nm (ε = 18,1 mM ^-1 cm ^-1) et à 348 nm (isosbestique point de ε = 5,4 mM ^-1 cm ^-1) à surveiller la progression de la réaction du produit de décomposition du paraoxone chromogénique, p - nitrophénol.
      REMARQUE: A des valeurs de pH supérieures à 8 la forme déprotonée dominante de p - nitrophénol est présent permettant un suivi précis à 405 nm. Dans toutes les autres solutions de pH ou moins complexe , il est nécessaire d'utiliser le point de 348 nm isosbestique que des formes multiples de p - nitrophénol seront présents.
   4. Calculer les vitesses de réaction initiales en déterminant la pente de la partie linéaire des courbes de progression de l'étape 6.1.3 pour comparer la quantité relative de SDT dans chaque échantillon, l'efficacité d'emballage, et la production de SDT totale.
   5. Effectuer enzymatique normeprotocoles d'essai pour déterminer K _M, V _max et k _cat pour le OMV encapsulés PTE.
      Remarque: Une analyse de Lineweaver-Burk peut être utilisé pour déterminer ces paramètres cinétiques où l'ordonnée à l' origine = 1 / _Vmax et de la pente _max = ²⁰ K _M / V.
2. Transmembranaire Substrat / Diffusion du produit.
   1. Effectuer la même analyse de dosage cinétique comme décrit dans l'étape 6.1 en utilisant des concentrations croissantes de Triton X-100 dans un tampon CHES de 0-3% en volume.
      REMARQUE: L'addition de Triton X-100 aux fonctions solubilisées OMV pour perturber la double couche lipidique qui permet au contenu du OMV à être librement accessibles à la solution réactionnelle.
   2. Calculer et comparer les vitesses initiales à chaque niveau de Triton X-100 pour vérifier le passage transmembranaire du substrat / produit indiqué par un changement minimal de l'activité enzymatique (les vitesses initiales) par rapport à l'activité enzymatique in l'absence de Triton X-100. Si une augmentation substantielle de l'activité enzymatique est observée en présence de Triton X-100, il est probable que le substrat ne diffuse pas librement dans l'OMV.
   3. l'activité de l'enzyme libre dosage (comme décrit ci-dessus dans la section 6.1) en présence de Triton X-100 pour vérifier que l'activité enzymatique est pas inhibée par l'agent tensio-actif lui-même.
      REMARQUE: si l'activité est fortement influencée par le Triton X-100, d'autres additifs, tels que les saponines ou différents polysorbate / tween tensio-actifs peuvent être plus appropriés pour rompre la membrane OMV.

7. OMV Storage

1. Gel
   1. aliquotes place ~ 100 ul de purifié OMV directement dans l'azote liquide pour enclencher geler les aliquotes étant sûr de ne pas submerger complètement les flacons ou contacter l'un de l'azote liquide avec l'échantillon lui-même.
      NOTE: Purifié OMV peut être congelé instantanément directement dans le tampon qui a été choisi pour solubiliser le culot OMV pendant la purificatprocessus ion sans cryoprotecteurs supplémentaires nécessaires ^7.
   2. Rangez les snap congelés aliquotes à -80 ° C.
   3. Décongeler aliquotes congelées de l'étape 7.1.1 en les plaçant à la température ambiante en étant sûr de ne pas chauffer les échantillons.
   4. Avant de préparer tous les échantillons pour le stockage de cette manière, réaliser le dosage de l'enzyme décrite dans l'étape 6.1 on compare les vitesses initiales avant et après congélation pour vérifier qu'il n'y a pas de perte significative de l'activité enzymatique après congélation-décongélation.
      NOTE: Magasin purifié OMV à 4 ° C si une réduction de l'activité enzymatique est observée en raison de la congélation.
2. lyophilisation
   1. Lyophiliser les snap congelés aliquotes OMV purifiées en utilisant des équipements disponibles dans le commerce de lyophilisation ^21.
   2. Magasin aliquotes lyophilisée à température ambiante pendant des semaines ou à -80 ° C pendant plusieurs mois.
   3. Ajouter le même volume d'eau purifiée à l'OMV lyophilisé comme avant la lyophilisation et laisser reposer à température ambiante pendant 30 min pour réhydrater til échantillonner. Mélanger doucement quand étant nécessaire sûr de ne pas vortex ou Soniquer l'OMV.
   4. Ajouter la poudre lyophilisée OMV directement au point-of-care pour les applications où avant dilution / solubilisation est pas nécessaire.

Résultats

L'expression simultanée de deux protéines recombinantes, comme cela est nécessaire pour la stratégie d'emballage OMV détaillée dans ce protocole, peut être accompli par un certain nombre de différentes avenues. Ici, un système à deux vecteur a été utilisé avec des origines de replication compatibles et cassettes de gènes inductibles séparés. Pour l'expression de la SDT-SC construire un squelette de plasmide commercial (pACY184) a été modifié pour inclure un...

Discussion

Ces fonctions de protocole pour démontrer un représentant dirigé technique d'emballage dans lequel une enzyme d'intérêt est produite et conditionnée par OMV dans E. coli. Comme avec beaucoup de techniques complexes, il existe de multiples domaines dans lesquels le protocole peut être modifié pour tenir compte pour une utilisation dans différentes applications uniques, dont certaines sont détaillées ci-dessous. Bien que le mécanisme d'OMV emballage et de l'enzyme encapsulation peut ê...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
IPTG	Any		Always prepare fresh or aliquot and freeze.
L-arabinose	Any		Can be prepared ahead of time and stored at 4C.
Ampicillin	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
Chloramphenicol	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
TB/LB Culture Media	Any		Other growth medias will likely work similarly.
Triton X-100	Any		One of many potential suitable surfactants.
Baffled culture flasks	Any		The baffles promote higher levels of aeration.
CHES	Fisher Bioreagents	BP318-100	Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8).
Paraoxon	Chem Service	N-12816	Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.
Syringe Filter 0.45 µm	Thermo Scientific	60183-221       (30 mm)	Filter diameter will depend on volume of sample.  Low protein binding membrane is critical.
Shaker incubator	New Brunswick	Excella E24	Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.
Sorvall Culture Centrifuge	Thermo Scientific	RC 5B PLUS	Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g.
Sorvall Ultracentrifuge	Thermo Scientific	WX Ultra 90	Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g.
Ultracentrifuge Rotor	Thermo Scientific	AH-629	Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.
Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes        (25 x 89 mm)	Beckman Coulter	344058	Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.
Spectrophotometer	Tecan	Infinite M1000	Necessary for enzyme kinetic assays.
DLS / particle tracking	NanoSight	LM10	Necessary for OMV size distribution and concentration determination.
BL21(DE3)	NEB		Suitable bacterial expression strain.
pET22	EMD Millipore	69744-3	Other plasmids can be used in place of these.
pACYC184	NEB		Other plasmids can be used in place of these.
Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Example kit.