Направленный Белок Упаковка в везикул наружной мембраны из<em&gt; Кишечная палочка</em&gt;: Проектирование, производство и очистка

Резюме

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Аннотация

Увеличивается интерес к применению методик синтеза биологии для программирования везикул наружной мембраны (OMV) приводят к очень интересным и уникальных приложений для OMV, где традиционные наночастицы оказываются слишком трудно синтезировать. На сегодняшний день все грамотрицательные бактерии, как было показано, чтобы произвести OMV, демонстрирующих упаковки разнообразных грузов, который включает небольшие молекулы, пептиды, белки и генетический материал. На основании их разнообразных грузов, OMV, участвуют во многих биологических процессах, начиная от межклеточной связи для переноса генов и доставки факторов вирулентности, в зависимости от которых бактерии производить OMV. Только в последнее время бактериальные OMV становятся доступными для использования в широком диапазоне применений путем разработки методов контроля и прямой упаковки рекомбинантных белков в OMV. Этот протокол описывает способ производства, очистки и использования фермента упаковывают OMV, предусматривающий улучшена Overaпроизводство Л.Л. рекомбинантного фермента, повышенной везикуляцией и повышенной стабильности фермента. Успешное использование этого протокола приведет к созданию бактериального штамма, который одновременно производит рекомбинантный белок и направляет его для OMV капсулирования путем создания синтетической связи между рекомбинантным белком и белком наружной мембраны в анкерной. Этот протокол также подробно методы выделения OMV из бактериальных культур, а также надлежащих методов обработки и вещей, которые следует учитывать при адаптации этого протокола для использования для других уникальных приложений, таких как: фармацевтическая доставки лекарственных средств, медицинской диагностике и восстановлению окружающей среды.

Введение

Представленный здесь метод для проектирования, производства и очистки ферментных загруженным бактериальных везикул наружной мембраны (OMV). OMV невелики, в первую очередь однослойными, протеолипосомы , которые варьируются в размерах от 30-200 нм ^1,2. Все грамотрицательных и грамположительных бактерий , которые были изучены на сегодняшний день продемонстрировали выпуск либо OMV или внеклеточного везикул (EV) с их поверхности ^3,4. Точный механизм, с помощью которого производится OMV, еще не выяснена из-за разнообразных популяций бактерий, которые секретируют их, а также различные функции, которые они обслуживают. OMV было показано для транспортировки широкого спектра грузов из малых молекул, пептидов и белков генетического материала , где подают разнообразные сложные сигнализации, транслокации генов и вирулентности функции ^5,6.

Точные механизмы OMV биогенезе не хорошо охарактеризованы, и, по всей видимости различаются между видами бактерий. Несмотря на Тхиs факт, мы разработали метод для повышения эффективности упаковки рекомбинантного белка в OMV, создавая искусственную связь между интересующим белком и весьма распространенный белок эндогенными по отношению к бактериальной внешней мембране и последующей OMV. При отсутствии синтетического связывания, или искусственно включенной сродства между рекомбинантно экспрессировать белок и OMV наблюдаемая эффективность упаковки очень низкая ^7. Этот результат следует ожидать, как включение белков внутри OMV либо происходит через случайный шанс инкапсуляцией именно в тот момент формирования OMV на бактериальной поверхности, или с помощью направленной упаковки с помощью механизмов, недостаточно хорошо изучены. Некоторые успехи были отмечены в упаковки белки просто через более чем выражение в периплазматическое пространство, которое опирается на случайный шанс инкапсуляция, но эффективной упаковки очень белков зависит с некоторыми белками упаковка на высокую эффективность по сравнению с другими мна не пакет вообще ^8-10. Используя общие методы синтетической биологии мы стремились инженер кишечной палочки (E.coli) , чтобы одновременно производить, упаковки и секретировать активный интерес фермент в OMV , который обходит существующие ограничения знаний относительно того, как формируются OMV и как груз выбирается для бактерий упаковка.

Для целей настоящего приложения сплит-системы белка биоконъюгации была выбрана в качестве синтетического увязка выбора для облегчения направленного упаковки в OMV. Как следует из названия сплит-системы белка биоконъюгации состоит из двух дополняющих друг друга областей субъединиц, которые взаимодействуют друг с другом. Раскол белковые домены , выбранные для целей настоящего протокола упоминаются как SpyCatcher (SC) и SpyTag (ST) области и являются производными от Streptococcus Пирролидонилпептидаза фибронектин-связывающего белка (FbaB) ^11. Эта система сплит белок является необычным в том, что WКурица двух субъединиц находятся в пределах досягаемости isopeptide связь спонтанно образует между проксимальным аспарагиновой кислоты и лизина аминокислотных остатков, создающих ковалентной связи. Формирование Isopeptide связь не требует добавления белков - шаперонов, каталитические ферменты или кофакторов , и может легко происходить при комнатной температуре (RT) и в широком диапазоне физиологически соответствующих условий ^12.

Как доказательство концепции, была выбрана phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) от Brevundimonas diminuta быть упакованы в E.coli , полученный OMV ^13. PTE содержит двухъядерный активный сайт Zn / Zn и обладает способностью расщеплять органофосфаты посредством реакции гидролиза конвертерной aryldialkylphosphates в dialkylphosphates и арильных спиртов ^14. Воздействие органофосфатам ослабляет надлежащую функцию медиатора через ингибирования гидролиза ацетилхолина ацетилхолинэстеразы в нервно-мышечных синапсах Макинг фосфорорганические соединения , полученные чрезвычайно опасные ^15. Длительное или значительное воздействие органофосфатам обычно приводит к неконтролируемым судорогам и обычно приводит к смерти через асфиксию. В то время как ПТЭ демонстрирует самую высокую каталитическую активность по отношению к параоксон, очень мощный инсектицид, он также способен гидролизовать широкий спектр других пестицидов и V / тип G химические нервно - паралитических веществ ^16. Для облегчения OMV упаковки, бактериальной плазмиды была разработана, который кодирует ген конструкцию, содержащую индуцируемый промотор, периплазматического последовательность локализации и короткий сайт множественного клонирования выше последовательности гена СК. Введение гена PTE между лидерной последовательностью и последовательностью SC позволило для создания генетического переключателя, мишенью которого слитый белок ПТЭ-SC в периплазматическое пространство для OMV упаковки. Хотя усилия, описанные здесь, сосредоточены на ПТЭ, ген фермента является взаимозаменяемым и может быть легко заменена другой последовательностью гена к FACilitate упаковка альтернативного фермента или белка.

В качестве второй части синтетической связи, обильное белок наружной мембраны (OmpA) выбирают так, чтобы представить пептидную последовательность ST. В то время как выбор анкерной белка может варьироваться, важно, что белок имеет разрешающий домен, который представляет в периплазматическом пространстве, переносит слитой конструкции без индукции цитотоксичности, как известно, присутствует в OMV, и не агрегирует, когда она является рекомбинантным производится. OmpA является 37,2 кДа трансмембранный порин белок , который , как известно, высоко выражена в бактериальной внешней мембране и последующего OMV ^17. Он участвует в транспорте малых молекул, <2 нм в размере, по всей бактериальной мембраны ^18. Родной OmpA имеет два структурно уникальные домены, трансмембранный бета ствол мотив и periplasmically растворимый С-концевой части , как известно, взаимодействуют с пептидогликана ^19. В мутантного OmpA-ST слитого Designed здесь С-концевую часть OmpA был удален, а ST был слит с periplasmically обращенной N- или С-концами. Удаление периплазматическому часть OmpA уменьшает количество взаимодействий между наружной мембраной и пептидогликана , что приводит к дестабилизации мембраны , приводящей к гипер- везикуляцией ^7. Геномные OmpA поддерживалось в дополнение к рекомбинантно экспрессировать OmpA-ST конструкции для смягчения грубой мембранной дестабилизацию.

протокол

1. Получение плазмид

1. Приготовьте плазмиды (например, pET22) , содержащий белок якорный (ОмПО) , слитый с биортогональнои области связей (называемый в этом протоколе в качестве якорного-ST), эпитоп тег (например, 6xHis, Myc или FLAG тегов для очистки и идентификации), периплазматический локализация тег, устойчивость к антибиотикам, и соответствующая точка начала репликации на основе выбранного бактериального штамма ^7.
   1. Экстракт плазмидной ДНК из ночных культур с использованием коммерчески доступного набора для выделения ДНК в соответствии с протоколом производителя.
2. Приготовьте плазмиды (например, pACYC184) , содержащий фермент / белок (PTE) , чтобы быть упакована в OMV , слитого с комплементарной bioorthogonal области связей с что белка якоря (называемый в этом протоколе в качестве фермента-SC), эпитоп тег, периплазматический локализация тег, устойчивость к антибиотикам, который отличается от плазмиды белка якоря, и соответствующий оригв репликации на основе выбранного бактериального штамма ^7.
   1. Экстракт плазмидной ДНК из ночных культур с использованием коммерчески доступного набора для выделения ДНК в соответствии с протоколом производителя ^7.

2. Генерация OMV Packaging кишечной палочки культуры

1. Выделение плазмидной
   1. Очищают плазмиды , кодирующие фермент-SC построить и якорь-СТ конструкции из отдельных линий обслуживания клеток с использованием коммерческого набора плазмида разъединение согласно протоколу производителя ^7. Определить концентрацию ДНК и чистоту путем измерения оптической плотности при 260 нм и 280 нм.
2. Co-преобразование
   1. Выберите штамм E.coli , который является коммерчески доступным , чтобы облегчить экспрессию белка.
      Примечание: BL21 были использованы здесь (DE3). Т7 lysogen необходим для экспрессии конструкции якоря-ST, которая опирается на промотор фага Т7 и РНК-полимеразы Т7 для PROTвыражение Эйн. Использование других бактериальных штаммов , требует либо наличия гена lysogen Т7 или использование плазмиды, кроме pET22 ^7.
   2. Развести плазмидной ДНК в эквивалентных молярных концентрациях затем превратить их в компетентные бактериальные клетки либо через теплового шока трансформации или электропорации в соответствии с протоколом производителя для компетентных клеток выбранных.
   3. Пластинчатые трансформированные клетки на содержащий антибиотик Лурия-Бертани (LB) агаром с обоими ампициллин (pET22) и хлорамфеникол (pACYC184); оба присутствуют в конечных концентрациях 25 мкг / мл.
   4. Место культуры блюдо при температуре 37 ° С в течение ночи, чтобы изолировать только клоны, содержащие обе плазмиды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии, которые выживают выбор антибиотик будет использоваться для всех будущих препаратов OMV. Антибиотики (ампициллин и хлорамфеникол) будут добавлены ко всем жидких культур для поддержания давления отбора и обеспечить присутствие обеих плазмид.

3. OMV Производство

1. Colony Expansion
   1. Инокулируйте 5 мл культуральной среды (обычно Потрясающе Бульон (ТБ) или LB), содержащей антибиотики, в указанных концентрациях (этап 2.2.3) с одной колонии из пластин отбора, описанных в 2.2.4.
   2. Выполните 1: кратное разведение ночной культуры стартера 100 в культуральных колбах с перегородками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте объем носителя между 250-500 мл.
   3. Поддержание культуры при 37 ° С качалке при 250 оборотах в минуту, чтобы обеспечить наличие достаточного количества аэрацию культуры достигается.
2. Индукция каждую из плазмид
   1. Дайте бактериальную культуру расти до OD ₆₀₀ 0,6-0,8, примерно 3 ч роста после инокуляции первичной колбы роста.
   2. Для улучшения конечного выхода ПТЭ-SC нагруженных везикул, центрифугировать всю культуру при 7000 х г в течение 15 мин. Ресуспендируют осадок клеток в подогретого, свежей культуральной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это неавтоматическогоРациональная шаг помогает удалить любую пустую OMV, которые присутствуют в культуральной среде до индукции PTE-SC.
   3. Сделать 20% исходного раствора L-арабинозы в воде и стерильный фильтр, используя фильтр 0,22 мкм. Хранить раствор L-арабинозы при температуре 4 ° С в течение 2-4 недель.
   4. Добавляют L-арабинозы раствор в колбу культуры до конечной концентрации 0,2% для начала производства ПТЭ-SC.
      Примечание: Это помогает предварительно загрузить периплазмическое пространство с PTE-SC до содействия повышению везикул через индукцию мутанта OmpA-ST.
   5. Сделать раствор 1 М изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в воде и стерильный фильтр с использованием фильтра 0,22 мкм.
      Примечание: IPTG должен быть использован сразу же после увлажненной. Аликвоты IPTG можно хранить в замороженном виде в течение 3-6 месяцев и могут быть разморожены непосредственно перед использованием.
   6. Добавить IPTG после дополнительного 3 ч инкубационного периода до конечной концентрации 0,5 мМ, чтобы начать производство OmpA-ST.
   7. Разрешить кульратура расти еще в течение 8-14 ч при температуре 37 ° C при встряхивании.

4. OMV Очистка

1. Удаление интактных бактерий
   1. Центрифуга бактериальной культуральной среды в течение 15 мин при 7000 х г при температуре 4 ° С до гранул неповрежденных бактерий.
   2. Слить и сохранить, средства массовой информации от верхней части столба центрифугирования осадок клеток, следя, чтобы не мешать осадок клеток.
   3. Повторите шаги 4.1.1 и 4.1.2 для одного дополнительного центрифугирование цикла, чтобы гарантировать, что все неповрежденные бактерии удаляются из средств массовой культуры будучи уверенным, что переливать и сохранить средства массовой информации.
2. Удаление белковых агрегатов
   1. Далее очищают бактериальной культуральной среды с использованием мембраны 0,45 мкм фильтр для удаления остаточных бактерий и нежелательную большого клеточного материала.
      Примечание: С помощью биологически совместимого материала мембраны для более высоких подъемов и более низкой адсорбции белка, такие как ацетат целлюлозы (СА) или поливинилидендифторидную (ПВДФ). Шприц объемы фильтра менее чем за 100 мл и объем вакуум-фильтра превышает 100 мл.
      1. Для того, чтобы шприцевой фильтр, рисовать культуральной среды в стерильный шприц 10-50 мл. Приложить фильтр 0,45 мкм до Luer конца шприца. Выжмите поршень и собирать проточного в новый сосуд.
      2. Для вакуум-фильтр, передача культуральной среды в стерильную фильтрационного аппарата. Присоединить устройство к вакуумному насосу или тонуть аспиратор для создания всасывания. Передача фильтруемой среды в новый сосуд.
3. Выделение OMV с помощью ультрацентрифугирования
   1. Добавьте отфильтрованной культуральной среды в центрифужные пробирки соблюдая осторожность, чтобы сбалансировать противодействующие труб в центрифуге.
   2. Гранула при ~ 150000 х г в течение 3 ч при температуре 4 ° С в ультрацентрифуге, используя соответствующий ротор, соответствующий как инструмент и трубы время используются.
   3. Слейте OMV обедненный культуральной среды из гранул OMV, стараясь не потревожить осадок OMV, сразу по завершении Oе, как центрифугирование позволяет осадок OMV оставаться в СМИ смягчит осадок уменьшая восстановление OMV.
      Примечание: Этот осадок будет слегка коричневого цвета и в зависимости от исходного количества бактериальной культуры могут или не могут быть видны невооруженным глазом. Аспирационных медиа непосредственно из верхней части трубки центрифугирование также вариант имея в виду, что чем больше средств массовой информации, удаленные из OMV Гранул более чистый конечный образец OMV будет.
   4. Сохраните центрифугированию супернатант для последующего динамического рассеяния света (DLS) тестирование, чтобы убедиться, что частицы OMV были полностью истощены из средств массовой информации.
   5. Добавить 0,5-1 мл стерильного профильтрованного забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) , рН 7,4 , или 100 мМ N-2 циклогексилметанона-аминоэтансульфоновая кислоты (CHES) буфера при рН 8,0 , к осадку OMV позволяет ему инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре. Убедитесь в том, что осадок не сушит.
      Примечание: Крайности в ионной силы раствора, рН и температуры может привести к снижению растворимости OMV и содействовать агрегированномдование.
   6. Тщательно пипеткой очищенный раствор OMV из центрифуги трубки, смешивая осторожно, чтобы гарантировать, весь осадок был подвергнут солюбилизации.

5. Характеристика OMV

1. Используйте любой имеющийся в продаже DLS или отслеживания программного обеспечения наночастицами следующие протоколы прилагаемого производителя, уникальные для каждого инструмента, чтобы определить распределение размера OMV и концентрации частиц.
   Примечание: Здесь, OMV распределение по размерам и концентрацию определяли с использованием NanoSight LM10 наночастицу слежения и NTA 2.3 программного обеспечения для анализа.
   1. Откройте программное обеспечение.
   2. Включите микроскоп и очистить все поверхности на микроскоп и слежения за наночастицами блока.
   3. Добавить ~ 0,5 мл OMV образца непосредственно в окне просмотра устройства слежения частиц через Luer фитинга с 1 мл стерильного шприца будучи уверенным, чтобы покрыть всю смотровое окно без инжекции пузырьков воздуха в систему.
   4. Место тон наночастицу устройство слежения на столике микроскопа и включите лазер.
   5. Нажмите кнопку "Capture" в программном обеспечении.
   6. Отрегулируйте фокус микроскопа и стадии визуализации частиц на экране предварительного просмотра, присутствующего в окне программы.
   7. Отрегулируйте "затвора камеры" и "усиление камеры" до тех пор, яркие частицы четко не визуализируется на темном фоне.
   8. Отрегулируйте продолжительность захвата до 60 сек.
   9. Нажмите кнопку "Запись".
   10. При появлении запроса, введите температуру / устройства образца, метка образца, а также сохранять видеоданные при завершении из каждого запуска в папку назначенный пользователем.
   11. Держите все параметры анализа (определение порога, размытие, Минимальная длина дорожки, Мин ожидаемый размер частиц) на режиме автоматического обнаружения и нажмите "Последовательность процесса."
       Примечание: Обратитесь к руководству для того, как каждый параметр можно регулировать независимо друг от друга, чтобы прекрасные результаты анализа настроиться.
   12. частиц Запись и распределение по размерам частиц / мл концентрация, как определено с помощью программного обеспечения.
       Примечание: Типичная OMV гидродинамическая диапазон размеров между 30-200 нм с концентрацией частиц / мл ~ 10 х 10 ^8.
2. Определение содержания белка OMV
   1. Используйте стандартный SDS-PAGE и западные протоколы блоттинга для оценки чистоты OMV, выработку ферментов, и эффективность сшивания SC-ST ^7.
      Примечание: Сшивание эффективность не будет 100% ^7.

6. Проверка ферментного упаковки

1. PTE Анализ активности
   1. Выполнение всех ферментативных анализов в подходящем буфере, таком, как 100 мМ CHES буфере (рН = 8) при 25 ° С либо в кювете или уплотненных в 96/384 луночный планшет.
   2. Добавьте 5 мкл 1: 1000 разбавлении параоксон в буфере CHES до 90 мкл Чеса и 5 мкл очищенного OMV (~ 36-кратно концентрированной по сравнению с концентрацией OMV, присутствующей в культуральной среде).
      Внимание: параоксон является токсичным пестицидаи должны быть обработаны на производителей и институциональных принципов.
   3. Возьмите показания оптической плотности через равные промежутки времени (каждые 20 сек в течение ~ 2 ч общего времени реакции) при 405 нм (е = 18,1 мМ ^-1 см ^-1) и при 348 нм (изосбестической е = 5,4 мМ ^-1 см ^-1) до наблюдения за развитием реакции хромогенного параоксон продукта распада, р -nitrophenol.
      Примечание: При значениях рН выше 8 доминирующий депротонированная форма р -nitrophenol присутствует что позволяет для точного контроля при 405 нм. Во всех других решений сложных или более низком рН, необходимо использовать изосбестической 348 нм , как и множественные формы р -nitrophenol будет присутствовать.
   4. Вычислить начальные скорости реакции путем определения наклона линейной части кривых прогресса от шага 6.1.3 сравнить относительное количество PTE в каждом образце, эффективности упаковки, а также общий объем производства PTE.
   5. Выполните стандартную ферментативныхпротоколы анализа для определения K _M, V _макс и к _кот для OMV инкапсулированные PTE.
      Примечание: Анализ Лайнуивера-Берка могут быть использованы для определения этих кинетических параметров , где Y-перехватывают = 1 / V _макс и наклон = К _М / В _макс ^20.
2. Трансмембранного субстрата / Диффузия продукта.
   1. Выполните ту же кинетическую пробирного анализа, как описано на стадии 6.1 с использованием возрастающих концентраций Тритон Х-100 в буфере CHES 0-3% по объему.
      Примечание: Добавление Тритон Х-100 до солюбилизированных функций OMV нарушить липидный бислой, допускающие содержание OMV быть свободно доступны к реакционному раствору.
   2. Вычислить и сравнить начальные скорости на каждом уровне Triton X-100, чтобы проверить, трансмембранный прохождение субстрата / продукта, указанного минимального изменения ферментативной активности (начальные скорости) по сравнению с ферментативной активности Iп отсутствие Тритона Х-100. Если существенное увеличение ферментативной активности наблюдается в присутствии Тритона Х-100, вероятно, что субстрат не свободно диффундировать в OMV.
   3. Анализ активности свободного фермента (как описано выше в разделе 6.1) в присутствии Тритона Х-100, чтобы проверить, что активность фермента не ингибируется самого поверхностно-активного вещества.
      Примечание: Если активность сильно влияние Triton X-100, альтернативных добавок, таких как сапонины или различные полисорбат / твин поверхностно-активные вещества могут быть более подходящими для разрыва мембраны OMV.

7. OMV хранения

1. Замораживание
   1. Место ~ 100 мкл аликвоты очищенного OMV непосредственно в жидкий азот, чтобы заморозить оснастке аликвот будучи уверенным, что не в полной мере погрузить ампул или связаться с любым жидким азотом с самого образца.
      Примечание: Очищенная OMV может быть замораживали непосредственно в буфер, который был выбран для солюбилизации осадка OMV во время purificatионный процесс без каких - либо дополнительных криопротекторами необходимых ^7.
   2. Храните замораживали аликвотах при -80 ° С.
   3. Размораживайте аликвот из стадии 7.1.1, помещая их на RT будучи уверенным, чтобы не нагревать образцы.
   4. До подготовки всех образцов для хранения таким образом, выполнить ферментного анализа, описанного на шаге 6.1 сравнения начальных скоростей до и после замораживания, чтобы убедиться в том, что нет существенной потери ферментативной активности пост замораживания-оттаивания.
      Примечание: Хранить очищенный OMV при 4 ° С, если снижение активности фермента наблюдается при замерзании.
2. лиофилизация
   1. Лиофилизации замораживали очищенные аликвот OMV , использующие коммерчески доступного лиофилизации оборудование ^21.
   2. Хранить лиофилизируют аликвот при комнатной температуре в течение нескольких недель или при температуре -80 ° С в течение многих месяцев.
   3. Добавьте тот же объем очищенной воды к лиофилизированной OMV как до лиофилизации и выдержать при комнатной температуре в течение 30 мин до регидратации тон образец. Осторожно перемешать, при необходимости будучи уверенным, что не вихревым или разрушать ультразвуком OMV.
   4. Добавить лиофилизированный порошок OMV непосредственно в пункт-ухода для применений, где до разбавления / солюбилизации не является необходимым.

Результаты

Одновременная экспрессия двух рекомбинантных белков, как это требуется для упаковочной стратегии OMV, рассмотренное в данном протоколе, может быть достигнуто с помощью ряда различных путей. Здесь два вектора система была использована с совместимыми начала репликации...

Обсуждение

Этот протокол функционирует с целью подтверждения представителя направленной упаковочной техники , в которой фермент интерес производится и упаковывается в OMV кишечной палочки. Как и в случае многих сложных методов существует множество областей, в которых протокол может быть из?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
IPTG	Any		Always prepare fresh or aliquot and freeze.
L-arabinose	Any		Can be prepared ahead of time and stored at 4C.
Ampicillin	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
Chloramphenicol	Any		Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.
TB/LB Culture Media	Any		Other growth medias will likely work similarly.
Triton X-100	Any		One of many potential suitable surfactants.
Baffled culture flasks	Any		The baffles promote higher levels of aeration.
CHES	Fisher Bioreagents	BP318-100	Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8).
Paraoxon	Chem Service	N-12816	Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.
Syringe Filter 0.45 µm	Thermo Scientific	60183-221       (30 mm)	Filter diameter will depend on volume of sample.  Low protein binding membrane is critical.
Shaker incubator	New Brunswick	Excella E24	Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.
Sorvall Culture Centrifuge	Thermo Scientific	RC 5B PLUS	Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g.
Sorvall Ultracentrifuge	Thermo Scientific	WX Ultra 90	Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g.
Ultracentrifuge Rotor	Thermo Scientific	AH-629	Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.
Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes        (25 x 89 mm)	Beckman Coulter	344058	Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.
Spectrophotometer	Tecan	Infinite M1000	Necessary for enzyme kinetic assays.
DLS / particle tracking	NanoSight	LM10	Necessary for OMV size distribution and concentration determination.
BL21(DE3)	NEB		Suitable bacterial expression strain.
pET22	EMD Millipore	69744-3	Other plasmids can be used in place of these.
pACYC184	NEB		Other plasmids can be used in place of these.
Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Example kit.