Production de réplication défectueuse Rétrovirus par transfection transitoire de cellules 293T

Résumé

Cette technique démontre d'une manière efficace de se préparer à réplication déficiente stocks rétroviraux codant pour une oncogène humain, et par la suite utilisé pour l'induction de syndromes myéloprolifératifs dans le modèle murin.

Résumé

Nos études de laboratoire humaine myéloprolifératifs induite par les oncogènes tels que Bcr-Abl ou facteur de croissance dérivé des récepteurs oncogènes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.) Nous sommes capables de modéliser et d'étudier une maladie humaine, comme dans notre modèle de souris, par la transplantation de cellules de moelle osseuse préalablement infectés par un rétrovirus exprimant l'oncogène d'intérêt. La réplication des rétrovirus défectifs codant pour une oncogène humain et un marqueur (GFP, RFP, gène de résistance aux antibiotiques, etc) est produit par un protocole de transfection transitoire en utilisant des cellules 293T, une lignée de cellules épithéliales rénales transformés par le produit du gène E1A d'adénovirus. 293 cellules ont la propriété inhabituelle d'être très transfectables par phosphate de calcium (Capo _4), avec un maximum à 50-80% d'efficacité de transfection facilement réalisable. Ici, nous avons co-transfecter 293 cellules avec un vecteur rétroviral exprimant l'oncogène d'intérêt et un plasmide qui exprime les fonctions de conditionnement gag-pol-env, tel que le génome unique emballage construit kat ou PCL, dans ce cas le EcoPak plasmide. La transfection initiale est encore améliorée par l'utilisation de la chloroquine. Les stocks de virus de écotrope, recueillis dans le surnageant de culture de 48 heures. post-transfection, peuvent être conservés à -80 ° C et utilisés pour l'infection de lignées cellulaires en vue de la transformation et des études in vitro, ou des cellules primaires tels que les cellules de la moelle osseuse de souris, qui peuvent ensuite être utilisés pour une transplantation dans notre modèle de souris .

Protocole

1. Le soir, avant la transformation des cellules plaque, au 293T 3-5x10 ⁶ cellules / tissus 6 cultureplate cm.
   
   Note: Nous utilisons des cellules 293T pour leur facilité de transfection et les cellules produisant le virus efficacyas. Ces cellules sont déficientes en emballage le virus moins un plasmide auxiliaire est introduite.
   
   
2. Le premier matin, retirer délicatement les moyennes et les remplacer avec 4 ml de cellules 293T med contenant 25 mM de chloroquine. Mettez dans un incubateur pendant 1 heure.
   
   Remarque: la plaque devrait être d'environ 80% de confluence.
   
   
3. Pendant ce temps, préparer le virus de prise de mélange pour 2 plaques à la fois, dans des tubes de 5 ml:
   1. 2 x 10 mg de construire plasmidique retroviral
   2. 2 x 5 mg d'emballage de construire (EcoPak),
   3. 2 x 62 ml de CaCl
   4. complète à 1 ml avec stériles O ₂ ddH
      
      Note: Bien que le plasmide rétroviral codant l'oncogène d'intérêt et un marqueur, EcoPak encode gag-pol-env. Ensemble avec les cellules 293T, ils vont produire un rétrovirus écotrope (RV) spécifique des cellules de souris, mais pas infectieux pour les cellules humaines. Fois à la chloroquine et du CaCl ₂ a été démontré pour augmenter l'efficacité de la transfection.
      
      
4. Ajouter 1ml de sterileHBS 2x goutte à goutte au mélange, tout doucement le tube vortex.
5. Immédiatement ajouter cette solution à 2 plaques, 1 ml chacun, doucement, goutte à goutte.
6. Mettez dans un incubateur pendant 7 à 11 heures.
7. Dans la soirée (7 à 11 heures. Ultérieurement), retirer délicatement les moyennes, et très doucement remplacer par 5 ml de milieu 293T frais. Mettre en incubateur jusqu'à midi, le lendemain.
   
   Remarque: cette étape est importante, car vous avez besoin pour décoller de la chloroquine à partir des cellules. Si on les garde pour des périodes de temps prolongées, la chloroquine est toxique. La solution dans les plaques semble floue, en raison d'une très fine, comme de la poussière précipitation du mélange de transfection.
   
   
   Note: Il est important de faire tous les changements des médias avec une douceur extrême, comme les cellules ont été sensibilisés par la chloroquine, et peut facilement se détacher de la plaque.
   
   
8. Le lendemain, 18 à 24 heures. avant de récupérer le virus (vers midi), retirer délicatement les moyennes, et très doucement remplacer par 3 ml de milieu 293T frais. Remplacer dans l'incubateur d'O / N.
9. Le troisième matin (18 à 24 heures. Ultérieurement), doucement sucer le formulaire support les plaques avec une seringue de 10 ml muni d'une aiguille de 18 G. Ce surnageant contient les rétrovirus.
10. Changer l'aiguille à un filtre à seringue de 45 mm, inverser la seringue plusieurs fois pour mélanger la solution ainsi, passer le surnageant à travers le filtre, et de l'aliquote pour cryotubes
    
    Note: Alternativement, si vous faites 3 ​​plaques + de virus, de la piscine tous les surnageants du même virus dans un 5 0 ml tube conique. Mélangez bien, puis les surnageants aliquote contenant le rétrovirus dans des cryotubes par filtrage.
    
    
11. Les tubes contenant les surnageants virus complets sont conservés dans -80 ° C jusqu'à leur utilisation.

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Discussion

Quatre points essentiels seront d'assurer la réussite d'un bon stock viral:

1. Les cellules 293T de production doivent être en très bonne santé, ce qui signifie qu'ils ont été séparés sur un calendrier très régulière, n'ont jamais été envahi, et sont étalées à la densité optimale de 3,5 à 5000000 pour 6 cm de plaque de culture tissulaire, afin qu'ils atteignent une densité de 80% de la plaque sur le matin de la transfection.
   
2. L'addition de chloroquine améliore l'...

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