Produzione di replica-difettoso da Retrovirus trasfezione transiente di cellule 293T

Riepilogo

Questa tecnica mostra un modo efficace per preparare le scorte retrovirali replica difettoso codifica di un oncogene umano, e successivamente utilizzata per l'induzione di malattie mieloproliferative nel modello murino.

Abstract

I nostri studi di laboratorio malattie umane mieloproliferative indotta da oncogeni come Bcr-Abl o recettore del fattore di crescita derivato oncogeni (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, ecc.) Siamo in grado di modellare e studiare un essere umano-come la malattia nel nostro modello di topo, con il trapianto di cellule del midollo osseo precedentemente infettati con un retrovirus che esprime l'oncogene di interesse. Replica difettoso retrovirus che codifica una oncogene umano e un indicatore (GFP, RFP, gene di resistenza agli antibiotici, ecc) è prodotto da un protocollo di trasfezione transiente utilizzando cellule 293T, un essere umano linea di cellule renali epiteliali trasformate dal prodotto adenovirus gene E1A. 293 cellule hanno la proprietà di essere altamente insolito transfectable da fosfato di calcio (CAPO _4), con fino al 50-80% di efficienza di trasfezione facilmente raggiungibile. Qui, abbiamo co-trasfezione 293 cellule con un vettore retrovirale che esprime l'oncogene di interesse e un plasmide che esprime la gag-pol-env funzioni packaging, come ad esempio il singolo genoma imballaggio costruisce kat o PCL, in questo caso la Ecopack plasmide. La transfezione iniziale è ulteriormente migliorata con l'uso di clorochina. Gli stock di virus ecotropic, raccolti come supernatante di coltura 48 ore. post-trasfezione, possono essere conservati a -80 ° C ed utilizzati per l'infezione di linee cellulari in vista della trasformazione e studi in vitro, o cellule primarie come le cellule del midollo osseo di topo, che possono poi essere utilizzati per il trapianto nel nostro modello di topo .

Protocollo

1. La sera prima trasformazione, le cellule piastra 293T a 3-5x10 ⁶ cellule / 6 cultureplate tessuto cm.
   
   Nota: utilizzare le cellule 293T per la loro facilità di trasfezione delle cellule e del virus efficacyas produzione. Queste cellule sono carenti nella confezione il virus a meno che un aiutante plasmide è introdotto.
   
   
2. La prima mattina, rimuovere delicatamente medie e sostituirlo con 4 ml di cellule 293T med contenente 25 mM clorochina. Messo in incubatrice per 1 ora.
   
   Nota: il piatto dovrebbe essere di circa l'80% confluenti.
   
   
3. Nel frattempo, preparare virus-making miscela per 2 piatti alla volta, in provette da 5 ml:
   1. 2 x 10 mg costruire retrovirali plasmide
   2. 2 x 5 mg confezione costruire (Ecopack),
   3. 2 x 62 ml CaCl
   4. completa di 1 ml con una soluzione sterile DDH ₂ O
      
      Nota: Mentre il plasmide retrovirale codifica per l'oncogene di interesse e di un marker, Ecopack codifica gag-pol-env. Insieme con le cellule 293T, produrranno un retrovirus ecotropic (RV) specifici per cellule di topo, ma non infettivo per le cellule umane. Sia Clorochina e CaCl ₂ hanno dimostrato di aumentare l'efficienza di trasfezione.
      
      
4. Aggiungere 1ml di sterileHBS 2x goccia a goccia per la miscela, mentre delicatamente il tubo vortex.
5. Aggiungere immediatamente questa soluzione a 2 piastre, 1 ml ciascuna, dolcemente, goccia a goccia.
6. Messo in incubatrice per 7 a 11 ore.
7. In serata (da 7 a 11 ore. Successiva), rimuovere delicatamente media, e molto dolcemente sostituire con 5 ml di terreno fresco 293T. Messo in incubatrice fino a mezzogiorno, il giorno successivo.
   
   Nota: questo passaggio è importante, perché è necessario togliere la clorochina dalle cellule. Se mantenuto per lunghi periodi di tempo, la clorochina è tossico. La soluzione nei piatti sembra sfocata, a causa di una molto fine, di polvere come precipitazione della miscela di trasfezione.
   
   
   Nota: è importante fare tutti i cambiamenti dei media con estrema dolcezza, come le cellule sono stati sensibilizzati dalla clorochina, e può facilmente staccare dalla piastra.
   
   
8. Il giorno dopo, 18 a 24 ore. prima di recuperare il virus (intorno a mezzogiorno), rimuovere delicatamente media, e molto dolcemente sostituire con 3 ml di terreno fresco 293T. Sostituire in incubatore O / N.
9. La mattina del terzo giorno (18 a 24 ore. Successiva), lentamente succhiare il modulo di media i piatti con una siringa da 10 ml dotato di un ago 18 G. Questo surnatante contiene i retrovirus.
10. Cambiare l'ago di siringa un filtro 45 mm, capovolgere diverse volte siringa per mescolare bene la soluzione, passano attraverso il filtro surnatante, e aliquota in cryotubes
    
    Nota: In alternativa, se si stanno facendo + 3 piastre di virus, piscina per tutte sopranatanti dello stesso virus in un tubo 0 5 ml. Mescolare bene, poi sopranatanti aliquota contenente il retrovirus in cryotubes filtrando.
    
    
11. I tubi contenenti il ​​virus pieno surnatanti sono conservati in -80 ° C fino al momento.

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Discussione

Quattro punti critici assicurerà il successo di una buona scorta virale:

1. Le cellule 293T di produzione devono essere molto sano, nel senso che sono stati divisi su un programma molto regolare, non erano mai troppo lunghi, e sono placcati alla densità ottimale di 3,5-5000000 per 6 piastra di coltura tissutale cm, in modo che raggiungano una densità del 80% del piatto la mattina della trasfezione.
   
2. L'aggiunta di clorochina migliora l'efficienza di trasfezione e titolo del virus successivi, circa 3 ...

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Materiali