Poudre sèche et aérosol nébulisée L'inhalation de produits pharmaceutiques à des souris Livrés L'utilisation d'un nez seul système d'exposition

Résumé

L'appareil d'inhalation décrit ici peut générer, pour la caractérisation de l'échantillon, et déposer uniformément un aérosol de médicament dans les poumons des rongeurs. Cela permet à la détermination de pré-clinique de l'efficacité et l'innocuité des doses de médicaments déposés dans les poumons; les données clés permettant le développement de médicaments inhalés clinique.

Résumé

les maladies respiratoires obstructives telles que l'asthme et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) sont actuellement traités par inhalation de médicaments anti-inflammatoires et bronchodilatateurs. Malgré la disponibilité de traitements multiples, les deux maladies sont de plus en plus des problèmes de santé publique. La majorité des patients atteints d'asthme sont bien contrôlés sur les traitements inhalés actuels, mais un grand nombre de patients atteints d'asthme sévère ne sont pas. L'asthme touche environ 300 millions de personnes dans le monde et environ 20 pour cent ont une forme sévère de la maladie. Contrairement à l'asthme, il existe peu de traitements efficaces pour la MPOC. On estime que 10% de la population a la BPCO et l'évolution des taux de mortalité augmente pour la MPOC, tout en diminuant pour d'autres maladies. Bien que le développement de médicaments pour la prestation inhalée est difficile, l'unité d'inhalation par le nez ne permet la livraison directe de nouveaux médicaments aux poumons des rongeurs pour précliniques d'efficacité et de sécurité / études toxicologiques. l'administration de médicaments inhalésprésente de multiples avantages pour les maladies respiratoires, où une concentration élevée dans le poumon améliore l'efficacité et minimise les effets secondaires systémiques. Les corticostéroïdes inhalés et bronchodilatateurs bénéficient de ces avantages et à la livraison par inhalation peuvent également détenir un potentiel pour de futures thérapies biologiques. L'appareil d'inhalation décrit ici peut générer, pour la caractérisation de l'échantillon, et déposer uniformément un aérosol de médicament dans les poumons des rongeurs. Cela permet à la détermination de pré-clinique de l'efficacité et l'innocuité des doses de médicaments déposés dans les poumons des rongeurs, des données clés nécessaires avant d'initier le développement clinique.

Introduction

Il y a de nombreux avantages à l'administration par inhalation de médicaments pour le traitement des maladies respiratoires. livraison inhalée applique l'agent thérapeutique directement sur le site d'action, les poumons. Une forte concentration locale du médicament dans les poumons offre un avantage important qui minimise la dose et l'exposition systémique et maximise l'efficacité. Ceci est un avantage important qui peut grandement augmenter l'indice thérapeutique (TI, le rapport de la dose de médicament qui provoque un effet secondaire sur la dose de médicament qui assure l'efficacité) d'un médicament. Inhalés β ₂ agonistes adrénergiques, les corticostéroïdes et les médicaments anti-cholinergiques se sont avérées efficaces pour améliorer la fonction pulmonaire chez les patients souffrant d' asthme et de la MPOC, tout en minimisant les effets secondaires systémiques (tachycardie, immunosuppression et constipation) observée lorsque ces médicaments sont pris par voie orale. De nouvelles classes de médicaments (par exemple, les inhibiteurs PDE4 ¹ et les inhibiteurs de BTK ²⁾ ont récemmentavérée efficace pour améliorer la fonction pulmonaire dans les modèles de maladies animales pré-cliniques mais, similaires à _ß2 mimétiques, les corticostéroïdes et les médicaments anti-cholinergiques, souffrent d'effets secondaires systémiques qui peuvent être réduits au minimum par livraison inhalée. En raison du coût supplémentaire de développement de médicaments par voie orale contre inhalés, une formulation inhalée ne doit être envisagée pour des troubles respiratoires après administration par voie orale / systémique réussie révèle la dose limitant les effets secondaires systémiques à base de mécanisme.

Pré-clinique, les composés inhalés sont optimisés pour augmenter la TI, ce qui nécessite une efficacité in vivo et des mesures effet secondaire. Au départ, ces mesures peuvent être effectuées dans des essais séparés, généralement une mesure d'efficacité administré par voie topique et une mesure à effet secondaire systémique livré, mais à comparer vraiment les composés, l'efficacité et les effets secondaires doivent être mesurés dans les mêmes animaux après administration inhalée. Cela nécessite des études dose / réponse qui acHieve suffisamment composé administré aux poumons pour induire un effet secondaire mesurable. La seule façon actuellement répartir uniformément de fortes doses de médicament dans les poumons de multiples petits animaux est simultanément inhalation par le nez seulement ^{3, 4, 5.} Les forces et les faiblesses des différentes techniques d'exposition par inhalation ont été récemment examiné ^{6, 7, 8.} équipement spécialisé et une grande quantité de composé d'essai (quantités de gramme) sont nécessaires pour l'administration de médicaments par inhalation seulement nez, mais des études de preuve de concept peut être possible par d'autres moyens.

Lorsque la quantité de médicament est limitée (quantités mg), les méthodes d'administration directes sont une option, mais souffrent tous d'un dépôt non homogène, avec plus de médicament concentré le long des voies aériennes centrales et moins bien représentés dans le parenchyme / alvéolaireles régions ^{3, 4, 5.} La dose efficace délivrée par instillation directe est toujours plus élevé et ne peut jamais être directement comparé à des doses inhalées ^4. Modes de instillation directe dont intranasale ^9, intratrachéale liquide ^{10, 11} et de pulvérisation instillation ^12, ou insufflation de poudre sèche ^{13, 14} peuvent être utilisés comme outil de criblage pour déterminer l'intervalle de dose approximative pour la suite des études d'inhalation par le nez seulement, ou pour déterminer la classement de l' efficacité / toxicité pour une série de médicaments de structure similaire ^15. En raison de la tendance centrale de dépôt des voies aériennes, des méthodes d'administration directe peuvent être plus utiles pour déterminer les effets des composés qui agissent sur les voies respiratoires centrales (__gVirt_NP_NNS_NNPS<__ bronchodilatateurs ou les inhibiteurs des mastocytes) que in le poumon périphérique (anti-inflammatoires).

Contrairement aux humains, qui peut inhaler une dose importante d'aérosol concentré à partir d'un inhalateur dans une seule respiration, la génération continue d'un respirables (de 0,5 à 5 um aérodynamique médian en masse de diamètre, MMAD) aérosol, jusqu'à une heure, est nécessaire pour déposer une dose de médicament efficace dans un des poumons de rongeurs respirant spontanément dans un système d'inhalation par le nez seulement ^16. Générateurs d'aérosol (nébuliseur à jet ou à la charge de poussière Wright ¹⁷⁾ qui peuvent produire en continu la taille des particules d'aérosol requis et la concentration pour les études d'inhalation par le nez ne sont pas très efficaces pour générer des aérosols de haute qualité (respirable). Les débits d'alimentation de médicament de ces générateurs d'aérosols pour puissant (IC ₅₀ pM à nM dans des essais à base de cellules fonctionnelles) des composés sont généralement dans l'une de gamme de 10 mg / min et le plus souvent moins de 1% de cet aérosol de médicament rend à la zone de respiration des animaux(Figure 1). Un grand nombre de particules générées sont trop grandes (> 5 um) pour pénétrer dans les poumons et sont éliminées par un séparateur à aérosol (un pré-séparateur ou cyclone avec un point de coupure de 5 um) afin d'éviter une forte dose de médicament dans le nez. Ajouter à l'inefficacité des systèmes d'inhalation par le nez seulement la petite gamme de taille de particules (0,5 à 5 um de MMAD) pour les particules respirables. Un grand nombre des particules d'aérosol inférieure à 0,5 um sont exhalé (comme la fumée de cigarette) et non déposée dans les poumons ^18. De plus, beaucoup des « grands » particules d'aérosol (~ 5 um) dépôt dans le nez sont absorbés ou transportés par la clairance mucociliaire vers l'arrière de la gorge où ils sont avalés dans l'estomac ^19. Lors de l' utilisation par inhalation nasale seulement, la dose déposée dans le nez est toujours supérieure à la dose déposée dans les poumons et la dose nasale peut contribuer à l' exposition systémique et les effets secondaires ^20. Intrinsèquement, Dru inhalég doses sont faibles (dans l'ordre du microgramme) minimiser tout risque d'effet secondaire systémique du médicament absorbé par le nez, les poumons ou les tissus gastro-intestinaux. Même lorsque la taille des particules de l'aérosol fournie aux animaux est dans la gamme respirable, une moyenne de seulement 4% des particules d'aérosol qui en font à la zone de respiration du dépôt des animaux dans les poumons. générateurs d'aérosols plus efficaces sont disponibles, mais le nébuliseur à jet et l'alimentation de la poussière Wright sont inégalées pour leur capacité à produire des aérosols en continu à partir de diverses formulations de poudres sèches et liquides, respectivement.

Aérosol respirable de la pré-séparateur passe dans l'appareil d'inhalation d'exposition nez seulement ²¹ qui est basé sur un flux-delà de la conception de nez ^22. L'appareil d'inhalation a 3 niveaux (seuls deux niveaux sont représentés sur la figure 1) et chaque étage comprend 10 ports d'exposition pour les animaux et l'échantillonnage d'aérosol. Les orifices sont situés de manière périphérique autour de la CEplénum d'aérosol ntral. souris conscientes sont placés dans des supports de retenue de verre (6 pouces de long par le diamètre de 1,2 pouce) et respirent le contenu d'aérosol de l'unité d'inhalation. Les souris ne sont pas acclimatés aux dispositifs de retenue ^23. L' expérience a montré que les souris tolèrent du tube de retenue de moins d'une heure la durée même, avec ou sans adaptation ^2.

L'unité d'inhalation est conçu pour fournir des aérosols de médicaments directement dans les poumons des animaux tout en évitant l'exposition aux opérateurs. La puissance / toxicité de ces médicaments est habituellement les contrôles de sécurité d'ingénierie inconnus et multiples sont utilisés pour éviter l'exposition aux opérateurs. Les opérateurs doivent toujours porter un équipement de protection individuelle (gants, blouses de laboratoire, appareils respiratoires et des lunettes de sécurité). Le plénum extérieur de l'unité d'inhalation est sous pression négative à tout moment pendant le fonctionnement, ce qui permet l'élimination en toute sécurité ou par des groupes d'animaux-haut couper le générateur d'aérosol. L'appareil d'inhalation est également contenu dans une enceinte secondaire maintenu à une pression négative par un orifice d'échappement dans le plafond pour empêcher toute fuite d'aérosol dans la chambre en cas de dysfonctionnement. Tout l'air effluent provenant du système d'inhalation est filtré par un filtre HEPA avant la libération dans l'environnement. Le système d'exposition nez seulement utilisé dans ce manuscrit a été acheté chez un fournisseur unique (voir tableau supplémentaire des matériaux).

Protocole

Les souris utilisées dans ces études ont été pris en charge conformément au Guide pour les soins et l' utilisation des animaux de laboratoire, huitième édition ^24. Les souris ont été hébergés en groupe à une association d'évaluation et d'accréditation du laboratoire de protection des animaux (AAALAC) Facilité internationale accrédité dans le logement microisolation aéré stérile sur une litière d'épis de maïs. Lors de la mesure bronchoconstriction, les souris ont été anesthésiés avec 100 mg / kg ip pentobarbital et de la profondeur de l'anesthésie a été suivie par le manque de réflexe de pincement de l'orteil et maintenu par l'anesthésie ip nécessaire. A la fin des expériences, les souris ont été euthanasiées par dislocation cervicale après un surdosage de barbituriques. La vérification de l'euthanasie a été confirmée par l'absence de respiration. Aucun chirurgies de survie ont été effectuées sur les souris. Tous les protocoles de recherche ont été approuvés par le Comité de protection des animaux institutionnel et utilisation (IACUC).

1. Sélection de formulation et dispositif pour la génération de Pharaérosols maceutiques

NOTE: La formulation et la sélection de l' appareil dépendent des propriétés physico - chimiques de chaque médicament à pulvériser en aérosol, par conséquent les protocoles généraux sont présentés ci - dessous et le lecteur est renvoyé aux commentaires par Zeng ²⁵ et ²⁶ O'Riordan.

1. Les aérosols de poudre sèche
   1. Drogue de poudres sèches micronisation dans un broyeur à boulets, un broyeur à jet ou un dispositif similaire ²⁷ et assurer la distribution de taille de particule micronisée (PSD) contient des particules d'respirable (0,5-5 um diamètre médian aérodynamique massique, MMAD) la taille des particules. Mélanger les composés d'essai puissants qui nécessitent une dilution avec du lactose micronisée.
      NOTE: S'il n'y a pas assez de poudre micronisée pour déterminer le PSD avec un impacteur en cascade, le PSD d'un petit échantillon (sous-milligramme) de la poudre micronisée peut être mesurée par diffusion de la lumière pour le confirmer contient de petites particules / respirables.
   2. Générer l'aérosol de poudre sèche en utilisant un générateur d'aérosol de poudre sèche d'alimentation en poussière Wright. Emballer le médicament micronisé / lactose en poudre dans le réservoir cylindrique en utilisant une presse hydraulique manuelle à environ 1000 livres par pouce carré (psi) pour produire des gâteaux compactées de poudre utilisée comme entrée par le générateur d'aérosol d'alimentation en poussière Wright ^17.
   3. Visser le réservoir cylindrique sur la charge de poussière Wright avancer le réservoir jusqu'à ce que la lame de raclage est en contact avec le gâteau de médicament.
   4. Relier la sortie de l'alimentation en poussière Wright à un cyclone et l'entrée à une source d'air comprimé réglé à 15 L / min débit d'air (pression maximale de 90 psi).
   5. Réglez la commande de débit d'alimentation à 0,7 tour par minute (rpm) et mettre en marche le générateur d'aérosol d'alimentation en poussière Wright.
      NOTE: 0,7 rpm correspond à un taux d'article d'alimentation en gâteau d'essai de 1 g / h lorsqu'on utilise le petit réservoir cylindrique d'alimentation en poussière Wright. La charge de poussière Wright racle une couche mince de po compactéwder hors du gâteau de l'article de test en faisant tourner le réservoir. Air transporte la poussière hors de l'alimentation en poussière Wright, à travers une buse sonique pour de désagglomération, et dans un cyclone pour éliminer les particules non respirables et d'agglomérats.
   6. Raccorder la sortie du cyclone de la chambre d'aérosol central de l'unité d'inhalation (Figure 1).
      REMARQUE: Les composés peuvent être compressés 300-1500 psi dans le réservoir de l'alimentation de la poussière Wright. Le but est de comprimer les particules suffisamment afin qu'ils soient retenus dans le réservoir lorsqu'il est renversé, mais pas tant que la charge de poussière Wright ne peut pas racler une mince couche de ré-aérosolisation. Il faut se rappeler que la jauge sur la presse hydraulique manuelle lit en livres et le piston sur le petit réservoir d'alimentation de poussière a une surface spécifique d'environ 0,25 pouces carrés. Par conséquent, 250 livres de force de compression sur 0,25 pouce carré est équivalent à 1000 psi.
2. Les aérosols liquides nébulisées
   1. Dissoudre le médicament dans 100 ml d'eau ou de sérum physiologique.
   2. Charger une seringue de 100 ml avec la solution de médicament et de placer la seringue dans la pompe à seringue avec un débit fixé à 1 ml / min.
   3. Raccorder la pompe à seringue pour le nébuliseur à jet et purger l'air de la conduite d'alimentation menant au nébuliseur.
   4. Relier la source d'air sous pression vers le nébuliseur à jet et régler le débitmètre d'air à 10 L / min.
   5. Insérez le nébuliseur à jet dans le pré-séparateur. Le pré-séparateur relie le nébuliseur à la chambre d'aérosol central de l'unité d'inhalation (Figure 1).
      REMARQUE: De nombreux composés médicamenteux ont une solubilité aqueuse limitée et sont mieux formulés sous forme d'aérosols de poudre sèche. Si une suspension stable peut être réalisée à partir du composé micronisé (DAMM <5 pM), il peut être utilisé avec le nébuliseur à jet. La prudence devrait être utilisé comme la suspension peut obstruer le nébulisateur. Les concentrations d'alimentation nébuliseur à partir de 1 mg / mL pour les composés puissants (comme le bronchodilatateuripratropium) à des suspensions 40 mg / ml (pour les composés moins puissants tels que le sulfate de salbutamol) ont été utilisés. Le débit d'alimentation de la pompe de seringue est fixée à 1 mL / min pour une raison pratique; pour permettre la concentration d'aérosol période d'équilibration et de l'exposition de 45 min-temps à remplir sans qu'il soit nécessaire de recharger la seringue.

2. Aérosol Configuration exposition Expérience

1. Mesurer la concentration de médicament (en recueillant aérosol sur un filtre absolu) et la distribution de taille de particule (en recueillant aérosol en utilisant un impacteur en cascade) de l'aérosol qui pénètre dans l'unité d'inhalation après pré-séparateur / cyclone. Utilisez ces paramètres ainsi que la ventilation minute de l'animal, le poids corporel, et le temps d'exposition pour estimer la dose de médicament déposée dans les poumons.
   1. Peser le filtre absolu et noter le poids du filtre. Placez le filtre dans le porte-filtre et monter le porte-filtre. Connecter l'entrée du porte-filtre absoluà un port d'échantillon formant collecteur d'aérosol central et l'orifice de sortie à une source de vide réglé à l'échantillon de l'aérosol à un débit de 1 L / min pendant toute la durée de l'expérience.
      REMARQUE: La masse du médicament sur le filtre après l'échantillonnage pendant 45 minutes peut être dans la gamme de sous-microgramme et / ou être mélangés avec du lactose, du sel de NaCl, ou un autre véhicule. Une microbalance qui lit à 0,1 microgramme est nécessaire. Pour obtenir un poids précis de médicament déposé sur le filtre, le filtre doit être pesé et équilibré dans un environnement contrôlé d'humidité. Le poids du médicament sur les filtres ne peuvent être utilisées dans le calcul de la dose en l'absence d'un véhicule dans la formulation ou le véhicule est l'eau. Quand il y a un véhicule dans la formulation autre que l'eau, le poids de la substance sur le filtre donne seulement un point de départ estimé pour une analyse plus poussée de la teneur en médicament par chromatographie liquide à haute performance (HPLC).
   2. Peser et enregistrer le poids des sept filtres en cascade d'étages de l'impacteur et une finale « pièce de queue »; filtre. Placez un filtre sur chacune des sept étapes de la impacteur en cascade et assembler le impacteur en cascade Mercer ^28. Connecter l'entrée de l'impacteur en cascade à un port d'échantillon formant collecteur d'aérosol central et l'orifice de sortie à une source de vide réglé à l'échantillon de l'aérosol à la vitesse d'écoulement de l'impacteur en cascade est calibré à (habituellement 0,5 ou 1 L / min) pendant la durée de la expérience.
   3. Surveiller le contenu d'aérosol de l'unité d'inhalation avec le moniteur en temps réel d'aérosol (voir le tableau des Matériaux et réactifs) pour confirmer les générateurs d'aérosols sont fonctionnels et la production d'un aérosol stable tout au long de l'expérience. Connecter l'entrée du temps réel moniteur d'aérosol à un port d'échantillon formant collecteur d'aérosol central et l'orifice de sortie à une source de vide réglé à l'échantillon de l'aérosol à un débit de 1 L / min pendant toute la durée de l'expérience.
      NOTE: Le signal du temps réel moniteur d'aérosol est rapporté en ug / L, mais est calibré pour la poussière de la route et doit être recalibrépour chaque aérosol de médicament individuel pour obtenir les valeurs de concentration en aérosol appropriées. L'étalonnage n'est pas nécessaire d'utiliser l'écran pour confirmer la présence ou l'absence et la stabilité temporelle de la concentration en aérosol.
   4. Régler les paramètres de commande de processus (débit d'air, le vide, la pression, la puissance du générateur d'aérosol) aux valeurs requises qui dépend du nombre d'animaux à être connecté à l'unité d'inhalation. L'appareil d'inhalation et générateurs aérosols sont contrôlés en continu / contrôlé par un système d'acquisition de contrôle de processus informatisé / de données (DACO) fourni par le fabricant (voir le tableau des Matériaux et réactifs). Le débit d'air dans l'unité d'inhalation doit être au minimum environ 2 fois le taux de renouvellement d' air total de minutes de tous les animaux de l'unité d'inhalation afin d'éviter une accumulation de CO _2.
2. Les souris charger dans retardateurs de nez seulement avant l' exposition à des aérosols dans l'unité d'inhalation par le nez seulement. Charger également les animaux de contrôle du stress de retenue dansà respirer l'air restrainers ambiante.
   REMARQUE: Une expérience dose / réponse est constituée de plusieurs groupes de souris exposées à des aérosols pour différentes quantités de temps. Le temps d'exposition est utilisé pour contrôler la dose de chaque groupe reçoit au cours d'une expérience dose / réponse.
   1. Angle du tube de retenue vers le plafond tout en essayant de charger les animaux, car ils ont tendance à courir vers le haut en essayant d'échapper. Montrer du doigt les tubes vers le bas pendant le chargement encouragera de se retourner et échapper à l'arrière du tube. Assurez-vous le nez de la souris est orientée dans l'extrémité pointue du tube et fixer le piston-position variable dans l'extrémité arrière du dispositif de retenue.
      NOTE: Le piston est façonné pour permettre à la queue de la souris pour faire saillie à partir du support, ce qui permet à la souris pour réguler sa température corporelle alors que dans le dispositif de retenue.
   2. Ajuster le piston pour permettre aux souris de tourner, mais ne tourne pas en tête-bêche; pour assurer l'aérosol est inhalé.
   3. surveiller en permanence latandis que les souris dans les tubes de retenue. Après avoir placé le piston, une petite souris (<20 g) essaient souvent de tourner la tête à la queue dans les tubes et adoptent une position U, où ils ont de la difficulté à respirer. Ce comportement de rotation est le plus répandu dans les 5 premières minutes de la retenue, après que les souris tentent rarement de tourner la tête à la queue.

3. Livraison en aérosol

1. Insérer un bouchon pour boucher les orifices de distribution de l'unité d'inhalation et d'activer le générateur d'aérosol, le contrôleur de flux d'air comprimé, et l'unité d'inhalation pompe à vide à partir du logiciel de commande de processus.
2. Une fois que les lectures de l'écran en temps réel d'aérosol démontrent la concentration d'aérosol doit venir à l' équilibre (~ 30 min, Figure 2), commencer à enlever les bouchons et en insérant les tubes uniquement nez de retenue contenant les souris dans l'unité d'inhalation. Répétez jusqu'à ce que toutes les souris à être exposés à des médicaments sont connectés à l'unité d'inhalation.
   REMARQUE:l'expérience d'exemple, le débit d'air total fourni à l'unité d'inhalation par l'intermédiaire du générateur d'aérosol et l'air de dilution est réglé pour fournir un débit de 0,5 L / min à chacun des ports d'exposition des animaux en cours d'utilisation. Par exemple, un débit d'air total / min 15 L est suffisant pour alimenter chacun des 30 ports dans l'unité d'inhalation. Cela est beaucoup plus le débit d'air que nécessaire par la ventilation-minute de la souris, mais un flux d'air plus importante est nécessaire pour alimenter le (chute de pression dans le générateur d'aérosol) d'énergie pour produire (atomiser / de-agglomérat) l'aérosol.
3. Une fois que tous les animaux sont chargés dans l'unité d'exposition, mettre en marche les pompes de prélèvement sous vide qui sont connectés au filtre absolu et impacteur en cascade à l'aide du logiciel de commande de processus.
4. Lorsque toutes les expositions sont terminées, éteignez le générateur d'aérosol et retirer les souris restantes de l'unité d'inhalation.
   NOTE: Les animaux seront traités dans une hotte de la station de changement ou par du personnel portant un masque facial. Après la conclusion de distribution d'aérosol, les souris sont removed des tubes et les tubes sont désinfectés après chaque utilisation.

4. Calcul de la dose Déposés

1. Pour calculer la dose déposée ²⁹ en pg / kg (équation 1) multiplier la concentration du médicament dans l'aérosol (ug / L) x minute ventilation (L / min) x durée de l' exposition (min) x fraction inhalable x fraction de dépôt pulmonaire et diviser par le poids corporel (kg).
2. Calculer la concentration d'aérosol (ug / L) en divisant la masse de médicament sur le filtre absolu (ug) par le débit d'air à travers le filtre (L / min) multiplié par le temps d'échantillonnage (min). Estimer la ventilation minute de la souris par une équation allométrique basée sur le poids de ³⁰ corps. La fraction inhalable est une que l'aérosol a été passé à travers un pré-séparateur pour éliminer les particules non respirables, et la fraction de dépôt pulmonaire est déterminée à partir du MMAD d'aérosol de médicament (Figure 3) à l' aidedes courbes d'étalonnage expérimentaux d'aérosols monodispersés (figure 4) ^31.

Résultats

Le bromure d'ipratropium bronchodilatateur a été dissous dans 0,9% de solution saline normale à une concentration de 1 mg / mL. Une seringue de 100 ml a été rempli avec la solution de formulation d'ipratropium et la seringue a été insérée dans une pompe à seringue fixé pour alimenter le nébuliseur à jet (figure 1) à un débit de 1 mL / min. Activation du système de commande pour l'unité d'inhalation déclenche une 10 L / min Débit d'air vers le nébuliseur à jet, 5 L / min dilution écoulement d'air à la chambre de dilution, et 15,5 L / min de flux d'air d'aspiration pour attirer l'aérosol de médicament sur la unité d'inhalation une fois qu'il passe devant le nez de la souris. La pompe de seringue et en temps réel pompe à échantillon de contrôle d'aérosol ont été activés. Vingt-quatre souris ont été insérés dans l'unité d'inhalation après le moniteur d'aérosol en temps réel confirme la concentration d'aérosols dans l'unité d'inhalation était arrivé à l' équilibre (15 à 30 min, Figure 2). L'échantillon pompes pour le filtre absolu (1 L / min) et en cascadeimpacteur (0,5 L / min) ont été mis sous tension une fois que toutes les souris ont été connectés à l'unité d'inhalation. Le premier groupe de huit souris a été retiré de l'appareil d'inhalation après 5 min, le deuxième groupe après 15 min, et le troisième groupe après 45 min. ³² bronchoconstriction a été mesurée comme l'augmentation de la résistance du système respiratoire (RR) à une seule dose de méthacholine nébulisée (30 mg / ml) a livré 2 h après l' administration d' ipratropium en utilisant le respirateur pour rongeurs ^33. L'augmentation pour cent de Rrs pour chaque animal, calculé comme RCV maximale sur l'intervalle de 3 min après nébulisation méthacholine (Rmax) moins la valeur Rrs de la mesure de référence avant la méthacholine (Rbase) divisé par Rbase (% d'augmentation de Rrs = (Rmax -Rbase) / Rbase), a été utilisé pour quantifier la bronchoconstriction.

L'aérosol déposées sur les filtres de impacteur en cascade et filtre absolu pendant 45 min d'exposition aérosol a été dissous dans50% d'acétonitrile et la masse de l'ipratropium quantifiée par HPLC (tableau 1). Le MMAD x / GSD de l'aérosol d'ipratropium a été calculée comme étant de 1,7 x / 1,5 pm (Figure 3) et une fraction de dépôt (DF) de 0,037 pour les souris a été utilisée pour un aérosol avec un MMAD de 1,7 um (figure 4). La fraction inhalable (IF) a été 1 comme aérosol a été passé à travers un pré-séparateur pour éliminer les particules non respirables. La concentration moyenne de l'ipratropium dans l'aérosol (0,5 mg / L) a été calculée à partir de la masse d'ipratropium sur le filtre absolu (22 ug), divisé par le débit d'écoulement de l'air tiré à travers le filtre (1 L / min) multiplié par le temps d'échantillonnage (45 min). Le poids corporel moyen des souris était de 0,019 kg et de leur ventilation par minute a été calculé comme prédit 0,021 L / min. En utilisant l'équation 1, les doses déposées à des 5, 15 et 45 min groupes d'exposition étaient de 0,1, 0,3 et 0,9 ug / kg; respectivement.

= « 1 »> Ipratropium inhibée nébulisée bronchoconstriction induite par la méthacholine chez les souris C57BL / 6 ont huit semaines. Méthacholine a augmenté Rrs en quelques secondes d'administration nébulisée (figure 5, panneau supérieur). RCV du groupe témoin (exposées à l' air ambiant au lieu d'aérosol d'ipratropium) a augmenté à partir d' une valeur initiale de 0,62 ± 0,03 cmH ₂ O * s / mL à une valeur maximum de 1,66 ± 0,12 cmH ₂ O * s / mL, ce qui représente un 168 ± 9% d'augmentation RCV, 70 s après l'administration d'aérosol de méthacholine. Le pour cent d'augmentation de la résistance du système respiratoire a été inhibée d'une manière dépendante de la dose par inhalation de doses ipratropium. L'augmentation pour cent de Rrs a été inhibée par 51 ± 9%, 79 ± 14% et 89 ± 2% (Figure 5, panel bas) à des doses déposées par inhalation d'ipratropium de 0,1, 0,3 et 0,9 ug / kg, respectivement.

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Figure 1: Unité d'inhalation avec générateur d'aérosol de poudre sèche fixée. Le nébuliseur utilisé pour produire un aérosol à partir de formulations liquides est indiquée sur la droite. 1) l'alimentation de la poussière Wright, 2) cyclone, 3) Pompe de seringue, 4) nébuliseur à jet insérée dans pré-séparateur, 5) mélangeur d'air de dilution. Lors de la livraison des aérosols nébulisées, la charge de poussière cyclone et sont remplacées par la pompe à seringue, un nébuliseur à jet / pré-séparateur, et la dilution mélangeur d'air. La vue agrandie (modifié à partir de Oldham ²¹⁾ montre le trajet d'écoulement d'aérosol dans la zone de respiration autour du nez de l' animal qui est créé par l' insertion du tube de retenue dans l'appareil d'inhalation. L'aérosol remplit la chambre d'aérosol central (gris) de l'unité d'inhalation, sort au nez de l'animal où il est tiré vers l'arrière par une légère dépression dans le plénum extérieur (blanc) et dans les filtres de collecte de déchets (non représenté). PLla facilité cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: en temps réel des mesures de surveillance des aérosols confirment la concentration d'aérosol dans l'unité d'inhalation atteint l' équilibre ~ 30 minutes après la mise sur le générateur d'aérosol. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3: masse Ipratropium recueillies sur chaque étape de la impacteur en cascade (graphique à barres bleu) recouvert d'ajustement de courbe (courbe noire) utilisée pour calculer le MMAD et GSD de la distribution de la taille des particules d'aérosol. S'il vous plaîtcliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4: fraction de dépôt pour les poumons de souris en fonction du MMAD pour les aérosols délivrés par inhalation par le nez seulement (tel que modifié à partir de Hsieh ^31). Pour des tailles de particules inférieures à 0,5 pm plus de l'aérosol est exhalée et ne se dépose pas dans les poumons (comme la fumée de cigarette). Pour des tailles de particule supérieure à 5 um, la plupart de l'aérosol est filtré par le nez. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5: L'augmentation rapide de la résistance du système respiratoire induite par la méthacholine nébulisée administerouge à des souris est bloquée par ipratropium délivrée par inhalation par le nez seulement à des souris (n = 8 par groupe, panneau supérieur). Ipratropium a inhibé la méthacholine augmentation induite par la résistance du système respiratoire avec une ED ₅₀ de 0,1 ug / kg de dose déposée (* p <0,05 par rapport au témoin, panneau inférieur). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Cascade de données impacteur utilisées pour calculer MMAD et DLG
stade filtre	Ipratropium sur le filtre par HPLC (mg)	étape Cut Diamètre (mm)
1	0,002	6
2	0,19	4.5
3	1,43	2,5
4	2,55	1.5
5	2,95	1.2
6	1.03	0,7
7	0,37	0,5

Tableau 1: Données de l' impacteur en cascade utilisée pour calculer MMAD et GSD

Discussion

Système d'inhalation par le nez seulement et son fonctionnement pour délivrer des aérosols pharmaceutiques aux poumons de rongeurs ont été décrits. animaux Contention dans les porte-nez seulement est une méthode couramment utilisée pour exposer les animaux à la matière aéroportée. Une expérience a été menée démontrant le bromure d'ipratropium bronchodilatateur anticholinergique ³⁴ peut puissamment inverser la méthacholine bronchoconstriction induite lors de la livraison par inhalation par le nez seulement à des souris avec une _DE50 de 0,1 ug / kg dose déposée. Une augmentation de plus de 10 fois de la dose efficace d'ipratropium était nécessaire pour la bronchodilatation suivant la livraison intratracheale (ED ₅₀ intratracheale = 1,3 ug / kg, données non représentées) suivant. Ceci est dû au motif de dépôt non homogène du médicament dans les poumons par administration intratracheale produits ^{3, 5, 10.} 10 fois et une plus grande dose efficaceles différences entre les techniques de dosage inhalés et intratrachéales pour d' autres médicaments ont été observés précédemment par d' autres ^4.

Le motif de dépôt non homogène du médicament dans les poumons par administration intratracheale produites ralentit également l' absorption du médicament par le poumon ^35, ce qui diminue la vitesse à laquelle le médicament pénètre dans la circulation systémique et de diminuer les chances de voir les effets secondaires systémiques. Par conséquent, afin d' optimiser la sécurité / efficacité (indice thérapeutique) ³⁶ de nouveaux médicaments inhalés, la livraison par inhalation nez ne doit être utilisé. dépôt intratrachéale donnera une estimation erronée de la TI en générant des doses efficaces faussement élevés dans les doses pulmonaires et faible à la circulation systémique.

Comme de nouveaux médicaments livrés par voie inhalée sont développés, il est essentiel de traduire de façon appropriée la dose de médicament efficace à partir d'études d'efficacité précliniques pour prédire une efdose humaine ficacious pour les essais cliniques. La mort infâme de Tusko l'éléphant ³⁷ est souvent cité dans la littérature pour nous rappeler d'utiliser l' échelle allométrique pour prédire les doses de médicaments interspécifique et que interspécifiques doses de médicament ne doit pas être linéairement extrapolée sur la base d'une simple comparaison des masses corporelles. Il est courant d'utiliser une approche allométrique avec un exposant allométrique b de 0,67 pour prédire les doses de médicaments humains provenant d' études précliniques sur l' efficacité ^38. Utilisation de la souris par inhalation ED ₉₀ de 0,9 ug / kg pour ipratropium, un exposant allométrique de 0,67, une masse corporelle de la souris de 0,03 kg, et une masse de corps humain de 60 kg; un ED humain d' environ ₉₀ 0,07 ug / kg ((0,9 * (0,03 / 60) ^{(1 à 0,67)} = 0,07) peut être calculée comme étant la dose déposée humaine prédite à partir de nos données de souris. Cette valeur prédite est comparable à l'humain réel dose déposée efficace de 0,26 ug / kg, qui peut être calculé à partir du rendu dose de 40 ug ³⁹ divisée par la masse du corps humain de 60 kg , multiplié par une fraction de dépôt pulmonaire par inhalation orale humaine ¹⁶ de 0,4 ((40/60) * 0,4 = 0,26). Une estimation de la dose déposée par inhalation humaine efficace contribue également à planifier les doses délivrées utilisées dans les études de toxicologie par inhalation nécessaires pour les essais cliniques ^40.

L'équipement spécialisé et une grande quantité de composé d'essai (quantités de gramme) nécessaire pour l'administration de médicaments par inhalation nez ne peut avoir des limites importantes lors du développement de la technique d'inhalation par le nez seulement. Une course d'étalonnage sans animaux présents est nécessaire si une dose spécifique est nécessaire pour une étude (en général, la toxicologie et non une dose d'efficacité / de réponse), et cette course de calibrage nécessitera plus de médicament soit disponible. Cette course de calibrage est nécessaire parce que les propriétés physico-chimiques de chaque médicament / formulation peut varier assez pour affecter considérablement la dose déposéede médicament dans les poumons. Optimisation des débits d'air et d'alimentation de médicament pour le générateur d'aérosol pendant le cycle d'étalonnage est nécessaire pour obtenir une taille de particules d'aérosol et la concentration de la dose spécifique requise. Tandis que l'air générateur d'aérosol et les taux alimentation de médicament ont été proposées dans les procédés sont un point de départ raisonnable, il est possible que, pour une formulation de médicament spécifique d'un non-respirable (taille des particules> 5 mm) aérosol est généré. Au stade pré-clinique, il n'y a souvent pas suffisamment de médicament disponible pour faire une course d'étalonnage et il est impossible de savoir a priori quelles doses (le cas échéant) sont entrer dans les poumons. De plus, l'électricité statique est produite pendant le processus de production d'aérosol et peut influencer le temps nécessaire à la concentration d'aérosol à équilibrer. Il est important de bien l'équipement sol pour minimiser la charge statique. Une autre option pour réduire au minimum l'électricité statique est d'ajouter de l'humidité à l'air fourni à l'unité d'inhalation, pour augmenter la conductivité etdissiper les charges électrostatiques sur les particules ^25. Humidifiant l'air fourni au générateur d'aérosol n'est pas nécessaire pour le confort des animaux pendant de courtes (<1 h) sessions de dosage, mais doit être envisagée si les temps sont utilisés plus de dosage.

Les médicaments peuvent être livrés aux poumons des animaux par inhalation nasale seulement passif ou méthodes d'administration intratrachéale directe qui contournent le dépôt nasopharynx. Livraison par inhalation nez seulement est couramment utilisé dans le domaine de la toxicologie par inhalation ⁴¹ mais est peu utilisé au début du processus de découverte de médicaments. Une équipe de recherche multidisciplinaire est nécessaire pour la réalisation d'études d'inhalation par le nez seulement en raison du: besoin de grandes quantités de médicaments, des connaissances spécialisées nécessaires pour formuler, générer et caractériser les aérosols; faire fonctionner l'équipement complexe et mesurer l'efficacité des médicaments dans des modèles animaux de maladies respiratoires. Les techniques de livraison décrits ici sont utilisés pour développer Smalmolécule l médicaments inhalés mais à l'avenir peut être appliquée pour développer des produits biologiques inhalés ^{42, 43.} Espérons que les procédures et conseils documentées dans ce manuscrit faciliteront la découverte de médicaments pré-cliniques et chercheurs toxicologie à acquérir les compétences nécessaires pour délivrer des médicaments aux rongeurs par inhalation d'aérosol.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nose-only exposure inhalation unit	TSE systems	700100-KNES-040-ss	Custom configurations available
DACO data acquisition system	TSE systems	700400-PRO-C-D/1
MC One Jet Mill	Jetpharma	DEC MicroJet 10
Turbula Mixer	GlenMills Inc	T2F
Micronized Lactose	DFE Pharma	Lactohale 200
Hydraulic press	Specac	GS15011
Cascade impactor filters	Pall Life Sciences	7219	Emfab filter
Absolute filters	Whatman	10370302	5 cm diameter
Real time aerosol monitor Microdust Pro Monitor	Casella	CEL-712
Ipratropium bromide	Spectrum Chemical	I1178	pre-micronized
flexiVent FX1 system	scireq	FV-FXCS