Pó seco e nebulizada de inalação de aerossóis de produtos farmacêuticos entregue no Ratos Usando um nariz somente Sistema de Exposição

Resumo

A unidade de inalação aqui descritos possam gerar, de amostra para a caracterização, e uniformemente depositar um aerossol da droga nos pulmões de roedores. Isto permite a determinação de pré-clínica da eficácia e segurança das doses de medicamentos depositados nos pulmões; dados fundamentais que permitem o desenvolvimento de medicamentos inalados clínica.

Resumo

doenças respiratórias obstrutivas como asma e doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) são actualmente tratadas por drogas anti-inflamatórias e broncodilatadores inalados. Apesar da disponibilidade de tratamentos múltiplos, ambas as doenças estão crescendo preocupações de saúde pública. A maioria dos doentes com asma são bem controlados em terapias de inalação correntes, mas um número substancial de pacientes com asma grave não são. A asma afeta cerca de 300 milhões de pessoas no mundo e aproximadamente 20 por cento têm uma forma grave da doença. Em contraste com a asma, existem poucas terapias eficazes para a DPOC. Estima-se que 10% da população tem DPOC e a tendência das taxas de mortalidade está aumentando para a DPOC, enquanto diminui para outras doenças graves. Embora desenvolvimento de drogas para entrega inalado é um desafio, a unidade de inalação apenas de nariz permite a entrega directa de novos fármacos para o pulmão de roedores para os estudos de eficácia e segurança / toxicologia pré-clínicos. entrega da droga inaladatem múltiplas vantagens para doenças respiratórias, em que a alta concentração no pulmão melhora a eficácia e minimiza os efeitos secundários sistémicos. corticóides e broncodilatadores inalados beneficiar destas vantagens e entrega inalado pode também realizar potencial para futuras terapias biológicas. A unidade de inalação aqui descritos possam gerar, de amostra para a caracterização, e uniformemente depositar um aerossol da droga nos pulmões de roedores. Isto permite a determinação de pré-clínica da eficácia e segurança das doses de medicamentos depositados nos pulmões de roedores, os dados-chave necessária antes de se iniciar o desenvolvimento clínico.

Introdução

Há muitas vantagens para administração por inalação de medicamentos para o tratamento de doença respiratória. entrega inalado aplica-se o agente terapêutico directamente ao local de acção, os pulmões. Uma concentração local elevada do fármaco nos pulmões oferece uma vantagem significativa que minimiza a dose e a exposição sistémica, e maximiza a eficácia. Esta é uma vantagem importante de que podem aumentar grandemente o índice terapêutico (TI, proporção de dose de droga que provoca um efeito secundário sobre a dose de medicamento que fornece eficácia) de um fármaco. Inalados β agonistas _{P2-adrenérgicos,} os corticosteróides e as drogas anti-colinérgicos provaram ser eficazes na melhoria da função pulmonar em doentes com asma e DPOC, enquanto minimiza os efeitos secundários sistémicos (taquicardia, imunossupressão, e prisão de ventre) observados quando estes fármacos são tomados por via oral. Novas classes de drogas (por exemplo, inibidores de PDE4 e inibidores de BTK ^{1 2)} têm recentementeprovaram ser eficazes na melhoria da função pulmonar em modelos pré-clínicos de doenças animais mas, semelhantes a agonistas? _2, corticosterdes, e fármacos anti-colinérgicos, sofrem de efeitos secundários sistémicos que podem ser minimizadas por entrega inalado. Devido ao custo adicional de desenvolvimento de drogas orais inalados vs, uma formulação de inalado só deve ser considerada para indicações respiratórias após administração oral / sistémica bem sucedida revela limitador de dose de efeitos secundários sistémicos com base no mecanismo.

Pré-clínico, os compostos inalados são optimizados para aumentar a TI, que requer eficácia in vivo e efeitos colaterais medições. Inicialmente estas medidas podem ser feitas em ensaios separados, geralmente uma medição topicamente entregue eficácia e uma medição de efeitos colaterais sistemicamente entregue, mas para comparar verdadeiramente compostos, eficácia e efeitos secundários deve ser medido nos mesmos animais após administração inalados. Isto requer estudos de dose / resposta que achieve composto suficiente administrado aos pulmões para induzir um efeito colateral mensurável. A única maneira actualmente para distribuir uniformemente grandes doses de medicamento para dentro dos pulmões de vários animais pequenos ao mesmo tempo é apenas de nariz inalação ^{3, 4, 5.} Os pontos fortes e fracos de diferentes técnicas de exposição de inalação foram recentemente revisto ^{6, 7, 8.} O equipamento especializado e uma grande quantidade de composto de ensaio (quantidades em gramas) são necessários para o nariz apenas de entrega de droga inalada, mas a prova de conceito estudos pode ser possível por outros meios.

Quando a quantidade de fármaco é limitada (mg quantidades), métodos de administração directa são uma opção, mas todos sofrem de deposição não homogénea, com mais droga concentrada ao longo das vias aéreas centrais e menos bem representados no parênquima / alveolarregiões ^{3, 4, 5.} A dose eficaz entregue por instilação directa é sempre mais elevado e nunca podem ser directamente comparados para doses inaladas ^4. Métodos de instilação directa, incluindo intranasal ^9, intratraqueal líquido ^{10, 11} e pulverização instilação ^12, ou por insuflação de pó seco ^{13, 14} pode ser utilizado como uma ferramenta de rastreio para determinar o intervalo de dose aproximada para estudos de inalação pelo nariz apenas mais tarde, ou para determinar o Classificação de eficácia / toxicidade por uma série de medicamentos semelhantes estruturalmente ^15. Devido ao padrão de deposição das vias aéreas centrais, métodos de administração directa pode ser mais útil para determinar os efeitos dos compostos que actuam sobre as vias respiratórias centrais (broncodilatadores ou inibidores dos mastócitos) do que in o pulmão periférica (anti-inflamatórios).

Ao contrário dos seres humanos, que pode inalar uma dose de aerossol substancial concentrado a partir de um inalador de uma única respiração profunda, a geração contínua de um respirável (0,5-5? M de diâmetro aerodinâmico médio de massa, MMAD) de aerossol, durante até uma hora, é necessário para depositar uma dose eficaz da droga para os pulmões de um roedor com respiração espontânea em um sistema de inalação apenas de nariz ^16. Geradores de aerossol (nebulizador de jacto ou a alimentação de pó Wright ¹⁷⁾ que pode produzir continuamente o tamanho de partícula de aerossol necessária e concentração para estudos de inalação pelo nariz apenas não são muito eficientes para a geração de alta qualidade aerossóis (respiráveis). As taxas de alimentação de drogas a estes geradores de aerossóis para potente (IC ₅₀ pM a nM em ensaios baseados em células funcionais) compostos são comumente no intervalo de 1 a 10 mg / intervalo de minutos e, geralmente, menos do que 1% do que o aerossol da droga torna-o para a zona de respiração dos animais(Figura 1). Muitas das partículas geradas são demasiado grande (> 5 um) para entrar nos pulmões e são removidos por um classificador de aerossol (um pré-separador ou ciclone com um ponto de corte de 5? M) para evitar uma grande dose de droga no nariz. Somando-se a ineficiência dos sistemas de inalao pelo nariz apenas é o pequeno intervalo de tamanho de partícula (0,5 a 5 um MMAD) de partículas respiráveis. Muitas das partículas de aerossol inferior a 0,5 um são exalados (como o fumo do cigarro) e não depositada nos pulmões ^18. Além disso, muitas das partículas de aerossol "maior" (~ 5 m) de depósito no nariz são absorvidos ou transportado por depuração mucociliar em direcção a parte posterior da garganta onde eles são engolidas para o estômago ^19. Ao utilizar a inalação só de nariz, a dose depositada no nariz é sempre maior do que a dose depositada nos pulmões e a dose nasal pode contribuir para a exposição sistémica e efeitos secundários ^20. Inerentemente, Dru inaladog doses são pequenos (na gama de microgramas) minimizar qualquer potencial efeito colateral sistémica de fármaco absorvido pelo nasal, pulmonar, ou tecidos gastrointestinais. Mesmo quando o tamanho de partícula do aerossol fornecida aos animais está na gama respirel, uma média de apenas 4% das partículas de aerossol que tornam a zona de respiração do depósito de animais nos pulmões. geradores de aerossol mais eficientes estão disponíveis, mas o nebulizador de jacto e alimentação de pó são Wright inigualável para a sua capacidade de produzir aerossóis contínuas a partir de diversas formulações de pós secos e líquidos, respectivamente.

Aerossol respirável a partir do pré-separador passa para a unidade de inalação de exposição somente de nariz ²¹ que se baseia em um fluxo passado a concepção ^de ponta ^22. A unidade de inalação tem 3 camadas (apenas duas camadas são mostradas na Figura 1) e cada camada contém 10 portas de exposição para animais e amostragem de aerossol. Os portos estão localizados perifericamente ao redor do ceplenum aerossol ntral. ratinhos conscientes são colocadas em suportes de retenção de vidro (6 polegadas de comprimento por 1,2 polegadas de diâmetro) e respirar o conteúdo de aerossol da unidade de inalação. Os ratos não são aclimatados aos dispositivos de retenção ^23. A experiência anterior demonstrou que os ratinhos tolerar contenção tubo de menos de uma hora de duração de modo semelhante, com ou sem adaptação ^2.

A unidade de inalação destina-se a entregar aerossóis de drogas directamente nos pulmões dos animais, evitando a exposição aos operadores. A potência / toxicidade dessas drogas é geralmente controles de segurança de engenharia desconhecidos e múltiplas são usados ​​para evitar a exposição aos operadores. Os operadores devem sempre usar equipamento de proteção individual (luvas, casacos de laboratório, respiradores e óculos de segurança). A câmara de pressão exterior da unidade de inalação está sob pressão negativa em todos os momentos durante a operação, permitindo a remoção segura do único ou grupos de animais without desligar o gerador de aerossol. A unidade de inalação também está contido num invólucro secundário mantido a uma pressão negativa por uma abertura de escape no tecto para evitar qualquer fuga de aerossol para dentro do quarto, no caso de mau funcionamento. Todo o ar efluente do sistema de inalação é filtrado por um filtro HEPA antes da libertação para o ambiente. O sistema de exposição só de nariz usada neste manuscrito foi comprado de um único fornecedor (ver Tabela Suplementar de Materiais).

Protocolo

Os ratos utilizados nestes estudos foram tratados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, oitava edição ^24. Os ratinhos foram alojados em grupo uma associação de Avaliação e Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) facilidade internacional-acreditados no alojamento microisolator ventilado estéril na cama de espiga de milho. Quando se mede a broncoconstrição, os ratos foram anestesiados com 100 mg / kg de pentobarbital de IP e a profundidade da anestesia foi monitorizada por falta de reflexo de dedo de aperto e mantidas por anestesia ip como necessário. No final das experiências, os ratinhos foram sacrificados por luxação cervical após overdose de barbitúrico. Verificação da eutanásia foi confirmada por falta de respiração. Não cirurgias de sobrevivência foram realizados em ratos. Todos os protocolos de pesquisa foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC).

1. Formulação e Seleção de dispositivo de Geração de PharAerossóis maceutical

NOTA: Formulação e selecção do dispositivo são dependentes das propriedades físico-químicas do fármaco particular a ser transformado em aerossol, por conseguinte, os protocolos gerais são apresentados a seguir e o leitor é remetido para as avaliações por Zeng ²⁵ e ²⁶ O'Riordan.

1. Aerossóis de pó seco
   1. Micronizar droga pós secos em um moinho de bolas, moinho de jacto ou dispositivo semelhante ²⁷ e garantir a distribuição de tamanho de partícula micronizada (PSD) contém partículas de respirável (0,5-5 um de diâmetro aerodinâmico mediano, MMAD massa) tamanho de partícula. Misturar os compostos de teste potentes, que necessitam de diluição com lactose micronizada.
      NOTA: Se não houver pó micronizado suficiente para determinar a PSD com um impactor em cascata, o PSD de um pequeno (sub-miligramas) de uma amostra do pó micronizado pode ser medida por dispersão de luz para confirmar que contém pequenas partículas / respiráveis.
   2. Gerar o aerossol de pó seco usando uma alimentação de pó gerador de aerossol de pó seco Wright. Embalar o pó de droga micronizada / lactose para o reservatório cilíndrico utilizando uma prensa hidráulica manual a cerca de 1000 libras por polegada quadrada (psi) para produzir bolos compactados de pó usado como entrada pelo Wright alimentação de pó ¹⁷ do gerador de aerossol.
   3. Parafuso do reservatório cilíndrico para a alimentação de pó Wright avançar o reservatório até que a lâmina de raspador está em contacto com o bolo droga.
   4. Ligue a saída da alimentação de pó de Wright para um ciclone e a entrada de uma fonte de ar comprimido, conforme a taxa de fluxo de ar de 15 L / min (pressão máxima de 90 psi).
   5. Regule o controlo do caudal de alimentação de 0,7 rotações por minuto (rpm) e ligar o gerador de aerossol de alimentação Wright poeira.
      NOTA: 0,7 rpm corresponde a uma taxa de alimentação de bolo de artigo de teste de 1 g / h quando se usa a pequena Wright Dust reservatório de alimentação cilíndrica. A alimentação de Wright Dust raspa uma camada fina de po compactadowder fora do artigo bolo de teste através da rotação do reservatório. Ar transporta o pó para fora da alimentação de pó Wright, através de um injector sónico para desaglomerao, e para dentro de um ciclone para remover as partículas e aglomerados não respiráveis.
   6. Conectar a saa do ciclone para a câmara de pressão de aerossol central da unidade de inalação (Figura 1).
      NOTA: Os compostos podem ser comprimidos 300-1500 psi no reservatório de alimentação do pó de Wright. O objectivo é o de comprimir as partículas suficiente, de forma que será retido no reservatório quando invertida, mas não tanto que a alimentação de pó Wright não pode raspar uma camada fina para a re-dispersão em aerossol. Deve ser lembrado que o calibre na prensa hidráulica manual lê em libras e o êmbolo no pequeno reservatório de alimentação de pó tem uma área de superfície de cerca de 0,25 polegada quadrada. Portanto, a 250 libras de força de compressão de 0,25 polegada quadrada equivale a 1000 psi.
2. Aerossóis líquidos nebulizadas
   1. Dissolve-se o fármaco em 100 ml de água ou solução salina fisiológica.
   2. Carregar uma seringa de 100 ml com a solução de fármaco e colocar a seringa na bomba de seringa com um caudal ajustado a 1 mL / min.
   3. Ligar a bomba de seringa para o nebulizador de jacto e purgar o ar da linha de alimentação que conduz ao nebulizador.
   4. Ligar a fonte de ar pressurizado para o nebulizador de jacto e definir o medidor de fluxo de ar a 10 L / min.
   5. Insira o nebulizador de jato para o pré-separador. O pré-separador liga o nebulizador para o difusor de aerossol central da unidade de inalação (Figura 1).
      NOTA: Muitos compostos farmacêuticos têm limitado a solubilidade aquosa e são melhor formuladas como aerossóis de pó seco. Se uma suspensão estável pode ser feito a partir do composto micronizado (MMAD <5 uM), que pode ser usada com o nebulizador de jacto. Devem ser tomadas precauções como a suspensão pode entupir o nebulizador. As concentrações de alimentação de nebulizador de 1 mg / mL para os compostos potentes (como o broncodilatadoripratrópio) a 40 mg / foram usadas suspensões ml (para compostos menos potentes como sulfato de salbutamol). A taxa de alimentação da bomba de seringa é fixada em 1 ml / min por uma razão prática; para permitir que o período de equilíbrio, a concentração do aerossol e a exposição de 45 min de duração para ser completada sem a necessidade de recarregar a seringa.

2. Aerosol configuração da experiência Exposição

1. Medir a concentração de fármaco (por recolha de aerossol sobre um filtro absoluto) e distribuição de tamanho de partícula (por recolha de aerossol usando um impactor em cascata) do aerossol que entra na unidade de inalação de pós pré-separador / ciclone. Usar estes parâmetros, juntamente com a ventilação por minuto do animal, o peso corporal, e o tempo de exposição para estimar a dose do fármaco depositado nos pulmões.
   1. Pesar o filtro absoluto e registrar o peso do filtro. Colocar o filtro no suporte do filtro e montar o suporte do filtro. Ligar a entrada do suporte de filtro absolutoa uma porta de amostragem de aerossol plenum central e a saída de uma fonte de vácuo configurada para provar o aerossol com um caudal de 1 L / min durante a duração da experiência.
      NOTA: A massa de droga no filtro após a amostragem durante 45 min pode estar na gama de sub-microgramas e / ou ser misturados com lactose, sal de NaCl, ou outro veículo. Um microbalança que lê a 0,1 microgramas é necessário. Para obter um peso preciso de droga depositada sobre o filtro, o filtro deve ser equilibrada e pesados ​​em um ambiente com humidade controlada. O peso de droga sobre os filtros só pode ser utilizado no cálculo da dose se não há nenhum veículo na formulação ou o veículo é água. Quando há um veículo na formulação diferente de água, o peso da substância no filtro só dá um ponto de partida estimado para posterior análise do teor em droga por cromatograf ia líquida de alta eficiência (HPLC).
   2. Pesar e registrar o peso dos filtros de palco pêndulo 7 cascata e um final "pedaço da cauda"; filtro. Colocar um filtro em cada um dos sete estádios do impactador cascata e montar a Mercer de impacto em cascata ^28. Ligar a entrada do impactor em cascata para uma porta da amostra difusor de aerossol central e a saída de uma fonte de vácuo configurada para provar o aerossol na taxa de fluxo do impactor em cascata é calibrado em (normalmente 0,5 ou de 1 L / min) durante a duração do experimentar.
   3. Monitorar o conteúdo de aerossóis da unidade de inalação com o monitor de aerossol em tempo real (ver Tabela de Materiais e reagentes) para confirmar os geradores de aerossóis são funcionais e produzir um aerossol estável durante todo o experimento. Ligar a entrada do monitor de aerossol em tempo real para uma porta da amostra de aerossol e a câmara de pressão central de saída de uma fonte de vácuo configurada para provar o aerossol com um caudal de 1 L / min durante a duração da experiência.
      NOTA: O sinal do tempo real monitor de aerossol é relatada em mg / L, mas é calibrado para a poeira da estrada e deve ser recalibradopara cada um aerossol de medicamento individual, para se obter os valores de concentração de aerossol correctas. A calibragem não é necessário para usar o monitor para confirmar a presença ou ausência e estabilidade temporal da concentração do aerossol.
   4. Definir os parâmetros de controlo do processo (fluxo de ar, vácuo, pressão, gerador de aerossol de energia) para os valores desejados, que depende do número de animais a ser ligado à unidade de inalação. Os geradores de unidade de inalação e aerossol são continuamente controlada / monitorizada por um sistema de controlo de processo / aquisição de dados computadorizado (DACO) fornecido pelo fabricante (ver Tabela de Materiais e reagentes). Taxa de fluxo de ar para dentro da unidade de inalação devem ser minimamente cerca de 2 vezes a taxa total de minutos ventilação de todos os animais na unidade de inalação, de modo a evitar uma acumulação de CO _2.
2. Ratinhos de carga em limitadores pelo nariz apenas antes da exposição ao aerossol na unidade de inalação apenas de nariz. Carregar também retenção animais controle estresse empara limitadores a respirar ar ambiente.
   NOTA: Uma experiência de dose / resposta consiste em vários grupos de ratos expostos ao aerossol para diferentes quantidades de tempo. O tempo de exposição é usado para controlar a dose de cada grupo recebe durante uma experiência de dose / resposta.
   1. Ângulo a restrição tubo em direção ao teto ao tentar carregar os animais, pois eles tendem a correr para cima tentando escapar. Apontando os tubos para baixo durante o carregamento vai encorajar virar e escapar para fora da parte de trás do tubo. Certifique-se de nariz do rato está orientado para a extremidade pontiaguda do tubo e fixar o êmbolo de posição variável na extremidade traseira do limitador.
      NOTA: O êmbolo é formado para permitir que a cauda do rato para se projectar a partir do suporte, o que permite que o rato para regular a sua temperatura do corpo, enquanto no limitador.
   2. Ajustar o êmbolo para permitir que os ratos a rodar, mas não virar a cabeça à cauda; para assegurar que o aerossol é inalado.
   3. Monitorar continuamente oratos enquanto que nos tubos de restrição. Depois de posicionar o êmbolo, pequenos ratos (<20 gramas) com frequência tentam virar a cabeça à cauda nos tubos e adoptar uma inversão de posição em que eles têm dificuldade para respirar. Este comportamento de giro é mais prevalente nos primeiros 5 minutos de contenção, depois que os ratos raramente tentam virar a cabeça à cauda.

3. Aerosol Entrega

1. Inserir rolhas para tapar os orifícios de administração da unidade de inalação e activar o gerador de aerossol, controlador de fluxo de ar comprimido, e a bomba de vácuo unidade de inalação a partir do software de controlo do processo.
2. Uma vez que as leituras a partir do monitor de aerossol tempo real demonstrar a concentração de aerossol tem de entrar em equilíbrio (~ 30 min, a Figura 2), iniciar a remoção de rolhas e inserir os tubos do nariz-única de imobilização contendo ratinhos para a unidade de inalação. Repetir até todos os ratinhos para serem expostos a droga está ligada à unidade de inalação.
   NOTA: Emo experimento exemplo, o fluxo de ar total fornecida para a unidade de inalação através do ar do gerador de aerossol e de diluição é ajustado para fornecer uma taxa de fluxo / min 0,5 L de cada uma das portas de exposição de animais a ser utilizado. Por exemplo, de 15 L / min de fluxo de ar total suficiente para abastecer cada uma das portas 30 na unidade de inalação. Isto é muito mais do que o fluxo de ar exigido pelo ventilação minuto dos ratos, mas de um fluxo de ar maior é necessária para fornecer o (queda de pressão através do gerador de aerossol) para produzir energia (atomizar / de-aglomerado) o aerossol.
3. Uma vez que todos os animais são carregados para a unidade de exposição, ligar as bombas de amostragem de vácuo que são ligadas ao filtro e de impacto em cascata absoluto usando o software de controlo do processo.
4. Quando todas as posições são concluídas, desligue o gerador de aerossol e remover os ratinhos restantes da unidade de inalação.
   NOTA: Os animais serão tratadas em uma capa estação de mudança ou por pessoal usando uma máscara. Após conclusão da entrega de aerossol, os murganhos são removed a partir dos tubos e os tubos são desinfectados após cada utilização.

4. Cálculo da Dose Depositado

1. Para calcular a dose depositada ²⁹ em? G / kg (Equação 1) multiplicar a concentração do fármaco na lata de aerossol (ug / L) de ventilação x minuto (l / min) x tempo de exposição (min) x fracção inalável x fracção deposição pulmonar e dividir pelo peso corporal (kg).
2. Calcular a concentração de aerossol (ug / L) dividindo-se a massa de medicamento no filtro absoluto (ng) pela taxa de fluxo de ar através do filtro (l / min) multiplicado pelo tempo de amostragem (min). Estimar a ventilação por minuto do rato por uma equação alométrica base no peso corporal ^30. A fracção inalável é um aerossol como o foi passado através de um pré-separador para remover as partículas não respiráveis, e a fracção de deposição pulmonar é determinada a partir do MMAD do aerossol da droga (Figura 3) usandoAs curvas de calibração experimentais de aerossóis monodispersas (Figura 4) ^31.

Resultados

O brometo de ipratrópio broncodilatador foi dissolvido em 0,9% de solução salina normal com uma concentração de 1 mg / mL. Uma seringa de 100 ml foi cheio com a solução de formulação de ipratrópio e a seringa foi inserida numa bomba de seringa definido para alimentar o nebulizador de jacto (figura 1) a uma taxa de fluxo de 1 mL / min. A activação do sistema de controlo para a unidade de inalação inicia a 10 L / fluxo de ar min para o nebulizador de jacto, de 5 L / fluxo de ar de diluição min para a câmara de diluição, e 15,5 L / min de caudal de ar de vácuo para extrair o aerossol da droga para fora do unidade de inalação, uma vez que passa o nariz dos ratinhos. A bomba de seringa e a bomba de amostra do monitor aerossol tempo real foram ativados. Vinte e quatro ratos foram inseridos na unidade de inalação, após o monitor de tempo real aerossol confirma a concentração do aerossol na unidade de inalação tinha chegado ao equilíbrio (15-30 min, Figura 2). As bombas de amostra para o filtro absoluto (1 L / min) e cascatapêndulo (0,5 L / min) foram ligado uma vez todos os ratos estavam ligados ao aparelho de inalação. O primeiro grupo de oito ratos foi removido a partir da unidade de inalação, após 5 min, o segundo grupo, depois de 15 min, e o terceiro grupo, depois de 45 min. Broncoconstrição ³² foi medida como o aumento da resistência respiratória do sistema (Rrs) para uma dose única nebulizada de metacolina (30 mg / ml) entregues 2 h depois da dosagem de ipratrópio usando o respirador de roedor ^33. O aumento de percentagem em Rrs para cada animal, calculado como o máximo Rrs ao longo do intervalo de 3 minutos após a metacolina nebulizada (Rmax) menos o valor Rrs da medição da linha de base antes de metacolina (RBase) dividido por RBase (% de aumento em Rrs = (Rmax -Rbase) / RBase), foi utilizada para quantificar a broncoconstrição.

O aerossol depositado nos filtros de impacto em cascata e filtro absoluto durante 45 minutos de exposição ao aerossol foi dissolvido em50% de acetonitrilo e a massa de ipratrópio quantificada por HPLC (Tabela 1). O MMAD x / GSD do aerossol de ipratrópio foi calculada como sendo 1,7 x / 1,5 um (Figura 3) e uma fracção de deposição (DF) de 0,037 para os ratos foi usado para um aerossol com um DAMM de 1,7? M (Figura 4). A fracção inalável (IF) foi de 1 como o aerossol foi passada através de um pré-separador para remover as partículas não respiráveis. A concentração média de ipratrópio em aerossol (0,5 ug / L) foi calculada a partir de massa de ipratrópio no filtro absoluto (22 ug) dividida pela taxa de fluxo de ar puxado através do filtro (1 L / min) multiplicado pelo tempo de amostragem (45 min). O peso corporal médio dos murganhos foi 0,019 kg e a sua ventilação previu minutos foi calculada como 0,021 L / min. Utilizando a Equação 1, as doses depositadas para 5, 15, e 45 grupos de exposição mínimo foram de 0,1, 0,3, e 0,9 ug / kg; respectivamente.

= "1"> ipratrópio inibida metacolina nebulizada broncoconstrição induzida em 8 semanas de idade C57BL / 6. Metacolina aumentou Rrs dentro de segundos de administração nebulizada (Figura 5, painel superior). Os Rrs do grupo de controlo (expostas ao ar ambiente, em vez de aerossol de ipratrópio) aumentou de um valor de linha de base de 0,62 ± 0,03 cm H ₂ O * s / ml para um valor máximo de 1,66 ± 0,12 cm H ₂ O * s / mL, o que representa um aumento de 168 ± 9% em Rrs, 70 s após a administração de metacolina em aerossol. A percentagem de aumento na resistência do sistema respiratório foi inibida de uma maneira dependente da dose por doses inaladas de ipratrópio. O aumento de percentagem em Rrs foi inibida por 51 ± 9%, 79 ± 14%, e 89 ± 2% (Figura 5, painel inferior) em doses depositados inalados de ipratrópio de 0,1, 0,3, e 0,9 ug / kg, respectivamente.

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Figura 1: unidade de inalação com o gerador de aerossol de pó seco ligado. O nebulizador usado para gerar aerossol a partir de formulações líquidas é apresentada à direita. 1) alimentação de Wright poeira, bomba de seringa 2) ciclone, 3), 4) nebulizador de jacto inserido no pré-separador, 5) do misturador de ar de diluição. Quando entregar aerossóis nebulizadas, a alimentação de pó e de ciclone são substituídos pela bomba de seringa, nebulizador de jacto / pré-separador, e um misturador de ar de diluição. A vista alargada (modificado a partir de Oldham ²¹⁾ mostra o percurso de fluxo de aerossol na zona de respiração em torno do nariz do animal que é criado através da inserção do tubo de retenção na unidade de inalação. O aerossol enche o aerossol central de plenum (cinzento) da unidade de inalação, flui para fora para o nariz do animal, onde ele é puxado para trás por um ligeiro vácuo no (branco) de bombagem externa e para os filtros de recolha de resíduos (não mostrado). Plaliviar clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: As medições de monitor de aerossol em tempo real confirmar a concentração do aerossol na unidade de inalação atinge o equilíbrio ~ 30 min, depois de ligar o gerador de aerossol. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: massa de ipratrópio recolhidos em cada estágio do impactor em cascata (gráfico de barras azul) sobreposto com ajuste de curva (curva preto) utilizado para calcular o MMAD GSD e da distribuição do tamanho de partículas de aerossol. Por favorclique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: fracção de deposição para os pulmões do rato como uma função de DAMM para aerossóis administrados por inalação só de nariz (como modificado a partir Hsieh ^31). Para dimensões de partículas inferiores a 0,5 um a maior parte do aerossol é exalado e não depositar nos pulmões (como o fumo do cigarro). Para partículas de tamanho superior a 5 um, a maior parte do aerossol é filtrado pelo nariz. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: O rápido aumento da resistência do sistema respiratório induzido por metacolina nebulizada administevermelho para ratinhos é bloqueado por ipratrópio, administrados por inalação só de nariz de ratinhos (n = 8 por grupo, painel superior). Ipratrópio inibiu o aumento induzido por metacolina em resistência do sistema respiratório com um _ED50 de 0,1 ug / kg a dose depositada (* p <0,05 vs. controlo, painel inferior). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

dados de impacto em cascata usada para calcular DAMM e GSD
Filtro Stage	Ipratrópio no filtro por HPLC (mg)	Stage Cut Diâmetro (mm)
1	0,002	6
2	0,19	4,5
3	1,43	2,5
4	2,55	1.5
5	2,95	1,2
6	1,03	0,7
7	0,37	0,5

Tabela 1: Os dados de impacto de cascata usado para calcular e MMAD GSD

Discussão

Um sistema de inalação apenas de nariz e o seu funcionamento para entregar aerossóis farmacêuticos para os pulmões de roedores tem sido descrita. Imobilizar animais em suportes só de nariz é um método vulgarmente utilizado para a exposição dos animais ao material transportado pelo ar. Uma experiência foi conduzida demonstrando o broncodilatador anticolingico brometo de ipratrópio ³⁴ pode inverter potentemente metacolina broncoconstrição induzida quando administradas por inalação só de nariz para ratinhos com um ED ₅₀ de 0,1 g / kg a dose depositada. Um aumento superior a 10 vezes na dose eficaz de ipratrópio foi necessário para broncodilatação seguinte entrega intratraqueal _(ED50 intratraqueal = 1,3 ug / kg, dados não mostrados) de entrega. Isto é devido ao padrão de deposição não homogénea de droga nos pulmões produzidos por doseamento intratraqueal ^{3, 5, 10.} 10 vezes e uma maior dose eficazdiferenciais entre as técnicas de doseamento intratraqueal inalados e para outras drogas têm sido observados anteriormente por outros ^4.

O padrão de deposição não homogénea de droga nos pulmões produzidos por doseamento intratraqueal também retarda a absorção da droga pelo pulmão ^35, diminuindo a taxa à qual o fármaco entra na circulação sistémica e diminuindo a probabilidade de ver os efeitos secundários sistémicos. Portanto, para optimizar a segurança / eficácia (índice terapêutico) ³⁶ de novos medicamentos inalados, nariz entrega única de inalação deve ser usado. deposição intratraqueal vai dar uma estimativa imprecisa da TI, gerando erroneamente altas doses eficazes em doses baixas do pulmão e para a circulação sistémica.

À medida que novos medicamentos entregues pela via inalada são desenvolvidos, que é essencial para traduzir de forma adequada a dose de droga eficaz a partir de estudos pré-clínicos de eficácia para prever uma efdose humana ficacious para ensaios clínicos. A morte infame de Tusko o elefante ³⁷ é normalmente referido na literatura para lembrar-nos usar o dimensionamento alométrica para prever as doses de drogas interespécies e que doses entre espécies de drogas não deve ser linearmente extrapolado na base de uma comparação simples das massas corporais. É comum a utilização de uma abordagem alométrico com um expoente b alométrica de 0,67 para prever as doses de drogas em humanos a partir de estudos pré-clínicos de eficácia ^38. Utilizando o rato inalado _ED90 de 0,9 ug / kg para o ipratrópio, um expoente alométrico de 0,67, uma massa corporal do rato de 0,03 kg, e uma massa corporal humano de 60 kg; um ED humana estimada ₉₀ de 0,07 ug / kg ((0,9 * (0,03 / 60) ^(1-0,67) = 0,07) pode ser calculado como sendo a dose depositada humano prevista a partir nossos dados rato. Este valor predito é comparável ao humano real dose depositada eficaz de 0,26 ug / kg, a qual pode ser calculada a partir da entregue fazerSE de 40 ug ³⁹ dividida pela massa do corpo humano de 60 kg multiplicada por uma fracção de inalação deposição pulmonar oral humana de 0,4 ¹⁶ ((40/60) * 0,4 = 0,26). Uma estimativa da dose depositada inalado humano eficaz também ajuda a planear as doses administradas utilizados em estudos de toxicologia por inalação necessárias para ensaios clínicos ^40.

O equipamento especializado e grande quantidade de composto de teste (quantidades em gramas) necessária para o nariz apenas de entrega de droga inalada pode ser limitações significativas ao desenvolver a técnica de inalação apenas de nariz. Uma corrida de calibração sem animais presentes é necessário se for necessária uma dose específica para um estudo (geralmente toxicologia e não uma eficácia de dose / resposta), e esta calibração prazo exigirá mais droga para estar disponível. Esta execução de calibragem é necessário porque as propriedades físico-químicas de cada droga / formulação pode variar suficiente para afectar grandemente a dose depositadade droga nos pulmões. Optimização das taxas de alimentação de ar e da droga para o gerador de aerossol durante a calibração de execução é necessária para atingir um tamanho de partículas de aerossol e concentração para a dose específica necessária. Enquanto as taxas de ar e de alimentação gerador de aerossol de medicamentos sugeridos nos métodos são um ponto de partida razoável, existe um potencial para que uma formulação de fármaco específico será gerado um não-respiráveis ​​(tamanho de partícula de> 5 mm) de aerossol. Na fase pré-clínica, muitas vezes não há medicamento suficiente disponível para fazer uma corrida de calibração e é impossível saber a priori quais doses (se houver) estão ficando para os pulmões. Além disso, a electricidade estática é produzido durante o processo de geração de aerossol e pode influenciar o tempo necessário para a concentração de aerossol para equilibrar. É importante aterrar corretamente o equipamento para minimizar carga estática. Outra opção para minimizar a electricidade estática é para adicionar humidade ao ar fornecido para a unidade de inalação, para aumentar a condutividade edissipar as cargas electrostáticas nas partículas ^25. Humidificar o ar fornecido para o gerador de aerossol não é necessária para o conforto dos animais durante 1 h (<) sessões de dosagem curtas, mas deve ser considerado, se forem utilizados mais vezes de dosagem.

As drogas podem ser entregues para os pulmões de animais por inalação só de nariz passiva ou métodos de administração intratraqueal directas que são desviados de deposição da nasofaringe. Entrega inalação só de nariz é comumente utilizada no campo da toxicologia de inalação ^41, mas é pouco usada no início do processo de descoberta de drogas. Uma equipa de investigação multidisciplinar é necessária para a realização de estudos de inalação pelo nariz apenas devido à: necessidade de grandes quantidades de droga, o conhecimento especializado necessário para formular, gerar e caracterizar os aerossóis; operar equipamento complexo, e medir a eficácia de drogas em modelos animais de doença respiratória. As técnicas de entrega aqui descritos são usados ​​para desenvolver small molécula de droga inalada, mas no futuro pode ser aplicada para desenvolver agentes biológicos inalados ^{42, 43.} Esperemos que os procedimentos e dicas documentados neste manuscrito facilitará nova descoberta de drogas e toxicologia pesquisadores pré-clínicos para adquirir as habilidades necessárias para entregar drogas para roedores por inalação de aerossóis.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nose-only exposure inhalation unit	TSE systems	700100-KNES-040-ss	Custom configurations available
DACO data acquisition system	TSE systems	700400-PRO-C-D/1
MC One Jet Mill	Jetpharma	DEC MicroJet 10
Turbula Mixer	GlenMills Inc	T2F
Micronized Lactose	DFE Pharma	Lactohale 200
Hydraulic press	Specac	GS15011
Cascade impactor filters	Pall Life Sciences	7219	Emfab filter
Absolute filters	Whatman	10370302	5 cm diameter
Real time aerosol monitor Microdust Pro Monitor	Casella	CEL-712
Ipratropium bromide	Spectrum Chemical	I1178	pre-micronized
flexiVent FX1 system	scireq	FV-FXCS