Approche précise de l'ablation cellulaire pour la modélisation des lésions rénales aiguës dans le développement du poisson zèbre

Résumé

Ce travail présente un nouveau modèle in vivo de lésions rénales segmentaires utilisant du poisson zèbre transgénique GFP rénal. Le modèle permet l'induction de l'ablation ciblée des cellules épithéliales rénales pour montrer les mécanismes cellulaires des lésions et des réparations de néphron.

Résumé

La lésion rénale aiguë (IRA) est une affection médicale commune avec un taux de mortalité élevé. Avec les capacités de réparation du rein, il est possible de restaurer une fonction rénale adéquate après un traitement de soutien. Cependant, une meilleure compréhension de la mort et de la réparation des cellules néphrones au niveau cellulaire est nécessaire pour minimiser la mort cellulaire et pour améliorer le processus de régénération. Le pronephros du poisson zombi est un bon système modèle pour atteindre cet objectif car il contient des segments anatomiques similaires à ceux du néphron des mammifères. Auparavant, le modèle de la gentamicine pharmacologique était le modèle le plus courant utilisé pour étudier les lésions rénales chez les poissons. Cependant, ce modèle ne permet pas un contrôle spatiotemporel précis des blessures, et il est donc difficile d'étudier les processus cellulaires et moléculaires impliqués dans la réparation des reins. Pour surmonter cette limitation, ce travail présente une méthode par laquelle, contrairement à l'approche de la gentamicine, une protéine Fuorecent verte verte (GFP)Le pressage du groupe néphron peut être mis en photo à l'aide d'une lumière laser violette (405 nm). Ce nouveau modèle d'AKI offre de nombreux avantages qu'est d'autres méthodes de lésion épithéliale. Ses principaux avantages sont la capacité de «composer» le niveau de blessure et le contrôle spatiotemporel précis dans le modèle animal robuste in vivo . Cette nouvelle méthode permet d'améliorer considérablement le niveau de compréhension des mécanismes de réparation des blessures rénales et des réparations.

Introduction

Les lésions rénales aiguës (LIR) ^{1 , 2} , qui peuvent également être appelées insuffisance rénale aiguë, sont largement définies comme une altération soudaine de la fonction rénale ³ . Bien que le niveau de compréhension de cette condition ait été remarquablement remarquable au cours des années, les taux de morbidité et de mortalité sont restés élevés ^{1 , 2} . Le traitement actuel pour cette condition est principalement favorable, car les résultats de plusieurs essais cliniques de traitement médicamenteux ont été négatifs ^{4 , 5} . Le rein est unique car il a la capacité de se réparer. Par conséquent, la thérapie de soutien après un diagnostic précoce d'IRA est le meilleur moyen de limiter la morbidité ⁶ . Cependant, il est difficile de détecter l'IRA tôt, et le taux de mortalité est de 50 à 80% décroissant chez ceux qui ont besoin de dialyse ⁵. Avec la capacité des reins de se réparer et le manque d'options de traitement pour cette condition, il est important de développer des méthodes pour améliorer ce processus de régénération de néphron.

Il y a eu beaucoup de modèles différents utilisés pour la recherche AKI qui comprend différents agents de blessures et modèles animaux. En termes d'agents de lésions rénales, l'antibiotique aminoglycoside gentamicine a été utilisé comme agent néphrotoxique qui conduit à l'IRA ^{7 , 8} . Cependant, plusieurs groupes ont constaté que le traitement de gentamicine est mortel pour l'embryon de poisson zèbre ⁹ . Cela provoque des dommages tubulaires trop graves pour la récupération des embryons, rendant l'étude de la régénération difficile sans intervention. Les modèles de mammifères, comme la souris et le rat, sont également considérés comme précieux, mais ils font face à de nombreuses limitations lors de l'étude de l'IRA. Peut-être le principal inconvénient des modèles de rongeurs est la difficulté de visuaLisant le rein des rongeurs et déterminant ainsi les processus spatiotemportaux précis menant à la mort épithéliale et à la réparation.

Johnson et al. Ont rapporté une technique à base d'ablation au laser pour induire une lésion rénale aiguë chez le poisson zèbre embryonnaire et larvaire ⁹ . Ils ont utilisé une ablation laser pulsée pour endommager le rein après une injection intramusculaire avec des conjugués de dextrane. La fluorescence des conjugués de dextrane permet de visualiser les dommages et la régénération dans l'épithélium des tubules ⁹ . Ce modèle surmonte les deux limitations mentionnées ci-dessus, mais cela ne permet pas de niveaux de blessure graduels et est difficile à réaliser sur de grands groupes de cellules arbitraires.

Le nouveau modèle d'AKI à base d'ablation par laser à base d'ablation décrit ici répond à toutes les limitations ci-dessus. Le rein pronephrique dans le poisson zèbre larvaire est un organe mature et fonctionnel qui contient des segments semblables à ceux de la mammifèrePhron, y compris un glomérule, des tubules proximaux et distal, et un conduit collecteur ¹⁰ . Les larves de zébrés sont également optiquement transparentes, ce qui permet d'observer le rein à l'aide de techniques de fluorescence. Ainsi, le poisson zèbre est un modèle précieux in vivo de l'IRA, et le rein pronephrique larvaire (5-12 jours après la fertilisation (dpf)) peut être utilisé pour étudier les processus cellulaires et moléculaires impliqués dans les lésions rénales et la réparation.

Cet article présente une méthode par laquelle des protéines Green Fluorescent Protein (GFP) - exprimant des segments de néphron peuvent être mises en photo à l'aide d'une lumière laser violette à faible énergie (par rapport à un système à laser pulsé) (405 nm). La fluorescence GFP permet de cibler un groupe de cellules, ce qui rend les changements qui se produisent visibles grâce à l'observation du photoblanchiment GFP. En outre, la GFP (en absorbant la lumière violette) sert d'évier d'énergie pour potentialiser la blessure dans les cellules rénales exprimant la GFP. Micros à temporisationLa copie peut ensuite être utilisée pour étudier le processus de réparation. Des études ont révélé que la prolifération cellulaire, la migration cellulaire et la métaplasie cellulaire ^{11 , 12 , 13} sont des processus potentiels qui peuvent jouer un rôle important dans la réparation des reins. Cependant, l'importance relative de ces processus et les détails de leur interaction ont été difficiles à découvrir en raison des limites des modèles existants d'AKI. En utilisant cette approche novatrice, il a été possible de montrer que la migration cellulaire joue un rôle central dans la réparation des reins après une blessure aiguë ¹⁴ .

Protocole

Cette étude a été réalisée conformément aux recommandations du Guide pour la prise en charge et l'utilisation des animaux de laboratoire des Instituts nationaux de santé. Le protocole a été approuvé par le Comité de soins et de soins pour animaux spécialisés en médecine de l'ostéopathie de NYIT (NYITCOM IACUC). Toute opération chirurgicale et expérimentation in vivo a été effectuée sous anesthésie tricaine, et tous les efforts ont été faits pour minimiser les souffrances.

1. Obtention et maintien d'embryons

1. Obtenir des embryons en traversant le poisson zèbre fluorescent GFP au rein.
   NOTE: Des exemples de lignées transgéniques de poissons zèbres marquées par fluorescence sont listés dans le tableau 1 .
2. Conserver les embryons à 28,5 ° C dans la solution E3 pendant les 24 heures après la fertilisation.
3. Après 24 h, remplacer le milieu par une solution E3 contenant 0,003% de 1-phényl-2-thiourée (PTU).
   NOTE: PTU est utilisé car il bloque les étapes dépendant de la tyrosinase dans la mélanogenèseEt empêche donc la pigmentation. Ici, cette solution est appelée E3-PTU.
4. Augmenter les embryons fécondés à 28,5 ° C jusqu'à ce qu'ils soient> 6 dpf, moment auquel les reins ont vieilli.
   NOTE: Il est préférable d'utiliser des larves dans la fenêtre 7-9 dpf.
5. À l'aide d'un microscope à dissection fluorescent à un grossissement de 40X et des filtres d'émission de fluorescence verte, sélectionnez les larves avec une fluorescence GFP à rein lumineuse.

2. Montage du poisson-zèbre pour l'imagerie en direct

1. Si vous photoïlisez les embryons avant 3 dpf, retirez le chorion de tout poisson zèbre non décalé avant de monter le poisson zèbre pour l'imagerie.
   1. Déchoriser manuellement avec une pince (préférée) ou utiliser un traitement chimique avec un mélange de protéase.
      REMARQUE: Dechorination permet les meilleurs résultats d'imagerie.
2. Rincer les débris de chorion dans la boîte de Petri en utilisant la solution E3-PTU et remplir le plat avec E3-PTU.
3. PrepaRe 1-2% d'agarose à faible point de fusion (LMP) avec 0,2 mg / ml de solution de tricaine pour monter le poisson zèbre pour la photoablation des reins et l'imagerie en direct.
   1. Si LMP agarose a déjà été préparé au préalable, réchauffer au micro-ondes pour le faire fondre.
4. Une fois l'agarose LMP préparée, placer une boîte de Petri en plastique de 35 mm sur un microscope à dissection. Placez une sonde de verre tirée à proximité pour orienter correctement les larves anesthésiées.
   NOTE: Il est important de faire cette étape en temps opportun et d'avoir tout en place, car les embryons doivent être orientés avant que l'agarose ne se solidifie en environ 1 à 3 minutes.
5. Avant de transférer l'embryon sur l'agarose, assurez-vous que l'agarose est froid ( c'est- à -dire à une température corporelle approximative). Utilisez une pipette de transfert en plastique ou en verre pour placer l'embryon dans la solution d'agarose-tricaine fondue refroidie.
   REMARQUE: ceci se fait car l'agarose trop chaud peut nuire à l'embryon, entraînant un arrêt cardiaqueOu la mort
6. À l'aide d'une pipette de transfert, redessiner l'embryon dans la solution d'agarose et positionner l'embryon / larve au milieu d'un plat de 35 mm.
7. Étendez rapidement l'agarose contenant l'embryon / larve pour couvrir uniformément le fond du plat de 35 mm; Le meilleur volume d'agarose à utiliser est ~ 1-1.1 mL.
8. Utilisez la sonde de verre pour orienter l'embryon dans la meilleure position possible pour la photoablation et l'imagerie.
   REMARQUE: Le film 1 montre la meilleure orientation de l'embryon / larve pour la photoablation unilatérale. Cette étape est la plus sensible au temps et devrait être effectuée rapidement avant que l'agarose commence à se geler, car toute tentative de réorienter le poisson après la gélification commence est néfaste.
   1. Orientez la larve de telle sorte que le segment d'intérêt du rein soit perpendiculaire au trajet du faisceau tandis que le segment contralatéral est éloigné du faisceau laser (voir le film 1 ).
      REMARQUE: ceci peut être réalisé en tournant la larve comme le montre le film 1 .
9. Laisser environ 15 minutes pour que l'agarose se solidifie. Couvrir la boîte à pétrole pour minimiser l'évaporation. Une fois l'agarose solidifiée, l'embryon ou la larve est prêt pour la photoablation.

3. Ablation au laser

1. Utilisez le système d'imagerie confocal.
   REMARQUE: lorsque vous utilisez la plate-forme d'imagerie référencée (voir la table des matériaux), les paramètres recommandés incluent un grossissement 40X, une lentille de trempage d'eau 0,8 NA et le premier miroir dichroïque pour permettre l'éclairage à la fois de 488 et 405 nm. La détection doit être effectuée sur le canal vert.
2. Placez le plat contenant le poisson zèbre immobilisé sur une scène confocale.
   REMARQUE: cette procédure est optimisée pour la configuration verticale à l'aide d'une lentille de trempage d'eau 40-60X. Cependant, il devrait être possible de modifier la procédure pour un microscope inversé.
3. Dans la configuration verticale, positionnez la boîte à pétres contenant l'embryon sur un microscOuvrez la glissière et maintenez-la en place à l'aide d'une argile de modélisation ( p. Ex., De la plasticine). Placez la glissière en verre avec la boîte de Petri sur la scène du microscope confocal.
4. Ajouter 3 ml de la solution d'imagerie E3-PTU (voir étape 1.3) avec 0,2 mg / mL de tricaine.
   REMARQUE: la solution d'imagerie peut également être ajoutée immédiatement avant de placer la diapositive sur la scène. L'ajout d'une solution d'imagerie doit être effectué avec beaucoup d'attention pour empêcher l'agarose de flotter du fond du plat.
5. Passez à l'objectif de trempage d'eau (40 ou 60X). Relevez lentement la scène, en vous assurant que la lentille est légèrement inclinée pour éviter que l'air ne soit piégé dans le chemin du faisceau. Une fois que l'objectif touche la solution à un angle, concentrez-la afin qu'elle soit dans le champ de vision des embryons.
6. Trouvez le segment d'intérêt en utilisant la source de lumière fluorescente. Placez superficiellement la branche destinée à être blessée afin de minimiser la diffusion de la lumière (voir le film 1 ).
   REMARQUE: la suiteLes étapes t utilisent un logiciel référencé (voir la Table des matières), mais la procédure peut être facilement adaptée à d'autres plates-formes.
7. Ouvrez le logiciel. Accédez à "Afficher" | "Contrôle d'acquisition" | "C2plus Compact GUI" et définissez "pixel dwell time" à "1.9 μs", "taille d'image" à "512 x 512 pixels" et "taille d'épingle" à "90 μm". Définir "405 nm (ou 408 nm dans certains systèmes) l'intensité laser" à zéro et "488 intensité laser" à "faible" (de préférence <1%). Ajustez le "gain" pour obtenir une bonne dynamique mais pas pour saturer le signal.
   REMARQUE: ces valeurs ne sont pas critiques et sont utilisées pour la cohérence. Lorsqu'un laser de 405 nm est utilisé, il en résultera une augmentation de la fluorescence GFP. Pour éviter la saturation du signal lors du photoblanchage (étape 3.11), la valeur de gain du signal doit être réduite sur le canal vert. Le gain de canal bleu peut être laissé à zéro, car il n'est pas utilisé pour saMpling.
8. Cliquez sur "Numériser" dans l'interface du logiciel pour scanner le rein en utilisant un laser 488 nm. Trouvez le segment d'intérêt qui est perpendiculaire au chemin du faisceau et qui est bien visualisé, avec une bonne fluorescence GFP. Une fois que cette région a été identifiée, dessinez une région d'intérêt en utilisant une région d'intérêt elliptique (ROI).
   1. Accédez à "ROI" | "Dessinez le retour sur investissement Elliptique".
      REMARQUE: ceci sera utilisé pour mesurer en permanence l'intensité moyenne de la GFP pendant la mise en photo, permettant l'administration d'une dose précise de traitement au laser.
9. Accédez à "Afficher" | "Contrôles d'acquisition" | "Zone de numérisation C2plus" et choisissez "Zone de balayage de bandes". Le masque rectangulaire apparaîtra dans cette interface. Définissez manuellement une fenêtre de numérisation rectangulaire à l'aide du curseur ( c.-à-d. Glisser, redimensionner et transformer le masque) pour couvrir le segment ciblé pour l'ablation au laser. Cliquez avec le bouton droit de la souris dansZone de masque pour accepter la sélection.
   REMARQUE: seule la région sélectionnée sera numérisée.
10. Commencez la mesure du temps tout en surveillant le canal vert en utilisant uniquement le laser 488 nm pour activer GFP. Assurez-vous que l'intensité du laser 488 est relativement faible (~ 1%). Mesurez l'intensité moyenne de la GFP dans la région d'intérêt en sélectionnant "Mesurer" | "Mesure du temps". Utilisez les onglets "Graphique" ou "Données" pour surveiller les valeurs moyennes d'intensité dans le ROI.
    REMARQUE: le taux d'acquisition est défini par le temps d'attente des pixels et la taille de la fenêtre rectangulaire définie à l'étape 3.9, mais en général, elle permet une surveillance rapide du signal (~ 2-10 images / s).
11. Induire les cellules rénales avec le laser violet (405 nm) en augmentant l'intensité à 100% en faisant glisser la commande "laser power" tout droit vers la droite. Le laser 488 nm peut rester actif si l'intensité est faible.
    1. Observer une ligne gRaph en utilisant l'onglet "Graphique" ou les valeurs numériques de l'intensité GFP à l'aide de l'onglet "Données" et attendez qu'il tombe au niveau souhaité, par exemple 50% de la ligne de base (comme le montre la Figure 1 ).
       REMARQUE: Un laser de 20 mW a été utilisé dans le cadre de l'unité laser référencée (voir le tableau des matériaux ); L'intensité maximale peut varier selon les systèmes. Une intensité plus faible peut être compensée par une exposition plus longue ( c.- à - d. Utiliser le pourcentage de blanchiment des GFP comme mesure de l'exposition totale).
12. Une fois que l'intensité GFP dans le ROI elliptique (étape 3.8) a chuté à un niveau désiré, diminuez immédiatement l'intensité du laser violet (405 nm) à "0" en déplaçant le curseur "laser power" tout le chemin vers la gauche dans Le panneau de contrôle du logiciel.
    1. Obtenir une nouvelle base de fluorescence GFP. Confirmez l'ablation en obtenant un rapport X / Y.
       REMARQUE: voir la figure1B; Y = intensité moyenne avant l'ablation et X = intensité moyenne après l'ablation, en utilisant en moyenne 4 échantillons consécutifs dans le ROI. Le ratio cible exact (50%, 60%, etc. ) dépend de la quantité de blessure souhaitée pour une expérience donnée.

4. Microscopie temporelle avec coloration au moyen de l'iodure de propidium

1. Appliquer des considérations générales de décalage temporel (décrites dans une étude précédente ¹⁵ ) pour visualiser la coloration de l'iodure de propidium comme un corrélat de la lésion des cellules rénales après la photoablation.
2. Pré-incuber les larves dans une solution de iodure de propidium 30 μM (1% de DMSO dans E3-PTU) pendant 3 h avant l'incorporation et la photoïlation, comme décrit aux étapes 2 et 3.7, respectivement.
   REMARQUE: Aucun iodure de propidium supplémentaire n'est nécessaire dans l'agarose ou la solution d'imagerie.
3. Induire une lésion rénale segmentaire, comme décrit aux étapes 3.1-3.12.
4. Obtenir des piles d'images temporelles, en tant que décriDans une étude précédente ¹⁴ , à l'aide d'un laser à 488 nm (GFP) et d'un laser 461 nm (Iodure de propidium, PI).
   NOTE: Les deux couleurs sont superposées dans des piles confocales pour corréler la disparition de GFP et l'apparition de la coloration au iodure de propidium.
5. Définissez les paramètres pour l'obtention des piles d'images temporelles comme suit: épaisseur de la tranche virtuelle = 4 μm, intervalle de pile z = 2 μm, durée de vie des pixels = 1,9 μs, dimensions de l'image = 512 x 512 et moyenne = 2.
   REMARQUE: ces paramètres permettent un enregistrement continu d'intervalle de 10 à 15 minutes jusqu'à 4 larves et veille à ce qu'il y ait un minimum de photoblanchage de l'échantillon.
6. Utilisez un logiciel d'imagerie compatible avec le format de fichier d'enregistrement pour visualiser et analyser les données.

Résultats

Notez que ce protocole a été utilisé avec succès avec un certain nombre de lignes transgéniques GFP rénales, y compris ET (krt8: EGFP) sql11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 et Tg (atp1a1a.4: GFP). Les exemples de résultats présentés ici ont été obtenus en utilisant la ligne ET (krt8: EGFP) sqet11-9.

La figure 1 montre l'exemple de protocole de photoablation. L'intensité GFP moyen...

Discussion

Il convient de noter que la puissance laser totale varie selon les systèmes. Cependant, l'utilisation du pourcentage de photobloc GFP permet de lire l'énergie totale livrée au rein fluorescent, indépendamment de la variation de l'énergie laser et compensée par la durée d'exposition. Cependant, gardez à l'esprit que la réponse des différents tissus à cette méthode de photoablation varie. Même pendant la maturation des reins, il est significativement plus difficile d'obtenir une réduc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri Dishes, 35 x 10 mm	Genesee Scientific	32-103	Procedural Usage: Step 2.4, 2.7
Petri Dishes, 100 x 15 mm	Midwest Scientific	910	Procedural Usage: Step 1
Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar	Fischer Scientific	50-241-57	Procedural Usage: Step 2.1.1
Plastic Transfer Pipet	Globe Scientific	135030	Procedural Usage: Step 2.5, 3.6
Tricaine	Sigma Aldrich	A5040-25G	Procedural Usage: Step 2.3, 3.4
Agarose	Fischer Scientific	BP165-25	Procedural Usage: Step 2.3
Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)	Fischer Scientific	21-1640-2C	Procedural Usage: Step 2.4
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1270	Procedural Usage: Step 1.5
SOLA Light Engine	Lumencor	SOLA SM-5-LCR-SB	Procedural Usage: Step 1.5
Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System	Nikon		Procedural Usage: Step 3
1x E3 Solution			Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3
PTU	Sigma	P7629-10G	Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2
NIS Elements Software	Nikon	C2+	Procedural Usage: Step 3
Laser Unit	Agilent	MLC 400	Procedural Step 3.11
Propidium Iodide (PI)	Sigma Aldrich	P4170-100MG	Procedural Step Usage: 4.2