Abordagem precisa de ablação celular para modelagem de lesão renal aguda no desenvolvimento de peixe-zebra

Resumo

Este trabalho apresenta um novo modelo in vivo de lesão renal segmentar usando peixe zebra transgênico GFP renal. O modelo permite a indução da ablação direcionada de células epiteliais renais para mostrar os mecanismos celulares de lesão e reparação de néphron.

Resumo

Lesão renal aguda (LRA) é uma condição médica comum com alta taxa de mortalidade. Com as habilidades de reparo do rim, é possível restaurar a função renal adequada após o tratamento de suporte. No entanto, é necessária uma melhor compreensão de como ocorre morte e reparação de células nefronas no nível celular para minimizar a morte celular e melhorar o processo regenerativo. O pronephros do peixe-zebra é um bom sistema modelo para atingir esse objetivo, pois contém segmentos anatômicos que são semelhantes à nefrona dos mamíferos. Anteriormente, o modelo mais comum usado para estudar lesão renal em peixes era o modelo farmacológico de gentamicina. No entanto, este modelo não permite um controle espaciotemporal preciso da lesão e, portanto, é difícil estudar os processos celulares e moleculares envolvidos no reparo renal. Para superar esta limitação, este trabalho apresenta um método através do qual, em contraste com a abordagem gentamicina, uma Proteína Fuorescente Verde específica (GFP) -exPressionar o segmento nephron pode ser fotoablado usando uma luz laser violeta (405 nm). Este novo modelo de AKI oferece muitas vantagens que outros métodos de lesão epitelial não possuem. Suas principais vantagens são a capacidade de "marcar" o nível de lesão e o controle espaciotemporal preciso no modelo robusto animal in vivo . Este novo método tem potencial para avançar significativamente o nível de compreensão dos mecanismos de lesão renal e reparação.

Introdução

Lesão renal aguda (LRA) ^{1 , 2} , que também pode ser referida como insuficiência renal aguda, é amplamente definida como uma deficiência súbita na função renal ³ . Embora o nível de compreensão desta condição tenha sido melhorado notavelmente ao longo dos anos, as taxas de morbidade e mortalidade permaneceram altas ^{1 , 2} . O tratamento atual para esta condição é principalmente solidário, já que os resultados de vários ensaios clínicos de terapia medicamentosa foram negativos ^{4 , 5} . O rim é único, pois tem a capacidade de se reparar. Portanto, a terapia de suporte após um diagnóstico precoce da IRA é a melhor maneira de limitar a morbidade ⁶ . No entanto, é difícil detectar a IRA precoce e a taxa de mortalidade é um escalonamento de 50-80% para aqueles que necessitam de diálise ⁵. Com a capacidade dos rins para reparar e a falta de opções de tratamento para esta condição, é importante desenvolver métodos para melhorar este processo de regeneração de néphron.

Houve muitos modelos diferentes utilizados para pesquisa de AKI que inclui diferentes agentes de lesões e modelos de animais. Em termos de agentes de danos nos rins, o antibiótico gentamicina aminoglicosídeo tem sido utilizado como agente nefrotóxico que leva a AKI ^{7 , 8} . No entanto, vários grupos descobriram que o tratamento com gentamicina é letal para o embrião de peixe-zebra ⁹ . Causa dano tubular muito grave para a recuperação do embrião, dificultando o estudo da regeneração sem algum tipo de intervenção. Os modelos de mamíferos, como o rato e o rato, também são considerados valiosos, mas enfrentam muitas limitações durante o estudo da IRA. Talvez a principal desvantagem dos modelos de roedores seja a dificuldade em visuaLizing o rim dos roedores e, assim, determinando os processos espaciotemporais precisos que levam à morte epitelial e ao reparo.

Johnson et al. Relataram uma técnica baseada em ablação a laser para induzir lesão renal aguda em peixe zebra embrionário e larval ⁹ . Eles usaram ablação a laser pulsada para danificar o rim após uma injeção intramuscular com conjugados de dextrano. A fluorescência dos conjugados de dextrano permite a visualização de dano e regeneração no epitélio tubular ⁹ . Este modelo supera as duas limitações mencionadas acima, mas não permite níveis graduados de lesão e é difícil de realizar em grandes grupos de células arbitrárias.

O novo modelo de AKI, descrito em ablação a laser, descrito aqui aborda todas as limitações acima. O rim pronefrico no peixe zebra larval é um órgão maduro e funcional que contém segmentos similares à nebulosa de mamíferoPhron, incluindo um glomérulo, túbulos proximais e distal, e um ducto colector ¹⁰ . As larvas de zebrafish também são opticamente transparentes, tornando possível observar o rim através de técnicas de fluorescência. Assim, o peixe-zebra é um valioso modelo in vivo de IRA, e o rim pronefrico larval (5-12 dias após a fertilização (dpf)) pode ser usado para estudar os processos celulares e moleculares envolvidos em lesão renal e reparação.

Este artigo apresenta um método através do qual os segmentos de Nephron específicos de proteína fluorescente verde (GFP) podem ser fotoablados usando uma luz laser violeta de baixa energia (em comparação com um sistema de laser pulsado) (405 nm). A fluorescência GFP permite a segmentação de um grupo de células, tornando as mudanças que se tornam visíveis através da observação do fotobloco GFP. Além disso, o GFP (absorvendo a luz violeta) serve como um coletor de energia para potencializar a lesão em células renais que expressam GFP. Microfones de lapso de tempoA cópia pode então ser usada para estudar o processo de reparo. Estudos têm encontrado proliferação celular, migração celular e metaplasia celular ^{11 , 12 , 13} para todos ser processos potenciais que podem desempenhar um papel importante na reparação renal. No entanto, a importância relativa desses processos e os detalhes de sua interação foram difíceis de descobrir devido às limitações dos modelos existentes de AKI. Usando essa abordagem inovadora, foi possível mostrar que a migração celular desempenha um papel central no reparo renal após lesão aguda ¹⁴ .

Protocolo

Este estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidados de Animais Institucionais da Universidade de NYIT College of Osteopathic Medicine (NYITCOM IACUC). Toda a cirurgia e experimentação in vivo foi realizada sob anestesia tricaína, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

1. Obtendo e mantendo embriões

1. Obter embriões atravessando o peixe zebra fluorescente GFP renal.
   NOTA: Exemplos de linhas transgênicas de peixe zebra com marcação fluorescente estão listadas na Tabela 1 .
2. Mantenha os embriões a 28,5 ° C na solução de E3 durante as 24 h após a fertilização.
3. Após 24 h, substitua o meio por uma solução E3 que contém 0,003% de 1-fenil-2-tioureia (PTU).
   NOTA: PTU é usado porque bloqueia os passos dependentes da tirosinase na melanogêneseE, portanto, evita a pigmentação. Aqui, esta solução é conhecida como E3-PTU.
4. Aumentar os embriões fertilizados a 28,5 ° C até atingir 6 dpf, altura em que os rins amadureceram.
   NOTA: É melhor usar larvas na janela 7-9 dpf.
5. Usando um microscópio de dissecação fluorescente com ampliação de 40X e filtros de emissão de fluorescência verde, selecione as larvas com fluorescência GFP renal brilhante.

2. Montagem do Zebrafish para imagens ao vivo

1. Se fotografar os embriões antes de 3 dpf, remova o corion de qualquer peixe zebra desabotoado antes de montar o peixe zebra para imagens.
   1. Descarte manualmente com pinça (preferida) ou use um tratamento químico com uma mistura de protease.
      NOTA: Dechorinação permite os melhores resultados de imagem.
2. Enxágüe os restos corais na placa Petri usando a solução E3-PTU e recarregue o prato com E3-PTU.
3. PrepaRe 1-2% de agarose de ponto baixo de fusão (LMP) com 0,2 mg / mL de solução de tricaína para montar o peixe zebra para fotoablação renal e imagens ao vivo.
   1. Se LMP agarose já estava preparado de antemão, reaqueie-o no microondas para derreter.
4. Uma vez preparada a agarose LMP, coloque uma placa de petri de plástico de 35 mm num microscópio de dissecação. Coloque uma sonda de vidro puxada próxima para orientar adequadamente as larvas anestesiadas.
   NOTA: É importante fazer este passo em tempo hábil e ter tudo no lugar, porque os embriões devem ser orientados antes da agarose solidificar em cerca de 1-3 min.
5. Antes de transferir o embrião para a agarose, certifique-se de que a agarose esteja fresca ( ou seja , a temperatura corporal). Use uma pipeta de transferência de plástico ou vidro para colocar o embrião na solução de agarose-tricaína derretida arrefecida.
   NOTA: Isto é feito porque a agarose que é muito quente pode prejudicar o embrião, levando a parada cardíacaOu morte
6. Usando uma pipeta de transferência, redesenhe o embrião na solução de agarose e posicione o embrião / larva no meio de um prato de 35 mm.
7. Distribua rapidamente a agarose contendo o embrião / larva para cobrir uniformemente o fundo do prato de 35 mm; O melhor volume de agarose a utilizar é ~ 1-1,1 mL.
8. Use a sonda de vidro para orientar o embrião na melhor posição possível para fotoablação e imagem.
   NOTA: O filme 1 mostra a melhor orientação do embrião / larva para a fotoablação unilateral. Este passo é o mais sensível ao tempo e deve ser realizado rapidamente antes que a agarose comece a gelar, uma vez que qualquer tentativa de reorientar o peixe após o início da gelificação é prejudicial.
   1. Oriente a larva de modo que o segmento de interesse renal seja perpendicular ao caminho do feixe enquanto o segmento contralateral está longe do raio laser (veja o filme 1 ).
      NOTA: Isto pode ser conseguido girando a larva como mostrado no filme 1 .
9. Permitir cerca de 15 min para a agarose para solidificar. Cubra a placa de Petri para minimizar a evaporação. Uma vez que a agarose se solidificou, o embrião ou larva está pronto para a fotoablation.

3. Ablação a laser

1. Operar o sistema de imagem confocal.
   NOTA: Ao usar a plataforma de imagem referenciada (veja a tabela de materiais), as configurações recomendadas incluem ampliação de 40X, uma lente de imersão de água de 0,8 NA e o primeiro espelho dicróico para permitir a iluminação de 488 e 405 nm da amostra. A detecção deve ser realizada no canal verde.
2. Posicione o prato contendo o peixe zebra imobilizado em uma fase confocal.
   NOTA: Este procedimento é otimizado para a configuração vertical usando uma lente de imersão de água de 40-60X. No entanto, deve ser possível modificar o procedimento para um microscópio invertido.
3. Na configuração vertical, posicione a placa de Petri contendo o embrião em cima de um microscDeslize e mantenha-o no lugar usando argila de modelagem ( por exemplo, plastilina). Posicione a lâmina de vidro com a placa de Petri no palco do microscópio confocal.
4. Adicione 3 mL da solução de imagem E3-PTU (ver passo 1.3) com 0,2 mg / mL de tricaína.
   NOTA: A solução de imagem também pode ser adicionada imediatamente antes de colocar o slide no palco. A adição de solução de imagem deve ser feita com muito cuidado para evitar que a agarose flute no fundo do prato.
5. Mude para a lente de imersão de água (40 ou 60X). Levante lentamente o palco, certificando-se de que a lente está ligeiramente inclinada para evitar que o ar fique preso no caminho do feixe. Uma vez que a lente toca a solução em um ângulo, centre-a para que ela esteja no campo de visão dos embriões.
6. Encontre o segmento de interesse usando a fonte de luz de fluorescência. Posicione superficialmente o ramo alvo de lesões para minimizar a dispersão da luz (veja o filme 1 ).
   NOTA: A subsequênciaT etapas fazem uso do software referenciado (veja a Tabela de Materiais), mas o procedimento pode ser facilmente adaptado a outras plataformas.
7. Abra o software. Navegue até "Exibir" | "Controle de Aquisição" | "C2plus Compact GUI" e defina "pixel dwell time" para "1.9 μs", "frame size" para "512 x 512 pixels" e "tamanho pinhole" para "90 μm". Ajuste "405 nm (ou 408 nm em alguns sistemas) intensidade do laser" para zero e "488 intensidade do laser" para "baixo" (de preferência <1%). Ajuste o "ganho" para obter um bom alcance dinâmico, mas não para saturar o sinal.
   NOTA: Estes valores não são críticos e são usados ​​para consistência. Quando um laser de 405 nm é usado, isso resultará em aumentos na fluorescência de GFP. Para evitar a saturação do sinal durante o fotobloco (etapa 3.11), o valor do ganho do sinal deve ser reduzido no canal verde. O ganho do canal azul pode ser deixado em zero, pois não é usado para saMpling.
8. Clique em "Digitalizar" na interface do software para verificar o rim usando um laser de 488 nm. Encontre o segmento de interesse que é perpendicular ao caminho do feixe e que está bem visualizado, com boa fluorescência GFP. Uma vez que essa região foi identificada, desenhe uma região de interesse usando uma região de interesse elíptica (ROI).
   1. Navegue até "ROI" | "Desenhe o ROI elíptico".
      NOTA: Isto será usado para medir continuamente a intensidade média de GFP enquanto ocorre o fotobloco, permitindo a administração de uma dose precisa de tratamento a laser.
9. Navegue até "Exibir" | "Controles de aquisição" | "Área de digitalização C2plus" e escolha "Área de digitalização de bandas". A máscara retangular aparecerá dentro dessa interface. Defina manualmente uma janela de varredura retangular usando o cursor ( ou seja , arraste, redimensione e gire a máscara) para cobrir o segmento segmentado para ablação a laser. Clique com o botão direito do mouse noÁrea de máscara para aceitar a seleção.
   NOTA: Somente a região selecionada será digitalizada.
10. Comece a medição do tempo enquanto monitoriza o canal verde usando apenas o laser de 488 nm para ativar o GFP. Certifique-se de que a intensidade do laser 488 seja relativamente baixa (~ 1%). Mude a intensidade média do GFP na região de interesse selecionando "Medir" | "Medição de tempo". Use as abas "Gráfico" ou "Dados" para monitorar os valores médios de intensidade dentro do ROI.
    NOTA: A taxa de aquisição é definida pelo tempo de permanência de pixels e o tamanho da janela retangular configurada na etapa 3.9, mas, em geral, permite a monitoração rápida do sinal (~ 2-10 quadros / s).
11. Induzir danos nas células do rim com o laser violeta (405 nm), aumentando a intensidade para 100%, deslizando o controle de "potência do laser" todo o caminho para a direita. O laser de 488 nm pode permanecer ativo se a intensidade for baixa.
    1. Observe uma linha gUsando a guia "Gráfico" ou os valores numéricos da intensidade GFP usando a guia "Dados" e aguarde até que ele caia para um nível desejado, por exemplo, 50% da linha de base (como mostrado na Figura 1 ).
       NOTA: Um laser de 20 mW foi usado como parte da unidade laser referenciada (veja a Tabela de Materiais ); A intensidade máxima pode variar entre os sistemas. A intensidade mais baixa pode ser compensada por uma exposição mais longa ( ou seja, usando porcentagem de branqueamento de GFP como medida da exposição total).
12. Uma vez que a intensidade GFP dentro do ROI elíptico (passo 3.8) caiu para um nível desejado, diminua imediatamente a intensidade do laser violeta (405 nm) para "0", movendo o controle deslizante "laser power" todo o caminho para a esquerda em O painel de controle do software.
    1. Obter uma nova linha de base de fluorescência GFP. Confirme a ablação obtendo uma proporção de X / Y.
       NOTA: veja a figura1B; Y = intensidade média antes da ablação e X = intensidade média após a ablação, utilizando uma média de 4 amostras consecutivas dentro do ROI. A relação alvo exata (50%, 60%, etc. ) depende da quantidade de lesão desejada para uma determinada experiência.

4. Microscopia de lapso de tempo com coloração com iodeto de propídio

1. Aplicar considerações de lapso de tempo geral (delineado em um estudo anterior ¹⁵ ) para visualizar manchas de iodeto de propídio como correlação de lesão de células renais após a fotoablation.
2. Pré-incubar as larvas em 30 μM de solução de iodeto de propídio (1% de DMSO em E3-PTU) durante 3 h antes da incorporação e fotoablação, como descrito nos passos 2 e 3.7, respectivamente.
   NOTA: Não é necessário iodeto de propídio adicional na agarose ou na solução de imagem.
3. Induzir injúria renal segmentar, conforme descrito nas etapas 3.1-3.12.
4. Obter pilhas de tempo lapso de imagem, como descriCama em um estudo anterior ¹⁴ , usando um laser de 488 nm (GFP) e um laser de 461 nm (Iodeto de propídio, PI).
   NOTA: As duas cores são sobrepostas em pilhas confocais para correlacionar o desaparecimento da GFP e a aparência da coloração com iodeto de propídio.
5. Defina os parâmetros para a obtenção das pilhas de imagem de lapso de tempo da seguinte forma: espessura da fatia virtual = 4 μm, intervalo de pilha z = 2 μm, tempo de espera de pixels = 1,9 μs, dimensões da imagem = 512 x 512 e média = 2.
   NOTA: Estes parâmetros permitem gravação contínua de intervalos de até 10 a 15 minutos de até 4 larvas e garantem que haja uma fotovelavel mínima da amostra.
6. Use software de imagem compatível com o formato do arquivo de gravação para visualizar e analisar os dados.

Resultados

Observe que este protocolo foi usado com sucesso com várias linhas transgênicas de GFP renal, incluindo ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 e Tg (atp1a1a.4: GFP). Os exemplos de resultados apresentados aqui foram obtidos usando a linha ET (krt8: EGFP) sqet11-9.

A Figura 1 mostra o exemplo de protocolo de fotoablação. A intensidade média de GFP é monitorada dentro da região ...

Discussão

Deve-se notar que a potência total do laser varia entre os sistemas. No entanto, o uso de porcentagem de fotoblocos GFP permite uma leitura da energia total entregue ao rim fluorescente, independente da variação na potência do laser e compensada pelo período de exposição. Tenha em mente, no entanto, que a resposta de diferentes tecidos a este método de fotoablação varia. Mesmo durante a maturação do rim, é significativamente mais difícil obter uma redução de 50% na fluorescência de GFP em embriões mais...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri Dishes, 35 x 10 mm	Genesee Scientific	32-103	Procedural Usage: Step 2.4, 2.7
Petri Dishes, 100 x 15 mm	Midwest Scientific	910	Procedural Usage: Step 1
Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar	Fischer Scientific	50-241-57	Procedural Usage: Step 2.1.1
Plastic Transfer Pipet	Globe Scientific	135030	Procedural Usage: Step 2.5, 3.6
Tricaine	Sigma Aldrich	A5040-25G	Procedural Usage: Step 2.3, 3.4
Agarose	Fischer Scientific	BP165-25	Procedural Usage: Step 2.3
Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)	Fischer Scientific	21-1640-2C	Procedural Usage: Step 2.4
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1270	Procedural Usage: Step 1.5
SOLA Light Engine	Lumencor	SOLA SM-5-LCR-SB	Procedural Usage: Step 1.5
Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System	Nikon		Procedural Usage: Step 3
1x E3 Solution			Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3
PTU	Sigma	P7629-10G	Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2
NIS Elements Software	Nikon	C2+	Procedural Usage: Step 3
Laser Unit	Agilent	MLC 400	Procedural Step 3.11
Propidium Iodide (PI)	Sigma Aldrich	P4170-100MG	Procedural Step Usage: 4.2