Imagerie en cellules vivantes de la dégranulation et de la sécrétion de plaquettes sous le flux

Résumé

Ce travail décrit une méthode à base de microscopie à fluorescence pour l'étude de l'adhérence plaquettaire, de la propagation et de la sécrétion sous l'écoulement. Cette plate-forme polyvalente permet l'étude de la fonction plaquettaire pour la recherche mécanistique sur la thrombose et l'hémostase.

Résumé

Les plaquettes de sang sont des acteurs essentiels de l'hémostase, la formation de thrombi pour sceller les brèches vasculaires. Ils sont également impliqués dans la thrombose, la formation de thrombus qui entouent le système vasculaire et blessent les organes, avec des conséquences potentiellement mortelles. Cela motive la recherche scientifique sur la fonction plaquettaire et le développement de méthodes pour suivre les processus biologiques cellulaires lorsqu'ils se produisent dans des conditions d'écoulement.

Une variété de modèles d'écoulement sont disponibles pour l'étude de l'adhésion et de l'agrégation des plaquettes, deux phénomènes clés de la biologie des plaquettes. Ce travail décrit une méthode pour étudier la dégranulation des plaques en temps réel sous l'écoulement pendant l'activation. La méthode utilise une chambre d'écoulement couplée à une installation de pompe à seringue qui est placée sous un microscope à fluorescence à large spectre à base de LED. La configuration décrite ici permet l'excitation simultanée de multiples fluorophores qui sont délivrés par des anticorps marqués par fluorescence ou fluorescDes colorants. Après les expériences d'imagerie des cellules vivantes, les lunettes de couverture peuvent être traitées et analysées à l'aide d'une microscopie statique (microscopie confocale ou microscopie électronique à balayage).

Introduction

Les plaquettes sont des cellules anucléaires qui circulent dans la circulation sanguine. Leur principale fonction est de sceller les brèches vasculaires sur les sites de blessures et de prévenir la perte de sang. Chez ces sites de blessure, les fibres de collagène sous-endothéliales sont exposées et sont ensuite couvertes par la protéine multimérique, le facteur von Willebrand (VWF). Le VWF interagit avec les plaquettes en circulation dans un mécanisme qui dépend du complexe glycoprotéine Ibα-IX-V sur la surface cellulaire ¹ , ralentissant la vitesse des plaquettes. Ceci est particulièrement important à des taux de cisaillement élevés. Les plaquettes subissent ensuite des changements morphologiques tout en recevant des impulsions d'activation du collagène. Cela conduit à une propagation irréversible et éventuellement à l'agrégation plaquettaire. Les deux processus dépendent de la sécrétion du contenu en granulés pour faciliter la diaphonie plaquettaire-plaquettaire. Entre autres, les granulés α plaquettaires contiennent du fibrinogène et du VWF pour faciliter l'adhérence plaquettaire et le pontLes plaquettes ensemble d'une manière dépendante de l'intégrine. Les granules plaquettes et denses contiennent des composés inorganiques ² , y compris le diphosphate de calcium et d'adénosine (ADP), qui contribuent à renforcer l'activation des plaquettes. En outre, les plaquettes contiennent des médiateurs de l'inflammation (allergique) ³ , des protéines ^{4 du} contrôle du complément et des facteurs ^{5 , 6 de l'} angiogenèse, ce qui soulève la question de savoir si ces contenus sont diffusés différemment dans des conditions variables.

Depuis les années 1980, l'étude de la fonction plaquettaire dans les modèles de flux a été précieuse pour l'étude des mécanismes thrombotiques ⁷ . Depuis lors, de nombreux progrès techniques ont été réalisés, et les modèles de flux qui incluent la formation de fibrine sont actuellement développés pour évaluer le potentiel hémostatique des concentrés thérapeutiques plaquettaires ex vivo ⁸ ou àÉtudier l'influence des perturbations dans les taux de cisaillement sur la morphologie du thrombus ⁹ . Les différences dans les mécanismes moléculaires et biologiques cellulaires qui favorisent une adhérence stable et une formation de thrombus physiologique (hémostase) par rapport à la formation de thrombus pathologique (thrombose) peuvent être très subtiles et motiver le développement de modèles d'écoulement permettant la visualisation en temps réel de ces sous-cellulaires Processus.

Un exemple d'un processus pour lequel une telle configuration serait précieuse est la (re) distribution du polyphosphate intracellulaire et le recrutement de facteurs de coagulation pour découvrir l'impact dépendant du temps que cela a sur l'ultrastructure de la fibrine ¹⁰ . Les études sont souvent limitées aux analyses finales. L'objectif principal de la méthode décrite est de permettre l'étude visuelle en temps réel des processus subcellulaires dynamiques qui se déroulent lors de l'activation plaquettaire sous flux.

Protocole

Le Comité d'éthique médicale local du Centre médical universitaire Utrecht a approuvé le prélèvement de sang à des fins de recherche ex vivo , y compris ceux de cette étude.

1. Préparation de la solution

1. Préparer un tampon de Tyrode d'acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-pipérazine éthanesulfonique (HEPES) en dissolvant de l'HEPES 10 mM, du Na2HPO4 0,5 mM, du NaCl 145 mM, du KCl 5 mM, du MgS04 1 mM et du D- Glucose dans de l'eau distillée.
   1. Faire deux variantes du tampon: régler les niveaux de pH à 6,5 et à 7,4, respectivement. Faire un nouveau tampon pour chaque jour d'expériences. Complément avec 10 ng / mL de prostacycline, le cas échéant.
2. Préparer une solution saline tampon TRIS (TBS) en dissolvant 50 mM de Tris et 150 mM de NaCl dans de l'eau distillée et ajuster le pH à 9,0.
3. Préparer le citrate de dextrose acide (ACD) en dissolvant 85 mM de citrate de tri-sodium, 71 mM d'acide citrique et 111 mM de D-glucose en disEau distillée.
4. Préparez une solution fixative en ajoutant 2% (v / v) de paraformaldéhyde (PFA) au tampon HEPES Tyrode, pH 7,4. Chauffer à dissoudre (50 - 70 ° C) et régler le pH à 7,4. Aliquote et entreposez à -20 ° C. Décongeler à 37 ° C avant utilisation.
5. Préparer le tampon de blocage en dissolvant 1% (m / v) d'albumine humaine de sérum (HSA) dans le tampon HEPES Tyrode, pH 7,4
6. Faire une solution d'alcool polyvinylique en ajoutant 4,8 g d'alcool polyvinylique à 12 g de glycerol et bien mélanger. Ajouter 12 ml d'eau distillée et la laisser sur un rotateur à température ambiante pendant la nuit.
   1. Ajouter 24 ml de Tris-HCL 0,2 M, pH 8,5. Chauffer à 50 ° C tout en mélangeant pendant 30 min. Ajouter 1,25 g de 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane (DABCO) et bien mélanger. Centrifuger à 1.500 xg pendant 5 min. Aliquoter le surnageant (1 mL est suffisant pour les diapositives 15-20) et stocker à -20 ° C. Utilisez les aliquotes une fois.

2. Préparation du verre de couverture

1. Dégraisser le couvercleLunettes (25 x 50 mm ² ) en incubant pendant une nuit dans de l'acide chromosulfurique non dilué. Rincer les verres de couverture avec de l'eau distillée et les sécher pendant une nuit à 60 ° C dans un four.
2. Adhérer une bande de film de paraffine (10 x 15 cm ² ) sur un banc de laboratoire avec une goutte d'eau et retirer l'air en lissant le film de paraffine. Pipetter 80 μL de 10 μg / mL de VWF ou 100 μg / mL de fibrinogène sur le film de paraffine. Placez les lunettes sur les gouttes; La solution de protéines se répandra entre les deux surfaces pour recouvrir tout le côté arrière du verre. Incuber pendant 1,5 h à température ambiante (RT).
3. Retirez le film de paraffine et bloquez les lunettes de recouvrement en les plaçant, avec le côté revêtu vers le haut dans une plaque à 4 puits avec un tampon de blocage. Incuber pendant 1 h à 37 ° C ou pendant une nuit à 4 ° C. En tant que témoin, bloquer un verre de couverture qui n'a pas été revêtu de VWF ou de fibrinogène.

3. Préparation du plasma à forte teneur en plaquettes (PRP)

1. Recueillir du sang total citraté (concentration finale: 0,32% de citrate de sodium (M / V)) par ponction veineuse.
2. Centrifuger le sang pendant 15 min à 160 xg et RT sans frein. Recueillir le surnageant ( c'est-à-dire le PRP) avec une pipette Pasteur en plastique.
   REMARQUE: après centrifugation, trois couches peuvent être observées (de haut en bas): PRP, globules blancs et globules rouges. Assurez-vous de ne pas inclure les cellules blanches et rouges. Typiquement, 3 mL de PRP peuvent être collectés après centrifugation d'un tube sanguin de 9 ml.
3. Continuez à la section 4 si l'expérience sera effectuée avec des plaquettes lavées. Si le PRP est souhaité, passez à l'étape suivante.
4. Après la collecte de PRP, centrifuger le reste du sang (contenant le culot des globules rouges) à nouveau pendant 10 min à 2 000 xg sans frein. Recueillir le surnageant contenant le plasma pauvre en plaquettes (PPP).
   NOTE: Typiquement, 2 mL peuvent être collectés après cette deuxième étape de centrifugation.
5. Comptez le nombre de pDes latelets dans le PRP sur un analyseur de cellules et le diluer avec le PPP (étape 3.4) à une concentration de 150 000 plaquettes / μL.
   NOTE: Le volume total de PRP dilué dépend du nombre de plaquettes du donneur. Le nombre de plaquettes varie considérablement d'un donneur à l'autre et la dilution du PRP nécessite une évaluation individuelle. Les dénombrements de plaquettes sont considérés comme normaux dans les 150 000 et 450 000 plaquettes / μL.
6. Continuez à la section 5.

4. Préparation des plaquettes lavées

1. Déterminer le volume moyen de plaquettes (MPV) dans le PRP en utilisant un analyseur de cellule.
   REMARQUE: il s'agit d'un indicateur de pré-activation plaquettaire ¹¹ . Un MPV normal pour le repos des plaquettes est de 7,5-11,5 fL ¹¹ . Le MPV ne devrait pas augmenter de plus de 1,5 fL pendant la procédure de lavage des plaquettes.
2. Ajouter un volume de 1/10 d'ACD à PRP pour éviter la pré-activation des plaquettes et centrifuger pendant 15 min à 400 xg et RT sans frein. Supprimer le suPernatant et ré-suspendre le culot soigneusement dans le tampon HEPES Tyrode, pH 6,5, au volume original de PRP.
3. Décongeler une aliquote de prostacycline en ajoutant du TBS à une concentration de 10 μg / mL; Gardez-le sur la glace.
4. Pour prévenir l'activation des plaquettes, ajouter la prostacycline à une concentration finale de 10 ng / mL aux plaquettes ré-suspendues et centrifuger immédiatement pendant 15 minutes à 400 xg et RT sans frein. Retirer le surnageant et ré-suspendre le culot soigneusement dans le tampon HEPES Tyrode, pH 7,4.
5. Compter le nombre de plaquettes (étape 3.5) et déterminer le changement de MPV (étape 4.1) (le MPV ne doit pas dépasser 1,5 fL).
6. Réglez le nombre de plaquettes avec le tampon HEPES Tyrode, pH 7,4, à une concentration de 150 000 plaquettes / μL. Laisser les plaquettes récupérer pendant 30 minutes à la RT avant les expériences. Utilisez des plaquettes lavées pour des expériences dans les 4 h après l'isolement.

5. Assemblage de la chambre de débit

NOTE: Ces expériences utilisent une chambre de flux développée interne ¹² . Une variété de chambres d'écoulement commercialement produites peuvent être utilisées, pourvu qu'elles puissent contenir un verre de couverture, qui est préférentiellement amovible pour des analyses ultérieures. La chambre d'écoulement utilisée pour les expériences décrites est fabriquée à partir de poly (méthacrylate de méthyle) pour s'adapter précisément à un stade d'insertion de microscope. Il contient une entrée et une sortie ( Figure 1A - C ; 1, 2), ainsi qu'une connexion sous vide ( Figure 1A et C ; 3). Une feuille de silicone personnalisée ( Figure 1A et D ; 4) est placée sur le dessus. Deux découpes forment des canaux sous vide ( Figure 1A et D ; 5) pour attacher le verre de recouvrement ( Figure 1A ; 6) à la chambre. Une découpe centrale forme le canal d'écoulement ( figure 1A Et D ; 7; 2,0 mm de largeur et 0,125 mm de hauteur). L'entrée et la sortie sont connectées au canal d'écoulement, et le vide est connecté au canal sous vide.

1. Couvrir le haut de la chambre d'écoulement avec de l'eau distillée et placer la feuille de silicone personnalisée avec le côté lisse vers le bas sur l'eau. Flottez la feuille en position en enlevant l'excès d'eau tout en conservant la feuille en position.
   REMARQUE: Cette feuille de silicone est réutilisable (la silicone est connue pour ses propriétés inertes); En général, les plaquettes n'ont pas été observées pour s'y attacher. Les feuilles peuvent être nettoyées avec du détergent et réutilisées jusqu'à ce que le matériau soit endommagé ( c.-à-d. Déchirure, en particulier dans la zone entre les canaux). Généralement, une feuille peut être utilisée pendant 20 jours avec plusieurs expériences par jour.
2. Incuber la chambre d'écoulement pendant 1 h à 60 ° C pour évaporer l'eau résiduelle pour adhérer fermement la feuille de silicone à la chambre d'écoulement.
3. Avec une pipette Pasteur en plastique, ajoutez une goutte deLe tampon de HEPES Tyrode, pH 7,4, sur le canal d'écoulement. Placez le verre de recouvrement (voir la section 2) avec le côté recouvert vers le bas, sur le canal d'écoulement. Fixez la pompe à vide à la connexion sous vide ( figures 1A et C ; 3). Appliquer une pression de ~ 10 kPa.

6. Pré-coloration des plaquettes et préparation des anticorps

1. Coloration des plaquettes
   1. Incuber les plaquettes lavées avec 10 μg / mL de DAPI pendant 30 minutes à 37 ° C dans l'obscurité. Pour éliminer la DAPI non liée et prévenir l'activation des plaquettes, ajouter une prostacycline à une concentration finale de 10 ng / mL et centrifuger immédiatement pendant 15 minutes à 400 xg et RT sans frein.
   2. Reconstituer la pastille de plaquettes dans le tampon HEPES Tyrode, pH 7,4, à une concentration plaquettaire de 150 000 plaquettes / μL.
2. Préparation des anticorps
   1. Mélanger l'anticorps marqué par la biotine avec une streptococtique AlexaTavidine au rapport molaire de 1: 1. Incuber pendant au moins 10 min à température ambiante avant utilisation (étape 7.6).
      REMARQUE: l'efficacité de l'étiquetage de la biotine peut varier entre les différents lots. Devrait-il y avoir des problèmes avec la visualisation des molécules cibles, des expériences de contrôle devraient être effectuées pour confirmer la biotinylation réussie, ainsi que les propriétés liées à la cible de l'anticorps biotinylé spécifique.

7. Perfusion

1. Commencez le microscope à fluorescence, ainsi que le logiciel de microscope. Utilisez les paramètres du microscope indiqués dans le tableau 1 .
   REMARQUE: Initier le microscope et les paramètres d'enregistrement pour la visualisation et l'enregistrement des plaquettes et les anticorps et / ou colorants marqués par fluorescence choisis en utilisant une expérience appropriée dans le logiciel du microscope. Effectuer des expériences de flux à la RT.
2. Bloquez le tube d'entrée en connectant une seringue de 10 ml au tube et en aspirant 1% de HSA bloDans le tube d'entrée. Incuber pendant 15 min à la RT. Rincer le tube d'entrée en aspirant le tampon de HEPES Tyrode, pH 7,4, dans le tube d'entrée.
3. Raccorder le tube d'entrée bloqué et le tube de sortie non traité, tous deux avec un diamètre de 1,02 mm et une longueur de ~ 20-30 cm à l'entrée et à la sortie de la chambre. Connectez une seringue de 10 ml (ou un volume inférieur pour plus de précision) au tube de sortie. Allumez la pompe à seringue.
   REMARQUE: le diamètre de la seringue, combiné au débit fixé sur la pompe, détermine le débit volumétrique. Ensemble avec la surface du canal d'écoulement, la vitesse de cisaillement peut être calculée selon la formule ¹³ au dessous de. Par conséquent, il est possible de manipuler le taux de cisaillement en modifiant le débit de la pompe à seringue ou en modifiant les dimensions du canal d'écoulement. Un taux de cisaillement de 800-1 600 s ^-1 typiquement des modèles pour le débit sanguin artériel, tandis que 25 à 100 modèles ^s-1 pour le sang veineuxcouler. Pour cette configuration, un débit de 7,5 μL / min donne un taux de cisaillement de 25 s ^-1 .
   Taux de cisaillement = 6Q / h ² w en s ^-1
   Où: Q = débit volumétrique (mL / s), h = hauteur de canal (cm) (0,0125 cm, c'est l'épaisseur de la feuille de silicone), w = largeur de canal (cm) (0,2 cm dans cette chambre).
4. Placez une goutte d'huile d'immersion sur un objectif 100X (amplification totale de 1000X) et montez la chambre sur le microscope avec la surface du verre vers le bas.
5. Placez le tube d'entrée dans un tube contenant du tampon HEPES Tyrode, pH 7,4. Retirer manuellement le piston de la seringue relié au tube de sortie et tirer la solution à travers la chambre pour enlever l'air du système. Placez la seringue dans la pompe de la seringue ( Figure 1B et C ; 8) et faites fonctionner la pompe brièvement pour serrer le piston et assurer un écoulement stable.
6. Ajouter des anticorps et / ou des colorants à la suspension plaquettaire ou au PRP, soigneusementMélanger avec une pipette en plastique et transférer le mélange dans un tube de 1,5 ml.
   REMARQUE: Pour une perfusion typique de 30 minutes à une vitesse de cisaillement de 25 ^s-1 (7,5 μL / min), un minimum de 225 μL de suspension de plaquettes est nécessaire. Les anticorps utilisés pour les résultats représentatifs sont présentés dans le tableau 2 .
7. Déplacez le tube d'entrée, en pressant, à partir du tampon HEPES Tyrode, pH 7,4, jusqu'à un tube de 1,5 ml contenant du PRP ou des plaquettes lavées et des anticorps et / ou des colorants ( Figure 1B et C ; 9).
   REMARQUE: Il est important que, lors du transfert du tube, le tube soit comprimé (presser l'air) pour empêcher l'air d'entrer dans le tube. Il est possible de traiter les plaquettes adhérentes avec une variété de réactifs dans une étape ultérieure en déplaçant le tube d'entrée vers un autre tube d'une manière similaire. Une liste des réactifs potentiellement utiles est fournie dans le tableau 3 .
8. Sélectionnez la "visualisation en direct"N "dans le logiciel, concentrez le microscope sur la surface du verre de couverture revêtu et démarrez la pompe à une vitesse de cisaillement de 1.600 ^s-1 (484 μL / min) jusqu'à ce que les plaquettes atteignent la chambre d'écoulement. En ce moment, Réduisez le taux de cisaillement à 25 ^s-1 en changeant les réglages de la pompe à seringue à un débit de 7,5 μL / min.
9. Surveillez la surface du côté recouvert du verre de recouvrement, attendez que la première plaquette commence à adhérer, concentre le microscope sur cette plaquette et commencez à enregistrer en déclenchant l'expérience dans le logiciel. Voir le tableau 1 pour les paramètres d'enregistrement utilisés ici.
10. Suivez l'enregistrement en direct visuellement. Après 30 minutes, arrêtez la pompe à seringue.
    REMARQUE: Assurez-vous que les plaquettes restent concentrées au cours de l'expérience. Typiquement, 20-30 plaquettes s'attachent dans le champ de vision à un grossissement de 1000X; Il s'agit de 2 000 à 3 000 plaquettes dans l'ensemble du canal d'écoulement.
11. Fixation en utilisantLa chambre d'écoulement (facultatif).
    1. Lorsque le débit s'est arrêté après l'arrêt de la pompe de la seringue, transférez le tube d'entrée (sans air) à la solution fixative. Redémarrez la pompe et faites circuler le tampon de fixation dans le canal pendant au moins 10 min au même débit que celui mentionné à l'étape 7.8.
12. Retirez la chambre du microscope, nettoyez l'huile d'immersion du verre, débranchez le vide et retirez soigneusement le verre de couverture de la chambre avec une aiguille 18 G.
    REMARQUE: Empêcher le verre de couverture de se casser et d'endommager la feuille de silicium.
13. Placez la glissière de recouvrement (avec les cellules dirigées vers le haut) dans une plaque de 4 puits sur un tissu, préalablement mouillé avec de l'eau distillée.
    REMARQUE: ceci empêche le verre de couverture d'adhérer à la surface du puits et empêche le séchage.
14. Pipetter 750 μL de solution fixante sur le dessus du verre de couverture et incuber pendant 1 h à température ambiante. Dans le cas où les échantillons ne peuvent pas être analysés directement,Les stocker dans 0,5% de PFA (dilué par le tampon HEPES Tyrode, pH 7,4) à 4 ° C pour assurer une fixation stable. Passez à la section 8 pour traiter le verre de couverture pour l'imagerie.
15. Après utilisation, rincer la chambre, le tube et la feuille avec de l'eau distillée et incuber pendant une nuit dans une solution détergente. Avant la réutilisation de la chambre et d'autres composants, rincer à l'eau distillée.
16. Enregistrez les fichiers de données brutes du microscope contenant toutes les métadonnées. Au besoin, exportez les films vers .MOV, h.264 compressé ou .AVI non compressé. Enregistrez les images séparées sous forme de fichiers JPEG ou TIF.

8. Préparation d'échantillons pour la microscopie confocale à fluorescence

1. Transférez les lunettes de couverture vers de nouvelles plaques à 4 puits et rincez 5 fois avec 3 ml de tampon HEPES Tyrode, pH 7,4. Ajouter 3 ml / puits de tampon bloquant et incuber pendant 1 h à la température ambiante.
2. Supprimer le tampon de blocage; Ajouter 3 ml / puits de 0,15% de glycine (M / V) dans le tampon HEPES Tyrode, pH 7,4; Et incuber pendant 15 min à RT.
3. Enlever la solution de glycine et laver 5 fois dans 3 ml / puits de tampon de blocage. Eventuellement, ajouter des anticorps conjugués au fluorophore dilués dans un tampon de blocage pour une coloration supplémentaire. Incuber pendant 1 h à la température ambiante dans l'obscurité.
4. Laver 5 fois avec un tampon de blocage et 2 fois avec de l'eau distillée. Séchez le verre en enlevant l'excès de liquide avec un tissu (des bords vers l'intérieur), sans toucher les cellules.
5. Pipeter 60 μL de solution d'alcool polyvinylique sur une lame de microscope. Placez le verre de couverture, avec les cellules vers le bas, en haut de la goutte et laissez l'alcool polyvinylique se propager entre les deux surfaces. Incuber toute la nuit à TA dans l'obscurité.
6. Analyser les cellules par microscopie confocale ¹⁴ .
7. Enregistrez les fichiers de données brutes des données de pile enregistrées contenant toutes les métadonnées. Au besoin, traiter les fichiers de données brutes dans des fichiers MOV, h.264 compressés ou .AVI non compressés. Enregistrez les piles séparées sous forme de fichiers JPEG ou TIF.

Résultats

La figure 1 montre les images de la chambre d'écoulement et la configuration expérimentale; La position et les dimensions de la feuille de silicium; Et les connexions de tubes. La figure 2 fournit des détails sur les dimensions de la chambre d'écoulement. La figure 3 et le film 1 montrent une série temporelle d'images d'adhésion et d'étalement des plaquett...

Discussion

Dans le monde entier, la thrombose est la principale cause de décès et de morbidité, et les plaquettes jouent un rôle central dans son développement. Ce travail décrit une méthode pour l'imagerie des cellules vivantes de la dégranulation des plaquettes sous l'écoulement. On suppose généralement que, lorsque les plaquettes deviennent activées, tout le contenu granulaire est directement rejeté dans la solution. Les résultats qui l'accompagnent suggèrent que ce n'est pas nécessairement le ca...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	VWR	441476L
Na2HPO4	Sigma	S-0876
NaCl	Sigma	31434
KCl	Sigma	31248
MgSO4	Merck KGaA	1.05886
D-glucose	Merck KGaA	1.04074
Prostacyclin	Cayman Chemical	18220
Tri-sodium citrate	Merck KGaA	1.06448
Citric acid	Merck KGaA	1.00244
Cover glasses	Menzel-Gläser	BBAD02400500#A	24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm thickness.
Chromosulfuric acid (2% CrO3)	Riedel de Haen	07404	CAS [65272-70-0].
Von Willebrand factor (VWF)	in-house purified
Fibrinogen	Enzyme Research Laboratories	FIB3L
4 well dish, non-treated	Thermo Scientific	267061
Human Serum Albumin Fraction V	Haem Technologies Inc.	823022
Blood collection tubes, 9 mL, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2%	Greiner Bio-One	455322
Cell analyser	Abbott Diagnostics	CELL-DYN hematology analyzer
Paraformaldehyde	Sigma	30525-89-4
Syringe pump	Harvard Apparatus, Holliston, MA	Harvard apparatus 22
10 mL syringe with 14.5 mm diameter	BD biosciences	305959	Luer-Lok syringe
Anti-CD63-biotin	Abcam	AB134331
Anti-CD62P-biotin	R&D Systems	Dy137
4’,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Polysciences Inc.	9224
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate	Thermo Scientific	S11223
Immersion oil	Zeiss	444963-0000-000
Detergent solution	Unilever, Biotex
Glycine	Sigma	56-40-6
Polyvinyl alcohol	Sigma	9002-89-5	Mowiol 40-88.
Tris hydrochloride	Sigma	1185-53-1
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)	Sigma	280-57-9
Sheep Anti-hVWF pAb	Abcam	AB9378
Alexa fluor 488-NHS	Thermo Scientific	A20000
Glycerol	Sigma-Aldrich	15523-1L-R
Parafinn film	Bemis	PM-996	4 in. x 125 ft. Roll.
Silicone sheet non-reinforced	Nagor	NA 500-1	200 mm x 150 mm x 0.125 mm.
Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels	in-house made		Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1)
1.5 mL tubes	Eppendorf AG	T9661-1000AE
Fluorescent microscope	Zeiss Observer Z1		Equiped with LED excitation lights.
Microscope software	Zeiss ZEN 2	blue edition
18 G needle (18 G x 1 1/2")	BD biosciences	305196
NaCl	Riedel de Haen	31248375
Tris	Roche	10708976
Plastic pasteur pipet	VWR	612-1681	7 mL non sterile, graduated up to 3 mL.
Silicone tubing	VWR	228-0656	Inner diameter. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm.
Microscope slides	Thermo Scientific	ABAA000001##12E	76 x 26 x 1 mm, ground edges 45 °, frosted end.