Suraccumulation induite par le Ileectomy de Bile dans l’intestin de souris

Résumé

La réabsorption des acides biliaires dépendant de l’intestin grêle et rétro-inhibition de la synthèse hépatique des acides biliaires est important pour la santé et de l’homéostasie systémique. Dans cette étude, nous décrivons un modèle murin pour résection iléale évaluer la malabsorption induite par l’ileectomy de bile et suraccumulation toxicité dans l’intestin de souris.

Résumé

Résection intestinale est une commune approche thérapeutique pour les maladies comme l’obésité, maladie inflammatoire de l’intestin, la maladie de Crohn et le cancer du côlon qui entraîne souvent des effets indésirables comme le syndrome sévère de l’intestin court y compris diarrhée acide biliaire, déshydratation, troubles électrolytiques et malabsorption des nutriments. Ici, nous présentons un modèle murin de résection iléale, appelé ileectomy, pour évaluer la communication de tissu et le maintien de l’homéostasie systémique. Après résection iléale, sang circulant est définitivement dépourvu le facteur de croissance de fibroblaste iléon spécifiques hormone endocrine 15 (FGF15), qui libère son endocrinienne inhibition de la synthèse des acides biliaires dans le foie. En combinaison avec l’augmentation de la production et aboli la réabsorption des acides biliaires après avoir enlevé l’iléon, la souris qui a été opéré souffrent de suraccumulation de sels biliaires dans l’intestin et de la diarrhée associée, la morbidité et la mortalité. Nouvelle utilisation du modèle chirurgie introduit dans cette étude peut-être donner un aperçu mécaniste et fonctionnel iléale contrôle de régulation métabolique systémique dans la physiologie et la maladie.

Introduction

Dans la recherche biomédicale moderne, modèles animaux génétiquement manipulés sont largement utilisés pour glaner des aperçus de maladies humaines. En particulier, tissu ou spécifiques des cellules pertes et gain des fonctions des gènes ont été utilisées pour étudier la régulation moléculaire ainsi que des effets biologiques induits. Malgré les progrès de la manipulation des gènes cibles in vivo, il y a limitation persistante. Première, nombreux cellulaires ou tissulaires destructions spécifiques aura une incidence sur plusieurs organes. Par exemple, suppression de gène épithéliales éliminera expression dans l’épithélium de nombreux tissus. En outre, même si la suppression est restreinte à un tissu spécifique, contrôle spatial est rarement possible. Par exemple, dans un tissu comme l’intestin, segments distincts de réaliser des fonctions très spécifiques qui ne peuvent pas être manipulées avec précision en vivo. Dans ces situations, la résection des tissus contenant du gène on estime qu’une approche plus efficace d’étudie pour déterminer l’importance mécaniste et fonctionnel de la communication de tissu.

Ileectomy est surtout utilisé en patients atteints de maladie de Crohn et les maladies inflammatoires, impliquant l’iléon distal ^1,2,3. L’iléon produit généralement plusieurs hormones de stockage énergétique comme facteur de croissance fibroblastique 15/19 (FGF15/19), peptide YY (PYY) et le glucagon-like peptide 1/2 (GLP1/2) ; ces hormones jouent un rôle local et endocrinien important dans plusieurs fonctions biologiques^4,5,6. Parmi ces hormones, FGF15 a été identifié comme un inhibiteur endocrinien robuste de la synthèse des acides biliaires dans le foie. Une fois réabsorbé dans les entérocytes iléaux, acides biliaires activent le récepteur de farnesoid X de récepteurs nucléaires (FXR) pour stimuler l’expression de Fgf15 , qui par la suite conduit à rétro-inhibition de la synthèse hépatique des acides biliaires ⁷. Dans une étude récente, nous avons introduit le modèle ileectomy de la souris afin d’étudier l’iléale kruppel-like factor 15 (KLF15) -Fgf15 axe qui régule la production de circadienne des acides biliaires dans le foie ⁸de signalisation. Plus important encore, nous avons introduit une nouvelle famille, les facteurs de kruppel-like, particulièrement KLF15, en biologie de l’acide biliaire. Se fondant sur des études fonctionnelles, y compris une chirurgie ileectomy, nous avons déterminé que KLF15 augmente la synthèse d’acides biliaires via un mécanisme indirect de non hépatiques. Enfin, KLF15 iléale est également identifiée comme le premier régulateur négatif endogène de Fgf15.

Les segments intestinaux descendant de proximal à distales régions sont responsables de l’absorption des nutriments différents. L’iléon est le segment majeur responsable des acides biliaires et la vitamine B₁₂ (V_B12) absorption ⁹. Une étude antérieure a employé un modèle murin de résection intestinale proximale afin d’étudier le syndrome de l’intestin court ; diverses longueurs de résection, alimentation et types de suture ont été proposées pour maintenir un taux optimal de survie après la chirurgie ¹⁰. En outre, une étude plus récente indique que résection iléale entraîne généralement une maladie plus grave que les autres résections de segment gastro-intestinal (GI) en raison de la capacité d’adaptation une diminution des autres voies ¹¹. Ce sujet a gagné intensives intérêts de groupes de recherche fondamentale et clinique, alors que la compréhension de la récupération et les approches thérapeutiques efficaces sont encore limitées.

Acide biliaire diarrhée provient de déséquilibres dans l’homéostasie des acides biliaires dans l’enterohepatic circulation ^12,13. Il peut être une conséquence de la résection iléale, maladie gastro-intestinale ou un résultat de malabsorption des acides biliaires idiopathiques. Plus de 80 % des patients se présentent avec diarrhée après avoir subi une résection iléale ¹⁴. Ileectomy a le potentiel pour être un modèle de chirurgie importante pour l’étude des acides biliaires diarrhée. Dans cette étude, une série de résection iléale fournissent une évaluation dégradée de carence en FGF15 ainsi que la malabsorption intestinale des sels biliaires, suraccumulation et dommages toxiques.

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Protocole

protocole animale a été revu et approuvé par le Comité de l’urbanisme à la Case Western Reserve University School of Medicine et d’institutionnels animalier et a été menée conformément au Guide National Institutes of Health (NIH) pour le Care and Use of Laboratory Animals (8e édition, 2011). Souris ont été euthanasiés par des méthodes conformes avec les directives de l’American Veterinary Medical Association (AVMA) pour l’euthanasie des animaux (édition de 2013). Souris de 8-16 semaines de vieux mâles, C57BL/6J, ont été utilisés dans le présent protocole. Souris ont été logés dans un environnement sombre/clair cycle de 12 h.

1. préparation préopératoire

1. transfert de souris à une cage propre 24 h avant l’intervention. Permettre aux animaux libre accès à l’eau. Remplacer la nourriture chow avec des aliments mous (complément alimentaire gel) 4-6 h avant la chirurgie afin de réduire le contenu de l’intestin grêle pour chirurgie.
2. Stériliser tous les instruments chirurgicaux et de préparer le matériel chirurgical stérile à usage unique. Nettoyer le domaine de la chirurgie et l’anesthésie coiffe avec l’éthanol à 70 %.
3. Mis en place un microscope à dissection, isoflurane vaporisateur anesthésique, instruments et une température contrôlée petite animale table d’opération chirurgicale pour maintien en température corps. Organiser les instruments, les sutures et seringues dans un emplacement pour un accès gratuit pendant la chirurgie.
4. Mis en place une source de lumière pour fournir assez de lumière pour la zone chirurgicale.
5. Préparer la solution saline 0,9 % stérile dans la seringue de 5 mL pour un nettoyage intestinal et abdominale.

2. Ileectomy et anastomose

1. souris anesthésier à l’isoflurane (2-3 %) dans une chambre de petit animal de l’incubation. Déterminer anesthetization adéquate en utilisant la technique de pincement d’orteil alors que l’animal est sur isoflurane.
2. Enlever les poils abdominaux en appliquant le produit cheveux et essuyer les cheveux loin à l’aide de compresses tout en conservant l’anesthésie. Placez votre souris sur une température contrôlée petite animale table d’opération chirurgicale ( Figure 1 A) pour maintenir la température corporelle à 37 ° C. maintenir l’anesthésie à l’isoflurane (1-2 %) grâce à un masque facial. Traiter les yeux de la souris avec l’onguent oculaire.
3. Nettoyer la peau à l’aide de povidone-iode et 70 % d’alcool et couvre la zone chirurgicale de l’abdomen avec de la gaze chirurgicale stérile ( Figure 1 B).
4. Faire une incision abdominale médiane à l’aide d’un bistouri dès que l’anesthésie est en vigueur. Utilisez un coton-tige pour protéger le muscle abdominal souris intestin et tirez avec rétracteurs pour pleinement ouvert et exposer la cavité abdominale ( Figure 1 C).
5. Localiser le caecum. À partir de caecum, déplacer délicatement l’iléon connecté et une partie du jéjunum hors de la cavité abdominale ( Figure 1 D).
   Remarque : Le caecum peut facilement être identifié en raison de sa grande taille même après avoir jeûné.
6. Ligaturer la branche supérieure de l’artère mésentérique supérieure avec une suture de soie de 7-0 d’occlure le sang fournissant le segment iléal qui consiste à être excisées. La couleur iléale passe du rose au violet foncé après ligature. (E - F de la figure 1).
7. Selon le but de l’expérience, à l’aide de ciseaux, d’accise et enlever 50 % ou 90 % de l’iléon.
   Remarque : Pour la chirurgie de l’imposture, n’effectuez pas la ligature de l’artère mésentérique supérieure et ne retirez pas l’iléon.
8. Rincer la lumière des deux extrémités iléales avec sérum physiologique à 0,9 %.
   NOTE : comme l’iléon intacte restante reçoit encore une circulation sanguine normale de l’artère mésentérique supérieure, une petite quantité de sang va être éliminée au cours du processus. Cela indique également que les réserves de sang aux extrémités iléales sont normal et qu’il n’assure aucune ischémie au cours de la procédure de l’anastomose ( Figure 1 G).
9. Localiser les mésentères sur le côté de chaque extrémité iléale. Aligner les mésentères et suturer les extrémités iléales ensemble à l’aide de suture ( Figure 1 G - H) de la 8-0.
10. Suture du côté controlatéral de l’iléon pour garder l’iléon anastomoser de manière naturelle ( Figure 1 I).
11. Suture les côtés supérieures et inférieures, entre les deux sutures originales à bien joindre les deux iléale extrémités ensemble ( Figure 1 J).
12. Confirme qu’il n’y a pas de fuite provenant du site de l’anastomose après avoir terminé la procédure suture en trois étapes ( Figure 1 G-I). Retourner le caecum et l’intestin grêle dans la cavité abdominale à l’emplacement d’origine anatomique. Laver la zone de chirurgie avec du sérum physiologique 0,9 % tiède à l’aide d’une aiguille émoussée. ( figure 1 K).
13. Refermer l’incision de la couche de muscles abdominaux avec suture 6-0. Alignez l’incision cutanée abdominale à l’aide de pinces et suture de la peau abdominale afin de faciliter la cicatrisation optimale ( Figure 1 L).

3. Soins postopératoires

souris

1. transfert après l’intervention d’une unité de soins intensifs pour la récupération. Les loger dans une cage de papier-literie sur une garniture de chauffage à température contrôlée pour continuer la récupération post-opératoire du jour au lendemain. Fournir des souris avec des aliments mous, en plus de nourriture et d’eau.
2. Administrer buprénorphine (0,05 - 0,1 mg/kg) par injection sous-cutanée tous les 8 à 12 h pour l’analgésie.
   NOTE : Euthanasier souris par le CO ₂ si gravement malade.
3. à la fin, sacrifier la souris à l’aide de surdosé isoflurane et récolte des échantillons selon les besoins (section 4).

4. Évaluation de suraccumulation de Bile induite par le Ileectomy

1. peser et disséquer les souris un jour après une résection de 0 % (sham), 50 % ou 90 % de l’iléon.
2. Supprimer le tractus gastro-intestinal et pesez-le. Calculer le poids de la GI au rapport de poids de corps pour évaluer la sévérité de la malabsorption des sels biliaires et de suraccumulation.
3. Transfert du tractus GI dans des tubes coniques 15 mL et les couper en segments courts à l’aide de ciseaux. Après la découpe, centrifuger à 3 000 x g pendant 10 min. transférer le surnageant (GI fluide contenant des sels biliaires) dans un tube propre.
4. Mesurer le volume total et le poids du fluide de la GI et de calculer le poids de fluide GI tract rapport poids / afin d’évaluer davantage suraccumulation de bile dans le tractus gastro-intestinal.
5. Déterminer le montant total de bile dans le surnageant par dosage de l’acide biliaire, comme décrit dans référence ⁸.

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Résultats

Les modalités d’ileectomy sont indiquées dans la Figure 1. La première étape comprend la préparation cutanée abdominale de souris, faire une incision abdominale et à l’aide de rétracteurs d’exposer pleinement l’intestin (Figure 1A-C). Ensuite, se trouvait le caecum de souris (Figure 1D) ; étant donné que sa taille et sa forme en font un point de re...

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Discussion

Afin d’effectuer une ileectomy réussie, l’artère mésentérique supérieure doit être ligaturé à l’avance pour bloquer l’approvisionnement en sang au segment RESECTION. Le segment iléal ischémique s’éteindront violet foncé après ligature. Le segment iléal doit alors être complètement réséqué. Une irrigation sanguine normale doit être assurée pour les extrémités retenues. Cela est essentiel pour éviter les saignement et une mauvaise élimination, qui peut facilement cause échec chirurgical ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope	Olympus	SZ61	For surgery
Animal temperature controller	Physitemp Instruments, Inc.	TCAT-2LV	For body temperature control
Isoflurane anesthetic vaporizer	VetEquip	911104	For anesthesia
Dissection forceps	Fine Science Tools, Inc.	11274-20	For surgery
Scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	For surgery
Needle holder	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7882	For surgery
Micro knives-needle blade	Fisher Scientific	10318-14	For surgery
6-0 monofilament suture	Ethicon	1698G	For abdominal skin closure
7-0 silk suture	Ethicon	766G	For ligation
8-0 monofilament suture	Ethicon	1714G	For anastomosis
Surgical sponges	Dynarex Corp.	3333	For surgery
Small cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-118	For surgery
Isoflurane	Piramal Healthcare Limited	66794-013-25	For anasthesia
Buprenorphine hydrochloride	Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals	12496-0757-1	For analgesia
0.9% sodium chloride Injection	B. Braun Medical Inc.	0264-7800-10	For washing/injection
Povidone iodine prep solution	Dynarex Corp.	1413	For skin preparation
Puralube vet ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38	For eye pretection
Hair remover lotion	Church & Dwight Co., Inc.		For skin preparation
Intensive care unit	ThermoCare	FW-1	For post-surgery recovery
DietGel recovery	ClearH2O	72-06-5022	For post-surgery recovery
Aurum total RNA fatty and fibrous tissue kit	Bio-Rad	7326830	For RNA isolation
iScript reverse transcription supermix for RT-qPCR	Bio-Rad	1708841	For reverse transcription assay
TaqMan fast advanced master mix	Applied Biosystems/Life Technologies	4444965	For QPCR analysis
Total bile acid assay kit	Genzyme Diagnostic	DZ042A-K01	For bile acid assay
C57BL/6J	The Jackson Laboratory