Overaccumulation ileectomy-indotta della Bile nell'intestino del Mouse

Riepilogo

Riassorbimento degli acidi biliari nell'intestino tenue-dipendente e feedback inibizione della sintesi dell'acido di bile epatica è importante per la salute e l'omeostasi sistemica. In questo studio, descriviamo un modello murino per resezione ileale valutare il malassorbimento indotta da ileectomy bile, overaccumulation e tossicità nell'intestino del mouse.

Abstract

La resezione intestinale è un comune approccio terapeutico per le malattie umane quali l'obesità, le malattie infiammatorie intestinali, morbo di Crohn e tumore del colon che si traduce spesso in effetti avversi di intestino corto grave sindrome-come compreso diarrea degli acidi biliari, disidratazione, alterazioni elettrolitiche e malassorbimento dei nutrienti. Qui vi presentiamo un modello murino di resezione ileale, chiamato ileectomy, per valutare la comunicazione del tessuto e il mantenimento dell'omeostasi sistemica. Dopo resezione ileale, sangue circolante è permanentemente priva il fattore di crescita del fibroblasto ileo-specifico ormone endocrino 15 (FGF15), che rilascia la sua endocrine inibizione della sintesi degli acidi biliari nel fegato. In combinazione con l'aumento della produzione e abolita riassorbimento degli acidi biliari dopo aver rimosso l'ileo, topi che ha subito l'ambulatorio soffrono overaccumulation sale biliare nell'intestino e la diarrea associata, la morbosità e la mortalità. Romanzo l'utilizzo del modello chirurgia introdotto in questo studio può fornire le comprensioni meccanicistiche e funzionale nel controllo ileale di regolazione metabolica sistemica nella fisiologia e nella malattia.

Introduzione

Nella moderna ricerca biomedica, modelli animali geneticamente manipolati sono ampiamente utilizzati per raccogliere intuizioni in malattie umane. In particolare, tessuto o cellula-specifico funzioni di guadagno e perdita di geni sono state utilizzate per studiare la regolazione molecolare così come gli effetti biologici indotti. Nonostante i progressi nel manipolare geni bersaglio in vivo, non ci sono limitazioni persistente. Primo, molte delle cellule o del tessuto specifiche delezioni interesserà gli organi multipli. Ad esempio, omissione del gene epiteliali eliminerà espressione negli epiteli dei tessuti multipli. Ulteriormente, anche se l'eliminazione è limitato ad un tessuto specifico, controllo spaziale è raramente realizzabile. Per esempio, in un tessuto come l'intestino, segmenti distinti svolgere funzioni molto specifiche che non possono essere manipolate con precisione in vivo. In queste situazioni, resezione dei tessuti contenenti gene è considerata come un approccio più efficiente di studio per determinare il significato meccanicistico e funzionale di comunicazione del tessuto.

Ileectomy è principalmente usato in pazienti con Crohn e malattie infiammatorie che coinvolge l'ileo distale ^1,2,3. L'ileo in genere produce diversi ormoni di deposito di energia come fattore di crescita fibroblastico 15/19 (FGF15/19), peptide YY (PYY) e peptide glucagone-simile 1/2 (GLP1/2); questi ormoni svolgono i ruoli importanti locali ed endocrini in molte funzioni biologiche^4,5,6. Tra questi ormoni, FGF15 è stato identificato come un robusto endocrino inibitore della sintesi degli acidi biliari nel fegato. Una volta riassorbito nel enterocytes ileale, acidi biliari attivano il recettore di farnesoid X di recettori nucleari (FXR) stimolare l'espressione di Fgf15 , che successivamente conduce ad inibizione di risposte di sintesi di acidi biliari epatici ⁷. In uno studio recente, abbiamo introdotto il modello di ileectomy di topo per studiare il fattore kruppel-like ileale 15 (KLF15) -Fgf15 segnalazione asse che regola la produzione circadiana dell'acido di bile nel fegato ⁸. La cosa più importante, abbiamo introdotto una nuova famiglia, i fattori di kruppel-like, specialmente KLF15, in biologia degli acidi biliari. Basato su studi funzionali, compresa la chirurgia ileectomy, abbiamo determinato quella sintesi di acidi biliari sopraregola KLF15 tramite un meccanismo non-epatico indiretto. Infine, KLF15 ileale è anche identificato come il primo regolatore endogeno negativo di Fgf15.

I segmenti intestinali discendente da prossimale a distale regioni sono responsabili di assorbimento dei diverse nutrienti. L'ileo è il segmento principale responsabile degli acidi biliari e della vitamina B₁₂ (V_B12) assorbimento ⁹. Un precedente studio ha impiegato un modello murino di resezione dell'intestino prossimale per studiare la sindrome da intestino corto; vari tipi di sutura, diete e lunghezze di resezione sono stati proposti per mantenere un tasso di sopravvivenza post-operatorio ottimale ¹⁰. Inoltre, una revisione più recente indica che la resezione ileale in genere comporta la malattia più severa rispetto altre resezioni di segmento gastrointestinale (GI) a causa della diminuita capacità di adattamento del rimanente tratto ¹¹. Questo argomento ha guadagnato intensivi interessi di gruppi di ricerca clinica e di base, mentre la comprensione del recupero e gli approcci terapeutici efficaci sono ancora limitate.

Acidi biliari diarrea risultati da squilibri nell'omeostasi dell'acido di bile nella circolazione enteroepatica ^12,13. Può essere una conseguenza della resezione ileale, malattia gastrointestinale o un risultato di malassorbimento idiopatico dell'acido di bile. Più dell'80% dei pazienti sono stati trovati per presentare con diarrea dopo avere subito la resezione ileale ¹⁴. Ileectomy ha il potenziale per essere un modello di intervento chirurgico importante per l'indagine di acidi biliari diarrea. In questo studio, una serie di resezioni ileali forniscono una valutazione gradiente di carenza di FGF15 così come malassorbimento intestinale di sali biliari, overaccumulation e danni tossici.

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Protocollo

protocollo animale è stato esaminato e approvato dal comitato di uso presso Case Western Reserve University School of Medicine e istituzionali Animal Care ed è stato condotto in conformità con la guida del National Institutes of Health (NIH) per la Cura e l'uso degli animali da laboratorio (8 ° edizione, 2011). Topi sono stati eutanasizzati dai metodi compatibile con l'associazione medica veterinaria americana (AVMA) linee guida per l'eutanasia degli animali (edizione 2013). C57BL/6J, Maschio, 8-16 settimana vecchi topi sono stati usati in questo protocollo. Topi sono stati alloggiati in un ambiente buio/luce ciclo di 12 h.

1. preparazione pre-operatoria

1. topi di trasferimento per una gabbia pulita 24 h prima della procedura. Gli animali ammessi libero accesso all'acqua. Sostituire il chow cibo con cibi morbidi (gel integratore alimentare) 4-6 h prima della chirurgia per ridurre il contenuto dell'intestino tenue per chirurgia.
2. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e preparare i materiali chirurgici sterili monouso. Pulire l'area di chirurgia e il cono di naso anestetico con etanolo al 70%.
3. Impostare un microscopio di dissezione, vaporizzatore anestetico isoflurano, strumenti, e di un temperatura controllata piccolo animale tavolo operatorio per manutenzione di temperatura del corpo. Organizzare gli strumenti, suture e siringhe in una posizione per il libero accesso durante l'intervento chirurgico.
4. Impostare una fonte di luce per fornire abbastanza luce per l'area chirurgica.
5. Preparare soluzione fisiologica 0,9% sterile nella siringa da 5 mL per la pulizia intestinale e addominale.

2. Ileectomy e l'anastomosi

1. Anesthetize topi con isoflurano (2-3%) in una camera di incubazione animale piccolo. Determinare adeguate amputate utilizzando la tecnica del pizzico di punta, mentre l'animale è il isoflurane.
2. Rimuovere capelli addominali applicando il prodotto di rimozione dei capelli e pulire capelli distanza utilizzando spugne chirurgiche, mantenendo l'anestesia. Posizionare il mouse su un temperatura controllata piccolo animale tavolo chirurgico ( Figura 1 A) per mantenere la temperatura corporea presso l'anestesia Maintain a 37 ° C. con isoflurano (1-2%) attraverso una maschera facciale. Trattare gli occhi del mouse con unguento oculare.
3. Pulire la pelle con povidone-iodio e 70% di alcol e coprire l'area chirurgica dell'addome con garza chirurgica sterile ( Figura 1 B).
4. Fare un'incisione addominale del midline usando un bisturi chirurgico una volta che l'anestesia è in vigore. Usare un applicatore con punta di cotone per proteggere il muscolo addominale del mouse intestino e tirare con Divaricatori per completamente aprire ed esporre la cavità addominale ( Figura 1 C).
5. Individuare l'intestino cieco. A partire dall'intestino cieco, spostare con cautela l'ileo collegato e parte del digiuno dalla cavità addominale ( Figura 1 D).
   Nota: L'intestino cieco possa essere facilmente identificato grazie alle sue grandi dimensioni anche dopo digiuno.
6. Legare il ramo superiore dell'arteria mesenterica superiore con una sutura in seta 7-0 per occludere il sangue fornendo il segmento ileale che deve essere asportato. Il colore ileale cambia dal rosa al viola scuro dopo la legatura. ( Figura 1 -E - F).
7. a seconda dello scopo dell'esperimento, usando le forbici, asportare e rimuovere il 50% o 90% dell'ileo.
   Nota: Per la chirurgia di sham, non eseguire la legatura dell'arteria mesenterica superiore e non rimuovono l'ileo.
8. Irrigare il lume di entrambe le estremità ileale con soluzione fisiologica allo 0,9%.
   Nota: come ileo intatto restante sta ancora ricevendo un rifornimento di anima normale dall'arteria mesenterica superiore, una piccola quantità di sangue verrà svuotata durante il processo. Questo indica anche che l'afflusso di sangue alle estremità ileale è normale e non assicura ischemia durante la procedura di anastomosi ( Figura 1 G).
9. Individuare i mesenteries sul lato di entrambe le estremità ileale. Allineare i mesenteries e suturare le estremità ileale insieme usando 8-0 sutura ( Figura 1 G - H).
10. Sutura sul lato controlaterale dell'ileo per mantenere l'ileo anastomizzato in maniera naturale ( Figura 1 ho).
11. Suturare i lati superiori e inferiori tra le due suture originale a accuratamente unire le due ileale estremità insieme ( Figura 1, J).
12. Confermare che non esiste nessuna perdita dal sito anastomosi dopo aver terminato la procedura di suturazione di tre fasi ( Figura 1 G-io). Restituire l'intestino cieco e piccolo intestino nella cavità addominale nella posizione anatomica originale. Lavare l'area operata con soluzione fisiologica 0,9% caldo utilizzando un ago smussato. ( Figura 1 K).
13. Chiudere l'incisione dello strato muscolare addominale con sutura 6-0. Allineare l'incisione addominale pelle usando il forcipe e suturare la pelle addominale per facilitare la cicatrizzazione ottimale ( Figura 1 L).

3. Cure post-operatorie

topi

1. trasferimento post-chirurgia per un'unità di cure intensive per il recupero. Ospitarli in una gabbia di lettiera in carta su un rilievo di riscaldamento a temperatura controllata per continuare il recupero post-operatorio durante la notte. Topi con cibi morbidi, oltre al normale cibo e acqua di alimentazione.
2. Amministrare buprenorfina (0,05 - 0,1 mg/kg) con iniezione sottocutanea ogni 8-12 h per analgesia.
   Nota: Eutanasia topi di CO ₂ se gravemente malato.
3. Nel punto finale, sacrificare topi utilizzando overdosed isoflurano e raccolto campioni come necessario (sezione 4).

4. Valutazione di Overaccumulation di Bile indotta da Ileectomy

1. pesare e sezionare i topi un giorno dopo una resezione di 0% (falsità), 50% o 90% dell'ileo.
2. Rimuovere il tratto GI e pesarlo. Calcolare il peso di GI al rapporto di peso del corpo per valutare la severità di malassorbimento di sali biliari e overaccumulation.
3. Trasferire i tratti di GI in provette coniche da 15 mL e tagliarli in segmenti più brevi utilizzando le forbici. Dopo il taglio, centrifuga a 3.000 x g per 10 min. trasferire il surnatante (GI fluido contenente sali biliari) in una provetta pulita.
4. Misurare il volume totale e il peso del fluido di GI e calcolare il peso di fluido al rapporto di peso del tratto GI per valutare ulteriormente overaccumulation di bile nel tratto GI.
5. Determinare la quantità totale di bile nel surnatante dall'analisi degli acidi biliari, come descritto nel riferimento ⁸.

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Risultati

Le procedure per ileectomy sono illustrate nella Figura 1. Il primo passo include preparazione pelle addominale del topo, facendo un'incisione addominale e l'utilizzo di Divaricatori per esporre completamente l'intestino (Figura 1A-C). Successivamente, si trovava l'intestino cieco del mouse (Figura 1D); dato che la sua forma e dimensione lo rendono un punto di riferi...

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Discussione

Al fine di eseguire un ileectomy successo, arteria mesenterica superiore deve essere legato in anticipo per bloccare l'afflusso di sangue al segmento resecting. Il segmento ileale ischemico diventerà viola scuro dopo la legatura. Il segmento ileale quindi dovrà essere completamente resecato. Un rifornimento di anima normale deve essere garantito per le estremità mantenute. Questo è essenziale per evitare la rimozione impropria e sanguinamento, che può facilmente causare errori chirurgici a causa di necrosi ischemica...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection microscope	Olympus	SZ61	For surgery
Animal temperature controller	Physitemp Instruments, Inc.	TCAT-2LV	For body temperature control
Isoflurane anesthetic vaporizer	VetEquip	911104	For anesthesia
Dissection forceps	Fine Science Tools, Inc.	11274-20	For surgery
Scissors	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	For surgery
Needle holder	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7882	For surgery
Micro knives-needle blade	Fisher Scientific	10318-14	For surgery
6-0 monofilament suture	Ethicon	1698G	For abdominal skin closure
7-0 silk suture	Ethicon	766G	For ligation
8-0 monofilament suture	Ethicon	1714G	For anastomosis
Surgical sponges	Dynarex Corp.	3333	For surgery
Small cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-118	For surgery
Isoflurane	Piramal Healthcare Limited	66794-013-25	For anasthesia
Buprenorphine hydrochloride	Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals	12496-0757-1	For analgesia
0.9% sodium chloride Injection	B. Braun Medical Inc.	0264-7800-10	For washing/injection
Povidone iodine prep solution	Dynarex Corp.	1413	For skin preparation
Puralube vet ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38	For eye pretection
Hair remover lotion	Church & Dwight Co., Inc.		For skin preparation
Intensive care unit	ThermoCare	FW-1	For post-surgery recovery
DietGel recovery	ClearH2O	72-06-5022	For post-surgery recovery
Aurum total RNA fatty and fibrous tissue kit	Bio-Rad	7326830	For RNA isolation
iScript reverse transcription supermix for RT-qPCR	Bio-Rad	1708841	For reverse transcription assay
TaqMan fast advanced master mix	Applied Biosystems/Life Technologies	4444965	For QPCR analysis
Total bile acid assay kit	Genzyme Diagnostic	DZ042A-K01	For bile acid assay
C57BL/6J	The Jackson Laboratory