Évaluation de l’Invasion des cellules et le processus de Migration : une comparaison de la rayure axée sur le Microscope vidéo blessure test et le test de chambre de Boyden

Résumé

Cette étude rend compte de deux méthodes différentes pour l’analyse de l’invasion cellulaire et migration : le test de chambre de Boyden et l’essai in vitro vidéo axée sur le microscope cicatrisation avec. Les protocoles de ces deux expériences sont décrites, et leurs avantages et leurs inconvénients sont comparés.

Résumé

Les capacités d’invasion et de la migration des cellules tumorales sont les principaux contributeurs à la progression du cancer et de la récurrence. De nombreuses études ont exploré les capacités de migration et invasion de comprendre comment les cellules cancéreuses diffusent, dans le but de développer de nouvelles stratégies de traitement. Analyse des fondements cellulaires et moléculaires de ces capacités a conduit à la caractérisation de la mobilité de la cellule et les propriétés physico-chimiques du cytosquelette et microenvironnement cellulaire. Pendant de nombreuses années, le test de chambre de Boyden et le dosage zéro blessure ont été les techniques standards d’étudier la migration et l’invasion des cellules. Toutefois, ces deux techniques ont des limites. L’essai de chambre de Boyden est longue et difficile, et le dosage zéro blessure a faible reproductibilité. Développement des technologies modernes, notamment en microscopie, a augmenté la reproductibilité du dosage zéro blessure. À l’aide de systèmes d’analyse puissants, un microscope video de « en-incubateur » peut être utilisé pour fournir une analyse automatique et en temps réel de la migration cellulaire et l’invasion. L’objectif de cette communication est de déclarer et de comparer les deux essais utilisés pour étudier l’invasion cellulaire et migration : le dosage de chambre de Boyden et une optimisée en vitro vidéo axée sur le microscope scratch enroulés dosage.

Introduction

Migration et invasion des cellules sont impliqués dans la dissémination des cellules cancéreuses, qui est la principale cause de la résistance au traitement¹ et peuvent conduire à locorégional ou récidive métastatique après traitement de cancer². La transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) est le processus initial de la migration-invasion cellulaire dans lequel le cancer cellules passer d’un épithélium à un phénotype mésenchymateux. E-cadhérine est un marqueur extracellulaire du phénotype épithéliales³, et une expression accrue de la N-cadhérine et la vimentine est caractéristique du phénotype mésenchymateuses⁴. Migration dépend aussi de la capacité intrinsèque des cellules cancéreuses à envahir la matrice extracellulaire (ECM) sous l’action des métalloprotéases de matrice⁵.

Ce mécanisme d’invasion – migration a été décrite pour le cancer dans de nombreux endroits, notamment dans la tête et du cou, du cancer⁶. De nombreux chercheurs ont mis l’accent sur les processus de migration et invasion de mieux comprendre comment les cellules cancéreuses diffusent dans l’espoir que cette connaissance conduira à nouvelles stratégies de traitement. Il est crucial que ces études sont réalisées à l’aide de tests fiables et reproductibles.

L’analyse in vitro de la motilité cellulaire peut être difficile. Mis au point il y a de nombreuses années, le test de chambre de Boyden est considéré comme la norme pour l’invasion – migration analyse⁷. Cependant, il prend beaucoup de temps et est souvent inexacte. Un deuxième essai est la cicatrisation test⁸, qui consiste à faire une égratignure sur la culture cellulaire monocouche et capturer des images de l’invasion cellulaire et migration à intervalles de temps fixes. Cette technique a été largement critiquée en raison des grandes variations entre les résultats de deux tests successifs. Cependant, l’application des technologies modernes, notamment en microscopie, a amélioré la reproductibilité du dosage zéro blessure. Microscopes vidéo peuvent être facilement introduits en couveuse et peuvent générer des images en temps réel de la migration cellulaire. Ces appareils enregistrent des données microscopiques et fournissent une analyse automatique de confluence cellulaire plaie au fil du temps. Cet article vise à décrire le test de chambre de Boyden et le dosage optimisé plaie de grattage et de discuter les avantages et les faiblesses de chaque approche.

Protocole

Remarque : Les dosages de chambre et d’éraflure de Boyden sans inclusion de l’ECM sont appelés le test de migration, et les mêmes dosages avec l’ECM est dénommé le dosage de l’invasion.

1. Boyden chambre Assay

Remarque : Ce protocole est adapté pour la cellule SQ20B, qui est dérivé d’un cancer laryngé récurrent, tête et cou Squamous Cell Carcinoma (HNSCC) et a été obtenue de John Little (Boston, MA, USA).

Jour 1

1. Cellule de semis
   1. Graine 2 10⁶ SQ20B cellules dans 12 mL de milieu de culture (CM) dans une fiole de² 175 cm 72 h avant le premier jour et laisser les cellules à confluence de cellule de 80 %.
      1. Pour préparer les cellules SQ20B CM, Supplément le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de sérum de veau foetal (FCS), hydrocortisone 0,04 mg/mL, 100 U/mL de pénicilline et la streptomycine 0,1 g/L.
   2. Sous une hotte à flux laminaire, trypsinize les cellules. Enlever le milieu, laver les cellules avec stérile solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ajouter 2,5 mL de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (0,5 g/L) de la trypsine. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C et puis arrêter la réaction en ajoutant 12,5 mL de CM chauffé à 37 ° C. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
   3. Les semences des cellules dans une fiole de² 25 cm à une densité cellulaire des cellules⁵ 6 10 pour chaque condition à évaluer. Incuber les cellules pendant 24 h dans 3 mL de CM.

Jour 2

2. Famine de cellules et préparation des chambres à couché
   1. Affamer les cellules en remplaçant le milieu dans chaque fiole avec 3 mL de milieu de sérum basse-fœtal (SVF) à l’aide de 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) au lieu de FBS. Affamer les cellules pendant 24 h dans l’incubateur.
      1. Pour préparer la famine CM (s-CM), Supplément DMEM avec 0,1 % de BSA, hydrocortisone 0,04 mg/mL, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 0,1 g/L.
   2. Pour le test de migration, passez à l’étape 1.3.
   3. Pour le dosage de l’invasion, 12 h avant le jour 3, préparer les chambres Boyden couchés en ajoutant 500 μL de s-CM à chaque chambre couché. Utilisation préparés commercialement enduit Boyden chambers et les conserver à 4 ° C avant utilisation. Placer chaque chambre de Boyden dans la plaque de compagnon et mettez-le dans l’incubateur à 37 ° C pendant la nuit.

Jour 3

3. Cellule de semis dans la chambre de Boyden
   1. La plaque de compagnon permet de préparer le facteur chimiotactique. Remplir chaque puits de la plaque 24 puits compagnon avec 750 μl de milieu complet avec 10 % FBS, hydrocortisone 0,04 mg/mL, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 0,1 g/L.
      1. Adapter le facteur chimiotactique pour chaque ligne de la cellule et chaque condition de traitement. Pour préparer le facteur chimiotactique CM (ca-CM), Supplément DMEM avec 10 % FCS, hydrocortisone de 0,4 mg/mL, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 0,1 g/L.
   2. Transvaser la chambre supérieure dans la plaque de compagnon préremplie, en prenant soin d’éviter les bulles.
   3. Pour le dosage de l’invasion, retirez soigneusement 450 μL de CM dans chaque chambre de Boyden.
   4. Sous une hotte à flux laminaire, trypsinize les cellules. Enlever le milieu, laver les cellules avec du PBS stérile, ajouter 0,5 mL de trypsine EDTA (0,5 g/L) et puis incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C. Arrêter la réaction en ajoutant CM chauffé à 37 ° C. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
   5. Les semences 3 10⁴ SQ20B cellules de 500 μl de milieu de 0,1 % de BSA, donnant une dilution finale de 6 10⁴ cellules/mL.
      NOTE : Il convient d’adapter la concentration cellulaire de chaque lignée cellulaire.
   6. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C pendant 24 h.

Jour 4

4. Fixation de la cellule et coloration
   1. Fixer les cellules avant le temps de doublement spécifique à cette lignée de cellules. Difficulté SQ20B cellules avant 24h.
   2. Retirer chaque insert de la plaque de compagnon et retirer délicatement les cellules de la chambre haute à l’aide d’un coton-tige. Il est particulièrement important d’éliminer toutes les cellules situées dans la chambre haute.
   3. Difficulté et colorer chaque insert individuellement pour obtenir mai-Grunwald Giemsa coloration⁹ à l’aide de la trousse de coloration fournie. Alternativement, utilisez paraformaldéhyde à 4 % dans une autre plaque de compagnon pour une fixation de 30 min.
   4. Garder les insertions dans une assiette vide 24 puits compagnon sous une hotte de laboratoire à sécher chaque chambre.

Jour 5

5. Analyse au microscope
   1. Insérer la plaque de compagnon avec les inserts sur un microscope à contraste de phase 20 et compter chaque cellule migré sur la partie inférieure de la membrane. Optimiser la position de foyer droite en déplaçant l’objectif du bas vers le haut et la position de cuisson sur la partie inférieure de la membrane.
   2. Calculer le ratio entre le nombre de cellules migrés et cellules ensemencées. Répétez chaque chef d’accusation pour chaque condition de traitement en trois exemplaires.

2. zéro blessure Assay : La Migration cellulaire

Remarque : Les Instructions doivent être adaptées pour chaque type de cellule.

Jour 1

1. Cellule de semis
   1. Graine 2 x 10⁶ SQ20B cellules dans 12 mL de CM dans une fiole de² 175 cm 72 h avant le premier jour et laisser les cellules à confluence de cellule de 80 %.
   2. Sous une hotte à flux laminaire, trypsinize les cellules. Enlever le milieu, laver les cellules avec du PBS stérile, ajouter 2,5 mL de trypsine EDTA (0,5 g/L) et incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C. Arrêter la réaction en ajoutant 12,5 mL de CM chauffé à 37 ° C. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
   3. Générer un échantillon dilué à une densité de 4 x 105/ml, ce qui donne une densité finale de 4 10⁴ cellules par 100 μl à chaque puits. Cette concentration doit être adaptée pour chaque lignée cellulaire et devrait être de l’ordre de 1 x 10⁴ 6 10⁴ cellules.
   4. Cellules de semences dans chaque puits d’une plaque 96 puits de dépôt 100 μL de la solution préparée à l’étape 2.1.2.
   5. Laisser la plaque à température ambiante pendant 5 min disperser les cellules uniformément sur le fond des puits.
   6. Placer la plaque dans l’incubateur et de permettre aux cellules d’adhérer à la plaque pour 12 à 16 h (maximum) à 37 ° C.

Jour 2

2. Gratter la plaie dosage
   1. Enlever les plaques préparées à l’étape 2.1 de l’incubateur.
   2. Sous le capot, faire une blessure en utilisant le dispositif commercial blessant selon le protocole du fabricant.
   3. Retirez immédiatement le milieu de chaque bien en utilisant une pipette avec une pointe conique adaptée, en prenant soin de ne pas pour toucher la plaie.
   4. Laver les cellules deux fois en répétant l’aspiration en utilisant 100 μL de CM chauffé à 37 ° C pour chaque puits.
   5. Enlevez le CM à l’aide d’une pipette avec une pointe conique adaptée après les étapes de lavage.
   6. Ajouter 100 μl de milieu spécifique pour chaque condition de traitement dans chaque puits.
   7. Essayez d’éviter de créer des bulles dans les puits. Une technique de pipetage inverse peut être utile ici. Vous pouvez également enlever les bulles avec une aiguille de seringue.
   8. Placer la plaque dans le rack adapté du microscope vidéo.
   9. Afin d’améliorer la qualité de l’image, laissez la plaque au chaud pendant au moins 15 minutes avant que le premier balayage pour éviter la condensation sur la face inférieure de la plaque.
   10. Programme de la planification des analyses, en utilisant le logiciel de vidéo microscope à une seule image par puits. Il faut un intervalle de 2 h maximum pour une expérience de l’immigration-invasion. Si l’objectif de l’expérience est de produire une vidéo, un intervalle de 30 min maximum est préféré.
   11. À la fin de l’expérience, laver l’appareil blessant soigneusement et suivre chacune des quatre étapes de lavage indiquées par le fabricant.

Jours 3, 4 et 5

3. Analyse de la migration à l’aide du microscope vidéo
   1. Pour un minimum de 24 h et jusqu'à 5 jours, surveiller et vérifier la migration cellulaire.
   2. Un masque de cellule approprié adapté pour chaque type de cellule permet d’analyser la migration cellulaire. Pour obtenir un masque cellulaire adapté pour chaque lignée cellulaire, générer une cellule traitement définition tirée du logiciel à l’aide d’une collection d’images de cellules spécifiques.
   3. Tracer les courbes et exporter les données dans une feuille de calcul, qui peut être utilisé pour analyser et comparer les résultats.

3. zéro blessure Assay : Invasion des cellules

Remarque : Les Instructions doivent être adaptées pour chaque type de cellule.

Jour 1

1. Cellule de semis
   1. Utiliser le même protocole pour cellule semis comme indiqué au point 2.1.

Jour 2

2. Préparation de l’ECM
   1. Décongeler la matrice pendant au moins 12 h avant de l’utiliser à 4 ° C. S’assurer qu’aucun agrégat n’est visibles. Si les agrégats sont visibles, garder la matrice à 4 ° C pendant une période prolongée jusqu'à disparaissent des agrégats. Garder la matrice sur la glace. Utiliser des pointes de pipette jetable.
      Remarque : La matrice consolidera sinon conservés à 4 ° C.
   2. Faites refroidir les tubes de microcentrifuge sur glace pendant 5 min.
   3. Prenez CM refroidi à 4 ° C du réfrigérateur et diluer la matrice dans les tubes de microcentrifuge rafraîchies pour obtenir une concentration finale de 300 μg/mL.
   4. Retourner les tubes de microcentrifuge avec matrice calibrant au réfrigérateur à 4 ° C.
      Remarque : Une grille adaptée pour les tubes de microcentrifuge est utile pour maintenir les tubes à 4° C tout au long de l’expérience.

Jour 2

3. Dosage zéro blessure et le traitement de l’ECM
   1. Retirez la plaque préparée à l’étape 3.1 de l’incubateur.
   2. Sous le capot, faites la plaie en utilisant le dispositif commercial blessant selon le protocole du fabricant.
   3. Retirez immédiatement le milieu de chaque bien en utilisant une pipette avec une pointe conique adaptée prenant soin de ne pas pour toucher la plaie.
   4. Laver les cellules deux fois en répétant la procédure d’aspiration en utilisant 100 μL de CM chauffé à 37 ° C.
   5. Après le deuxième lavage, placer la plaque sur l’incubateur de 4 ° C à équilibrer sa température pendant 5 min.
   6. Enlever le milieu froid de chaque puits avec la pipette d’aspiration avec une pointe conique, en prenant soin de Pipetter soigneusement le bord et pour éviter de toucher la plaie.
   7. Ajouter 50 μL de matrice pré-dilué dans chaque puits à l’aide de pointes coniques rafraîchies à 4 ° C.
   8. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C pendant 30 min.
      Remarque : Une grille de soutien préchauffée à 37 ° C est utile pour accélérer le réchauffement de la plaque à 96 puits.
   9. Retirez la plaque de l’incubateur et ajouter 100 μL de la CM adaptée à chaque puits comme il est indiqué pour chaque condition de traitement.
   10. Essayez d’éviter de créer des bulles dans les puits. Une technique de pipetage inverse peut être utile ici. Vous pouvez également enlever les bulles avec une aiguille de seringue.
   11. Placer la plaque dans le rack adapté dans le microscope vidéo.
   12. Afin d’améliorer la qualité de l’image, laissez la plaque au chaud pendant au moins 15 minutes avant que le premier balayage pour éviter la condensation sur la face inférieure de la plaque.
   13. Programmer l’horaire de numérisations, utilisant le logiciel de vidéo microscope à une seule image par puits, dans le mode de balayage Scratch enroulés. Un intervalle de 2 h maximum dans requis pour une expérience de l’immigration-invasion. Si l’objectif de l’expérience est de produire une vidéo, un intervalle de 30 min maximum est préféré.
   14. À la fin de l’expérience, laver l’appareil blessant soigneusement et suivre chacune des quatre étapes de lavage indiquées par le fabricant.

Jours 3, 4 et 5

4. Analyse d’invasion des cellules à l’aide d’un microscope vidéo.
   1. Répétez l’étape 2.3.

Résultats

Nous présentons ici deux méthodes différentes pour analyser les migrations et l’invasion des cellules. La figure 1 montre la Boyden expérience en chambre. Les inserts sont placées dans une assiette de compagnon avec chemoattractant moyen, et les cellules sont ensemencées en CM. La membrane peut être non couchée (test de migration) ou couché (dosage de l’invasion). Les cellules sont ensemencées dans la chambre haute en s-CM. La chambre basse est ...

Discussion

Nous rapportons deux modalités différentes d’étudier le processus d’invasion et de la migration des cellules. L’analyse de ce processus est importante pour comprendre les facteurs de récidive métastatique, qui pourrait s’expliquer par la motilité accrue d’une sous-population de cellules cancéreuses appelé cancer cellules souches^10,11.

L’expérience de chambre de Boyden est celle utilisée le plus souvent invasion et...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Calf Serum Gold	GE Healthcare	A15-151
Hydrocortisone water soluble	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Z1 coulter particle	Beckman Coulter	6605698
Optical microscope	Olympus	CKX31
SQ20B cell line	Gift from the John Little’s Laboratory	-
Wound Maker	Essen Bioscience	4494	Store in safe and dry place
96-well ImageLock Plate	Essen Bioscience	4379
CoolBox 96F System with CoolSink 96F	Essen Bioscience	1500-0078-A00
CoolBox with M30 System	Essen Bioscience	1500-0078-A00
Boyden Insert	Dominique Dutcher	353097
Boyden Coated Insert	Dominique Dutcher	354483	Store at -20 °C
Companion 24-well Plate	Dominique Dutcher	353504
BD Matrigel standard	BD BioScience	BD 354234	Store at -20°C.
RAL 555 Staining Kit	RAL Diagnostics	361550	Store in safe and dry place
Microcentrifuge tubes	Eppendorf	33511