Établir des modèles de souris pour troubles neurologiques Zika Viro-induite à l’aide de stratégies d’Injection intracérébrale : embryonnaires, néonatals et adultes

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour établir un modèle de Zika Viro-induite microcéphalie chez la souris. Ce protocole inclut des méthodes pour l’inoculation intracérébrale embryonnaire, néonatale et adulte-stade du virus Zika.

Résumé

Le virus Zika (ZIKV) est un flavivirus actuellement endémique dans le Nord, centrale et l’Amérique du Sud. Il est maintenant établi que le ZIKV peut entraîner une microcéphalie et des anomalies cérébrales supplémentaires. Toutefois, le mécanisme sous-jacent à la pathogenèse de ZIKV dans le cerveau en développement reste peu clair. Les méthodes chirurgicales intracérébrales sont fréquemment utilisés dans la recherche en neurosciences pour répondre aux questions sur le développement cérébral normal et anormal et le fonctionnement du cerveau. Ce protocole utilise des techniques chirurgicales classiques et décrit des méthodes qui permettent de maladie neurologique humaine du ZIKV-associés-modèle dans le système nerveux de la souris. Alors que l’inoculation directe cerveau ne modélise pas le mode normal de transmission du virus, la méthode permet aux enquêteurs à poser des questions ciblées sur la conséquence après infection de ZIKV du cerveau en développement. Ce protocole décrit des stades embryonnaires, néonatals et adultes d’inoculation intraventriculaire de ZIKV. Une fois maîtrisé, cette méthode peut devenir une technique simple et reproductible qui ne prend que quelques heures à effectuer.

Introduction

Microcéphalie est un état résultant de l’évolution de cerveau défectueux caractérisée par plus petit que la taille moyenne de la tête chez le nouveau-né. Enfants avec microcéphalie présentent une série de symptômes qui peuvent comprendre un retard de développement, saisie, déficience intellectuelle, surdité, troubles de la vue et problèmes avec le mouvement et l’équilibre, entre autres, selon la gravité de la maladie et causer^1,2,3. Cette condition est multifactorielle dans la nature, avec agent génétique, infectieux et des facteurs environnementaux liés aux provoquant une microcéphalie^{4,5,6,7,8, 9}. Avant le déclenchement de 2015-2016 ZIKV, 8 enfants sur 10 000 naissances ont été diagnostiqués avec microcéphalie aux États-Unis selon le CDC¹⁰. Sur Février 1^st de 2016, l’Organisation mondiale de la santé a déclaré le virus Zika un enjeu de santé publique d’urgence de l’International en raison de l’augmentation alarmante des diagnostics de microcéphalie associée à une infection ZIKV mères^{11, 12}. Une étude récente de la CDC sur les cas ZIKV aux États-Unis suggère que la maternelle ZIKV infection entraîne un risque 20 fois pour un enfant de développer une microcéphalie par rapport aux personnes non infectées et 4 % de mères ZIKV infecté des USA ont donné lieu à enfants avec microcéphalie¹¹. Le taux d’anomalies congénitales associées à une microcéphalie pendant la grossesse de l’infection de ZIKV au Brésil ont été signalés ont touché jusqu'à 17 % des bébés de mères infectées, ce qui indique qu’en Amérique latine des autres facteurs peuvent contribuer à l’augmentation du risque ¹³. alors que nous savons que le ZIKV peut entraîner une microcéphalie et pathogenèse progénitrices neurales cellulaire (NPC) population^7,8,14, la pathogenèse complete de ZIKV dans le développement du cerveau reste insaisissable. Il est important de développer des modèles animaux afin d’étudier les mécanismes de la maladie qui sous-tendent les anomalies du cerveau associées à une infection ZIKV.

Etudier directement l’effet de la ZIKV sur le développement du cerveau, nous avons tout d’abord développé un modèle de souris à l’aide de l’inoculation intracérébrale du cerveau (E14.5) 14,5 de jour embryonnaire avec ZIKV⁷. Ce stade a été choisi car il est considéré comme représentant de la fin du premier trimestre de la gestation humaine¹⁴. Chiots peuvent survivre jusqu'à jour après la naissance 5 (P5) avec cette méthode d’injection intracérébrale embryonnaire (~ 1 µL de 1,7 x 10⁶ vitroplants dose infectieuse (TCID50/mL)). Ces chiots postnatals présentent une gamme des phénotypes de même chez les nourrissons humains infectés y compris les ventricules, perte neuronale, raréfaction axonale, astrogliosis et microglial activation^12,15. Un cerveau de souris nouveau-né est relativement immature, proche du stade de développement du cerveau humain au milieu de la gestation,¹⁶, et développement de cerveau de souris comprend une composante majeure de postnatale. Afin d’étudier plus tard infections stade de gestation, une méthode d’infection postnatale est également décrite. Les nouveau-nés infectés par ZIKV au P1 sont capables de survivre jusqu'à à 13 jours après injection. Infection de sang-né un stade adulte a été décrit chez la souris auparavant¹⁷ mais nécessite l’utilisation de facteurs de la transcription de facteur régulateur (IRF) de l’interféron (IFN) IRF-3, -5, souche triple-7. Ce protocole décrit une méthode d’inoculation ZIKV intraventriculaire pour contourner la désactivation de la réponse antivirale du modèle murin chez l’adulte. Alors que cela contourne le système immunitaire murin, cette voie d’injection n’imite pas directement la voie typique d’infection. Pour résoudre cette divergence, l’expérimentateur peut exécuter directement une infection intra-utérine de ZIKV au lieu de la voie intracrânienne. Adopté du précédent travail¹⁸, nous avons décrit brièvement cette technique dans le présent protocole embryonnaire de l’infection.

Les souches de virus Zika mis en oeuvre avec cette technique sont l’isolat mexicain MEX1-44^7,19 et l’africain isoler M.-766, isolé en 1947²⁰. Zika MEX1-44 a été isolé au Chiapas, au Mexique en janvier de 2016 d’un infecté Aedes aegypti moustique. Nous avons obtenu ce virus avec la permission par le biais de l’University of Texas Medical Branch à Galveston (UTMB). En outre, le sérotype de virus de la Dengue 2 (DENV2) a été inoculé à l’aide de cette technique dans une étude de comparaison. DENV2, souche S16803 (séquence GenBank GU289914), a été isolé dans un échantillon de patient de Thaïlande en 1974 et repiquées dans les cellules C6/36. Le virus a été repiquée deux fois dans les cellules Vero par le centre de référence mondial pour virus émergents et les arbovirus (WRCEVA) avant les injections de souris. Cela démontre que cette technique fonctionne aussi bien pour les diverses souches de ZIKV et autres flavivirus qui peuvent avoir un impact sur le développement du cerveau.

Protocole

Tous les animaux utilisent protocoles suivre les directives de protection des animaux de l’Université de Californie du Sud et de l’Université de Georgie. Méthodes d’euthanasie pour les mères enceintes et les adultes sont effectuées selon les protocoles approuvés : asphyxie de dioxyde de carbone, suivie d’une dislocation cervicale comme méthode secondaire afin d’assurer l’euthanasie. Les chiots nouveau-nés sont euthanasiés par décapitation.

ATTENTION : Le protocole suivant consiste à manipuler un virus pathogène. Les précautions appropriées doivent être prises lors de la manipulation du virus. Tous les protocoles doivent être approuvés par l’accord préalable du Comité institutionnel approprié à utiliser.

1. embryonnaire Inoculation intracérébrale du Virus Zika

1. Pour enfichage enceintes chronométré, envisager de midi le jour après l’accouplement comme E0.5. Appariement des souris à la fin de la journée et vérifier les fiches tôt le matin afin de réduire la variabilité du temps de l’accouplement.
2. Préparer l’aiguille de verre avant la chirurgie. Tirez l’aiguille coupée à 1/3 de sa longueur, puis affiner à un angle de 45° à l’aide d’un broyeur d’une micropipette avec une goutte d’eau jusqu'à ce que le pore est dimensionné pour 50-70 µm. cocher aiguille les embouts sous un stéréoscope pour la qualité et de la rupture.
3. Gardez le virus aliquote sur la glace. Juste avant la chirurgie, charger le mélange d’injection de ZIKV dans l’aiguille d’injection de verre préparés. Assembler la seringue d’injection étanche (volume de 50 µL), luer-lock et tubes et saturer la seringue Assemblée avec le tube avec de l’huile minérale. Une fois saturés, fixer l’aiguille et tirer ~ 6-7 µL ZIKV dans l’aiguille (~ 1 µL est 1,7 × 10⁶ TCID50/mL).
4. Injecter des enceintes C57BL/6J ou 129S1/SvImJ souris avec des embryons E14.5 jour embryonnaire (pour injection intracrânienne) ou des embryons de E10.5 (pour injection intra-utérine) avec le chlorhydrate de kétamine (80-100 mg/kg) et de xylazine (5-10 mg/kg) diluée dans une solution saline stérile par voie intrapéritonéale pour induire l’anesthésie chez la mère. Alternativement, anesthésier les mères à l’isoflurane surveillé isoflurane fournie par inhalation, avec récupération d’effluents gazeux, le cas échéant. Injecter la buprénorphine-SR (0.5-1.0mg/kg) par voie sous-cutanée pour induire une analgésie.
5. Test du pincement anesthésiés mères sur le bout de l’orteil ou la queue et puis disposez-les en position couchée sur un bloc de chauffage approuvé par animal (pad thermique de 100 x 200 2. 5 mm). La pince de pincée d’orteil n’est pas stérile et ne servent pas à manipuler le tissu en chirurgie. Alternativement, mains gantées peuvent servir à tester le réflexe de retrait orteil pincée.
   Remarque : Reportez-vous à votre personnel vétérinaire institutionnel pour la périopératoire préféré méthode de chauffage. Une couverture a été placée entre ce coussin chauffant et l’animal.
6. Ajouter pommade ophtalmique pour les yeux.
7. Raser la surface de l’abdomen et stériliser avec l’iode et d’alcool trois fois. Alterner les lingettes d’iode et d’alcool ; essuyer dans un mouvement circulaire en dehors du site chirurgical.
8. Drapé de la peau qui entoure le site de la chirurgie avec des chiffons stériles pour éviter la contamination de l’incision et les instruments.
   Remarque : L’ouverture de la draperie ne doit pas être plus grand que le site chirurgical préparé ; aucun cheveux ne doivent être considérés dans l’ouverture de la draperie.
9. Pincer la peau de la mère de son abdomen avec une pince et couper le bas de l’abdomen dans une ligne de 1 à 1,5 cm sur la ligne sagittale médiane avec des ciseaux chirurgicaux stériles. Cette coupe dans la peau et plus loin dans la cavité abdominale afin que les embryons sont maintenant exposés.
   NOTE : Les ciseaux chirurgicaux est utilisés pour inciser la peau et la couche péritonéale. Gants et instruments stériles sont utilisés pour chaque intervention chirurgicale.
10. Couper une fente au milieu d’une petite gaze stérile et appliquer sur le dessus de l’ouverture chirurgicale. Hydrater avec du sérum physiologique stérile. Tirez sur les embryons à travers la fente pour se reposer sur la gaze stérile, avec soin pour n'enlever pas plus de 4-5 embryons, en se concentrant sur une corne utérine en même temps.
11. Hydrater les embryons avec une solution saline stérile avant et tout au long de l’inoculation pour s’assurer qu’ils ne s’assèchent pas. Garder une trace de dont les embryons sont injectés et leur position dans la corne utérine. Embryons individuels sont donc considérés comme des expériences distinctes, que les embryons ne changent pas de position tout en développant dans l’utérus. (Passez à l’étape de 1,15 pour injection intra-utérine).
12. Placez délicatement une spatule sous la tête de l’embryon. Éclairer les embryons bien avec une lampe de visualiser les sutures de la tête et le crâne.
    Remarque : Une technique aseptique est suivie, y compris des instruments et des gants chirurgicaux stériles. Après des éléments non stériles (comme la lampe) sont manipulées, gants devraient être remplacés par nouveaux gants stériles avant de manipuler des instruments stériles et zones.
13. Position de la tête en manipulant l’embryon avec la lampe (derrière la tête pour une visibilité) et doigts libres jusqu'à ce que la tête de l’embryon est remontée directement contre la paroi de l’utérus et maintenue en place avec la main non dominante.
    NOTE : Positionnement de l’embryon est une partie essentielle et la technique qui prend la plupart de la pratique. Trop forte pression du doigt peut endommager les membranes embryonnaires conduisant à la détermination de la létalité et pas assez de pression risquent de compliquer l’injection.
14. Utiliser les vaisseaux sanguins, le long de la suture du crâne comme guide. Injecter le virus ZIKV (~ 1 µL, 1,7 × 10⁶ MEX1 isolat mexicain TCID50/mL-44) dans les ventricules latéraux du cerveau embryonnaire E14.5 avec l’assemblé seringue et une aiguille. Utiliser les fluides comme une injection simulée.
15. Pour améliorer la rétention de la grossesse, éviter l’injection virale de deux embryons à côté les ovaires et les deux embryons à côté le vagin supérieur (Figure 1 a). Dans l’ensemble, pas plus de 6 embryons sont injectées par portée pour réduire le temps de la chirurgie et de prévenir la perte de l’embryon.
16. Remettre les embryons injectés dans les mères enceintes et remplir la cavité abdominale avec ~ 0,5 mL de solution saline stérile. Pour fermer, de suture tout d’abord les deux le muscle péritonéal abdominal et puis ensuite suturer la couche externe de la peau avec 4,0 sutures stériles. Il est préférable d’utiliser des sutures interrompus ; Il y a possibilité de déhiscence de la plaie si la souris mâche la suture.
17. Placez votre souris dans une cage partiellement reposant sur un coussin chauffant pour permettre à la souris échapper à un espace non chauffé si nécessaire. Surveiller les mères qu’ils se rétablissent (1-2 h) de l’anesthésie. Développer les embryons après que chirurgie pour variait selon les expériences individuelles.
18. Injection intra-utérine
    1. Avec une corne utérine et embryons exposés, utiliser une aiguille de seringue et 27G de 1 mL pour injecter des virus de Zika 100 μL (10⁶ TCID₅₀ unités en suspension dans 100 μL DMEM), ou fluide, dans l’espace intra-utérin ou dans le tissu placentaire. Notez quelles les embryons ont été injectés pour les dissections de stade embryonnaire. Voir les travaux déjà publié pour plus de détails¹⁸.
    2. Remettre les embryons injectés dans les mères enceintes et remplir la cavité abdominale avec ~ 0,5 mL de solution saline stérile. Pour fermer, tout d’abord de suture du muscle péritonéal abdominal et puis ensuite suturer la couche externe de la peau avec 4,0 sutures stériles. Il est préférable d’utiliser des sutures interrompus ; Il y a possibilité de déhiscence de la plaie si la souris mâche la suture.
    3. Placez votre souris dans une cage partiellement reposant sur un coussin chauffant pour permettre à la souris échapper à un espace non chauffé si nécessaire. Surveiller les mères qu’ils se rétablissent (1-2 h) de l’anesthésie. Développer les embryons après que chirurgie pour variait selon les expériences individuelles.

2. néonatale Inoculation intracérébrale du Virus Zika : P0/P1

1. Veiller à ce que les seringues d’injection étanche (volume de 10 µL) et les aiguilles ne sont pas bouchés. Nettoyer et examiner en chargeant trois seringues de 20 mL avec des aiguilles de calibre 26 : l’un avec du sérum physiologique, un éthanol à 70 % et un avec de l’air pour dégager des solutions. Stériliser avec eau de Javel 10 % si déjà utilisé pour l’injection de virus.
2. Gardez le virus sur la glace. Charger la seringue en la remplissant avec du sérum physiologique afin de réduire le volume mort dans la seringue et dessiner 0,75 µL de l’air pour séparer le matériel d’injection de la solution saline.
3. Créer une chambre de récupération humidifié chauffée pour les petits injectées. À l’aide d’un bloc de chauffage, placer un récipient à fermeture (par exemple, une boîte vide de pointe) avec une gaze stérile et humecter avec du sérum physiologique. Préchauffer avant de commencer les injections.
4. Mettre en place le microinjector y compris la pompe et le contrôleur. Déterminer le code de type de périphérique pour la seringue spécifique (c.-à-d.pour une seringue de 10 µL, le type de périphérique est « D »). Déterminer la vitesse d’injection.
5. Recueillir les chiots de jour après la naissance, 0 ou 1 (P1/P0) près de l’installation chirurgicale. Charger la seringue d’injection avec le virus. Désinfecter le chiot tête de montage avec 70 % EtOH.
6. Envelopper les chiots dans une mince couche de gaze et enterrer complètement dans la glace d’atteindre un État anesthésique. Chiots sont cryoanesthetized pendant 5 min. veiller à ce que les chiots sont suffisamment anesthésiés pour injection en effectuant une pincée de queue/orteil sans réponse. Cela donne à peu près 15 min d’un État anesthésique.
7. Placez le chiot sur la tête de montage, stériliser la surface de la tête avec l’iode et l’éthanol (trois fois) et puis essuyer avec une lingette stérile (isopropanol ou 70 % EtOH).
8. Marquer lambda avec un marqueur noir et d’enregistrer les coordonnées à lambda à l’aide de l’instrument stéréotaxique. Mesure la distance entre lambda et le bord de le œil et le début des coordonnées stéréotaxiques de lambda calcul de la distance de 2/5 de lambda à l’oeil (pour les deux hémisphères si vous s’injectent les deux).
9. Re-vérifier la profondeur anesthésique avant de créer un trou pour le site d’injection. Utiliser une aiguille de calibre 26 pour soigneusement et superficiellement perforer le cuir chevelu et le crâne à l’endroit de l’injection (le crâne est très mou chez les nouveau-nés) pour créer une ouverture pour l’aiguille d’injection.
10. Piquez l’aiguille d’injection dans l’endroit percé et une fois que l’aiguille a juste manqué la peau, calculer une profondeur de 1 mm pour le site d’injection (ventricule latéral) à l’aide de l’instrument stéréotaxique.
11. Une fois que l’aiguille descend à la profondeur de l’injection, la microinjector d’injecter de programme : 1 µL de virus, à un taux de 10 nL/s, en injectant environ 1 µL plus 1,5 min (~ 1 μl 3.4 x 10⁵ TCID50/mL ZIKV).
12. Lorsque l’injection terminée, attendre 30 s et retirer l’aiguille en incréments de 0,5 mm en tournant la vis (sur le dos), attendre 30 s après chaque incrément.
    Remarque : Ceci réduit la fuite du virus injecté.
13. Une fois enlevé, soit charger rapidement l’aiguille et la seringue avec davantage de virus (différents virus ou fausses contrôles doivent être chargés dans des seringues/aiguilles séparées) ou retirer le chiot de la tête de montage à la chambre humidifiée préchauffée. Surveiller le chiot toutes les quelques minutes pour jauger la récupération. Remplacer les chiots avec sa litière.

3. adulte Inoculation intracérébrale du Virus Zika

1. Injecter à des souris adultes par voie intrapéritonéale avec le chlorhydrate de kétamine (80-100 mg/kg) et de xylazine (5-10 mg/kg) diluées dans du sérum physiologique stérile pour induire l’anesthésie. Injecter la buprénorphine-SR (0.5-1.0mg/kg) par voie sous-cutanée pour induire une analgésie. TEP/queue pincer la souris pour s’assurer de son état d’anesthésie et par la suite monter sur l’instrument stéréotaxique (avec un coussin chauffant) pour immobiliser la tête au cours de la chirurgie.
2. Pommade ophtalmique s’ajoute les yeux pour éviter que les yeux de la souris se dessèchent pendant la chirurgie. Raser le cuir chevelu à partir derrière les yeux vers le début des oreilles. Stériliser la peau exposée avec iode et 70 % EtOH trois fois. Alterner les lingettes d’iode et d’alcool ; essuyer dans un mouvement circulaire en dehors du site chirurgical.
3. Re-vérifier la profondeur anesthésique avant l’incision de la peau. À l’aide d’un scalpel, faire une incision de 0,5 cm le long de la ligne sagittale médiane de la tête à l’endroit stérilisé, exposant bregma. À l’aide d’un mouvement de roulis avec un coton-tige, dégager la surface du crâne des tissus méningés, tout en poussant simultanément la peau loin des sites d’injection.
4. A partir de bregma, alignez le foret chirurgicale et identifier les sites d’injection en utilisant les coordonnées suivantes : AP-0,50 mm, ML : +/-1,5 mm. à l’aide de la pédale de contrôle, percer le crâne lentement quant à percer seulement OS jusqu'à ce qu’un trou a été autorisé pour l’aiguille.
5. Remplacer la perceuse avec la pompe de microinjector et la seringue étanche (volume de 10 µL) sur le stéréotaxiques. Laissant une bulle d’air petit entre le virus et la solution saline, dessiner ~ 4-5 µL de virus. Déterminer le code de type de périphérique pour le volume de la seringue spécifique (c’est à dire, D pour seringue de volume 10 μL). Piquez l’aiguille à DV :-1,50 mm de la surface du cerveau. Pour injecter 1 µL de virus, programmer un taux de 10 nL/s, en injectant environ 1 µL plus 1,5 min.
6. Lorsque l’injection terminée, attendre 30 s et retirer l’aiguille en incréments de 0,5 mm, attendre 30 s après chaque tour. Cela réduit les reflux et la fuite du virus injecté.
7. Lors de l’administré est finis, utiliser des pinces pour détacher la peau et pour récupérer le crâne exposé. Suture le cuir chevelu en arrière à l’aide de 4,0 sutures et retirer la souris de l’instrument stéréotaxique. Place la souris dans une cage partiellement reposant sur un coussin chauffant pour permettre à la souris échapper à un espace non chauffé si nécessaire et de contrôler qu’ils se rétablissent (1-2 h) de l’anesthésie.

Résultats

Images représentatives de nos méthodes d’injection pour l’inoculation de la ZIKV du cerveau embryonnaire sont affichés dans les diagrammes illustrant les injections intracérébrales (Figure 1 a) et intra-utérine et des injections d’intraplacental (Figure 1 b), illustrant la passant le barrage enceinte et embryons doivent être lus et orientés pour la chirurgie (protocole embryonnaire inoculation).

Discussion

Décrite ici est une méthode pour l’inoculation intracérébrale de la ZIKV à des stades embryonnaires, néonatals et adultes d’enquête sur les dommages induits par ZIKV dans le développement du cerveau. Bien que simple, il y a quelques considérations que les enquêteurs devraient prendre pour assurer la qualité de l’étude et la sécurité des personnes impliquées.

Ministère de l’environnement est étroitement liée à ZIKV du genre flavivirus. Ministère de l’environnement ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor	Leica	39416001
Mouse Stereotax	Kopf	04557R
Micro4 Microsyringe Pump Controller	WPI	SYS-MICRO4
UMP3 UltraMicroPump	WPI	UMP3
Modulamp	Schott	-
Luer-lock tubing (19-gauge)	Hamilton	90619
Melting Point Capillary	Kimble	34500-99	Glass needle
Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres	Thermo Scientific	R25	No dilution; Use for practice injections
10 µL, Model 1701 LT SYR	Hamilton	80001	for embryonic inoculation
10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2	Hamilton	80030	for neonate/adult
4-0 Ethilon Nylon Sutures	Ethicon	-
Mineral Oil	VWR	-
micropipette puller	Sutter Instruments	P-1000
Micropipette Grinder	Narishige	EG-44
Fastgreen FCF Dye	Sigma	F7252	inject with 0.5% Dye
Antibodies
Flavivirus group antigen antibody	Millipore	MAB10216	ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3)
Pax6	DBHB	Pax6-s	ms IgG1 1:20