Estabelecer modelos de Mouse para doenças neurológicas induzida por vírus Zika usando estratégias de injeção Intracerebral: embrionárias, Neonatal e adulto

Resumo

Aqui nós descrevemos um método para estabelecer um modelo de Zika a microcefalia induzida por vírus no mouse. Este protocolo inclui métodos para inoculação intracerebral embrionária, neonatal e adulto-fase do vírus Zika.

Resumo

O vírus Zika (ZIKV) é um flavivirus atualmente endêmica na América do Sul, Central e do Norte. Agora está estabelecido que o ZIKV pode causar microcefalia e anormalidades cerebrais adicionais. No entanto, o mecanismo subjacente a patogênese da ZIKV no cérebro em desenvolvimento permanece obscuro. Intracerebrais métodos cirúrgicos são frequentemente usados em pesquisas de neurociência para responder a perguntas sobre o desenvolvimento normal e anormal do cérebro e a função cerebral. Este protocolo utiliza técnicas cirúrgicas clássicas e descreve os métodos que permitem que um modelo associado a ZIKV humana doença neurológica no sistema nervoso do rato. Enquanto inoculação direta do cérebro não modelar o modo normal de transmissão do vírus, o método permite que os investigadores perguntas específicas relativas a consequência após infecção ZIKV do cérebro em desenvolvimento. Este protocolo descreve estágios embrionários, Neonatais e adultos de inoculação intraventricular de ZIKV. Uma vez dominado, este método pode tornar-se uma técnica simples e reprodutível que leva apenas algumas horas para executar.

Introdução

Microcefalia é uma condição resultante do desenvolvimento do cérebro defeituoso caracterizado por menor do que o tamanho médio da cabeça em recém-nascidos. Crianças com microcefalia apresentam uma gama de sintomas que podem incluir atraso de desenvolvimento, convulsões, deficiência intelectual, perda de audição, problemas de visão e problemas com movimento e equilíbrio, entre outros, dependendo da gravidade da doença e causa a^1,2,3. Esta condição é multifatorial na natureza, com o agente infeccioso, genética e fatores ambientais relacionados ao causar microcefalia^{4,5,6,7,8, 9}. Antes da eclosão de 2015-2016 ZIKV, 8 crianças fora do 10.000 nascimentos foram diagnosticadas com microcefalia nos Estados Unidos de acordo com o CDC¹⁰. 1 de fevereiro no^st de 2016, a Organização Mundial de saúde declarou o vírus Zika uma emergência de saúde pública internacional preocupação devido ao aumento alarmante no diagnóstico de microcefalia associada com infecção ZIKV em mães^{11, 12}. Um estudo recente do CDC em casos ZIKV nos Estados Unidos sugere que resultados de infecção maternos ZIKV em um 20-fold aumento do risco de uma criança desenvolver microcefalia em comparação com indivíduos não infectados e 4% das mães infectada de ZIKV dos EUA resultaram em crianças com microcefalia¹¹. A taxa de defeitos de nascimento associada a microcefalia durante a gravidez de infecção de ZIKV no Brasil foram relatados para ter afetado até 17% dos bebês de mães infectadas, indicando que outros fatores na América Latina podem estar contribuindo para o aumento do risco ¹³. enquanto nós sabemos que o ZIKV pode causar microcefalia e patogênese em progenitoras neurais celular (NPC) população^7,8,14, completa patogênese da ZIKV no desenvolvimento do cérebro Ainda não se alcançou. É importante desenvolver modelos animais para investigar os mecanismos de doença subjacente as anormalidades do cérebro associadas com infecção ZIKV.

Para estudar diretamente o efeito que o ZIKV tem no desenvolvimento do cérebro, nós primeiro desenvolveu um modelo de rato usando inoculação intracerebral do cérebro de (E14.5) 14,5 dia embrionário com ZIKV⁷. Nesta fase foi escolhida como considera-se representante do fim do primeiro trimestre de gestação humana¹⁴. Filhotes podem sobreviver até dia pós-natal 5 (P5) com este método de injeção intracerebral embrionário (~ 1 µ l de 1.7 x 10⁶ cultura do tecido dose infecciosa (TCID50/mL)). Esses filhotes pós-natal exibem uma variedade de fenótipos da mesma forma observada em lactentes humanos infectados, incluindo ventrículos alargados, perda neuronal, rarefação axonal, astrogliosis e microglial ativação^12,15. Um cérebro de rato recém-nascido é relativamente imaturo, semelhante à fase de desenvolvimento do cérebro humano no meio da gestação¹⁶, e desenvolvimento do cérebro do rato inclui um componente importante de pós-natal. Para estudar mais tarde infecções de fase de gestação, um método para infecção pós-Natal também é descrito. Neonatos infectados com ZIKV no P1 são capazes de sobreviver à pós-injeção de 13 dias. Infecção do sangue-nascido em fase adulta tem sido descrita no mouse anteriormente¹⁷ mas exige o uso de fatores de transcrição de fator regulador (IRF) o interferon (IFN) IRF-3, -5, estirpe de nocaute triplo-7. Este protocolo descreve um método de inoculação de ZIKV intraventricularly para contornar desativando a resposta antiviral do modelo murino no adulto. Enquanto isto contorna o sistema imunológico murino, esta via de injeção não imitar diretamente a rota típica de infecção. Para resolver esta discrepância, diretamente, o experimentador pode executar uma infecção intra-uterina de ZIKV em vez da rota intracraniana. Adotado a partir de trabalho anterior¹⁸, brevemente descrevemos esta técnica neste protocolo infecção embrionária.

As estirpes de vírus Zika implementadas com esta técnica incluem o mexicano isolado de^7,MEX1-44¹⁹ e o africano isolar senhor-766 isolado em 1947²⁰. Zika MEX1-44 foi isolado em Chiapas, no México, em janeiro de 2016 de um infectado Aedes aegypti mosquito. Obtivemos deste vírus com permissão através da University of Texas Medical Branch em Galveston (UTMB). Além disso, o sorotipo do vírus Dengue (DENV2) de 2 foi inoculado usando esta técnica em um estudo de comparação. DENV2, estirpe S16803 (sequência GenBank GU289914), foi isolada a partir de uma amostra do paciente da Tailândia em 1974 e passadas em células C6/36. O vírus foi passado duas vezes em células Vero, pelo centro de referência mundial de vírus emergentes e arbovírus (WRCEVA) antes de injeções de rato. Isto demonstra que esta técnica funciona igualmente bem para diversas cepas de ZIKV e outros flavivírus que podem ter um impacto no desenvolvimento do cérebro.

Protocolo

Todo animal usar protocolos siga as orientações de cuidados com animais da Universidade do Sul da Califórnia e da Universidade da Geórgia. Métodos de eutanásia para barragens grávidas e adultos são executados de acordo com protocolos aprovados: asfixia de dióxido de carbono, seguida por deslocamento cervical como um método secundário para garantir a eutanásia. Filhotes neonatais são sacrificados por decapitação.

Atenção: O seguinte protocolo envolve lidar com um vírus patogênico. Precaução adequada deve ser tomada durante a manipulação do vírus. Todos os protocolos devem ser aprovados por prévia Comissão institucional adequado para usar.

1. embrionária inoculação Intracerebral de vírus Zika

1. Para acasalamento grávida cronometrado, considere meio dia do dia após o acasalamento como E0.5. Par de ratos no final do dia e verificar fichas no início da manhã para reduzir a variabilidade da época do acasalamento.
2. Prepare a agulha de vidro antes da cirurgia. Puxe a agulha e corte em 1/3 de seu comprimento e, em seguida, nitidez em um ângulo de 45° usando um moedor de micropipeta com um gotejamento de água até o poro é dimensionado para 50-70 µm. cheque as pontas agulha sob um estereoscópio para qualidade e ruptura.
3. Manter o vírus alíquota no gelo. Apenas antes da cirurgia, carrega o mix de injeção ZIKV para a agulha de injeção de vidro preparado. Montar a seringa de injeção hermética (volume de 50 µ l), fixação do conector luer-lock e tubulação e saturar a seringa montada com o tubo com óleo mineral. Uma vez saturado, anexar a agulha e desenhar ~ 6-7 µ l ZIKV para a agulha (~ 1 µ l é 1,7 × 10⁶ TCID50/mL).
4. Injetar C57BL/6J grávida ou 129S1/SvImJ ratos com embriões E14.5 dia embrionário (injectável intracraniana) ou embriões E10.5 (para injeção intra-uterina) com cloridrato de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg), diluído em solução salina estéril intraperitonealmente para induzir anestesia na mãe. Alternativamente, anestesia as mães com isoflurano monitorados isoflurano fornecido por inalação, com eliminação de gases residuais, se necessário. Injete buprenorfina-SR (0.5-1.0mg/kg) por via subcutânea para induzir analgesia.
5. Teste do beliscão anestesiados mães na ponta do dedo do pé ou cauda e depois colocá-los em decúbito dorsal sobre uma almofada de aquecimento animal-aprovado (almofada térmica de 2,5 100 x 200 mm). A pinça de aperto do dedo do pé não é estéreis e não está acostumada a lidar com tecidos em cirurgia. Alternativamente, as mãos enluvadas podem ser usadas para testar o reflexo de retirada de pitada de dedo do pé.
   Nota: Consulte seu pessoal veterinário institucional para o perioperatório preferencial método de aquecimento. A capa foi colocada entre esta almofada de aquecimento e o animal.
6. Adicione pomada oftálmica nos olhos.
7. Raspar a superfície do abdômen e esterilizar com iodo e álcool três vezes. Alternam as toalhitas de iodo e álcool; Limpe em um movimento circular, longe do local cirúrgico.
8. Cubra a pele ao redor do sítio cirúrgico com panos esterilizados para evitar a contaminação da incisão e os instrumentos.
   Nota: A abertura da cortina não deve ser maior do que o sítio cirúrgico preparado; o cabelo não deve ser visto na abertura da cortina.
9. Beliscar a pele da mãe longe de seu abdômen com fórceps e cortar a parte inferior do abdome em uma linha de 1-1,5 cm na linha sagital medial com tesoura cirúrgica estéril. Isso corta a pele e para dentro da cavidade abdominal para que os embriões estão agora expostos.
   Nota: Tesouras cirúrgicas são usadas para incisão da pele e camada peritoneal. Luvas e instrumentos esterilizados são utilizadas para cada cirurgia.
10. Cortar uma fenda no meio de uma pequena gaze estéril e aplique em cima da abertura cirúrgica. Hidratar com soro fisiológico estéril. Puxe os embriões através da fenda para descansar sobre a gaze estéril, com cuidado para não remover mais de 4-5 embriões focando um corno uterino de uma só vez.
11. Hidrate os embriões com solução salina estéril antes e durante a inoculação para garantir que eles não secam. Manter o controle de quais embriões são injetados e sua localização dentro do corno uterino. Embriões individuais, portanto, são tratados como experimentos separados, como embriões não altera a posição enquanto o desenvolvimento no útero. (Continue para a etapa de 1,15 para injeção intra-uterina).
12. Coloque delicadamente uma espátula sob a cabeça do embrião. Ilumine os embriões com uma lâmpada para visualizar as suturas da cabeça e o crânio.
    Nota: Técnica asséptica é seguida, incluindo instrumentos e luvas cirúrgicas estéreis. Depois de itens não-estéril (tais como a lâmpada) são manipuladas, as luvas devem ser substituídas por novas luvas estéreis antes de manipulação de instrumentos esterilizados e áreas.
13. Posição da cabeça através da manipulação do embrião com a lâmpada (atrás da cabeça para a visibilidade) e dedos livre até a cabeça do embrião é empurrada para cima diretamente contra a parede uterina e mantida no lugar com a mão não dominante.
    Nota: Posicionamento do embrião é uma parte crítica e a técnica que leva a mais prática. Muita pressão do dedo pode danificar as membranas embrionários levando a letalidade e pressão suficiente não pode dificultar a injeção.
14. Use os vasos sanguíneos que corre ao longo da sutura do crânio como um guia. Injetar o vírus ZIKV (~ 1 µ l, 1,7 × 10⁶ isolar mexicano TCID50/mL MEX1-44) em um dos ventrículos laterais do cérebro do embrião E14.5 com o montado de seringa e agulha. Use o controle de mídia como uma injeção de Souza.
15. Para melhorar a retenção da gravidez, evite injeção viral de dois embriões ao lado os ovários e os dois embriões ao lado da vagina superior (figura 1A). Em geral, não mais que 6 embriões são injetados por ninhada para reduzir o tempo da cirurgia e evitar a perda de embrião.
16. Coloque as barragens grávidas os embriões injetados e encher a cavidade abdominal com ~ solução salina estéril 0,5 mL. Para fechar, primeiro suturar os dois o músculo abdominal peritoneal e em seguida de sutura em segundo lugar a camada externa da pele com 4,0 suturas estéreis. É preferível usar suturas interrompidas; Há possibilidade de deiscência de ferida, se o rato rói a sutura.
17. Coloque o mouse em uma gaiola parcialmente repousando em uma almofada de aquecimento para permitir que o mouse para escapar a uma área não aquecida, se necessário. Monitore as mães enquanto eles recuperar (1-2h) de anestesia. Desenvolva os embriões após cirurgia para variadas vezes de acordo com as experiências individuais.
18. Injeção intrauterina
    1. Com um corno uterino e embriões expostos, usar uma agulha de seringa e 27G de 1 mL para injetar o vírus de Zika 100 μL (10⁶ TCID₅₀ unidades suspensas em 100 μL DMEM), ou meio de controle, para o espaço intra-uterino ou no tecido placentário. Observe que embriões foram injetados para dissecções de fase embrionária. Ver trabalho anteriormente publicado para mais detalhes,¹⁸.
    2. Coloque as barragens grávidas embriões injetados e encher a cavidade abdominal com ~ solução salina estéril 0,5 mL. Para fechar, primeiro da sutura do músculo abdominal peritoneal e em seguida de sutura em segundo lugar a camada externa da pele com 4,0 suturas estéreis. É preferível usar suturas interrompidas; Há possibilidade de deiscência de ferida, se o rato rói a sutura.
    3. Coloque o mouse em uma gaiola parcialmente repousando em uma almofada de aquecimento para permitir que o mouse para escapar a uma área não aquecida, se necessário. Monitore as mães enquanto eles recuperar (1-2h) de anestesia. Desenvolva os embriões após cirurgia para variadas vezes de acordo com as experiências individuais.

2. neonatal inoculação Intracerebral de vírus Zika: P1/P0

1. Certifique-se de que as agulhas e seringas de injeção hermética (volume de 10 µ l) não estão entupidas. Limpar e testar carregando três seringas descartáveis de 20 mL com agulhas de calibre 26: um com soro fisiológico, um com 70% de etanol e um com ar para limpar as soluções. Esterilize com água sanitária 10% se usado anteriormente para a injeção do vírus.
2. Manter o vírus no gelo. Carregar a seringa enchendo-o com soro fisiológico para reduzir o volume morto na seringa e desenhar 0,75 µ l de ar para separar o material de injeção de solução salina.
3. Prepare uma câmara de recuperação umidificado aquecido para filhotes injetados. Usando um bloco de aquecimento, coloque um recipiente closeable (como uma caixa vazia de ponta) com uma gaze estéril e umidificar com solução salina. Pré-aqueça a ele antes de começar as injeções.
4. Configure o microinjector, incluindo a bomba e o controlador. Determinar o código do tipo de dispositivo para a seringa específica (ou seja, para uma seringa de 10 µ l, o tipo de dispositivo é "D"). Determine a velocidade de injeção.
5. Recolha os filhotes dia pós-natal 0 ou 1 (P1/P0) perto da instalação cirúrgica. Carrega a seringa de injeção com o vírus. Desinfectar o monte de cabeça de cachorro com 70% EtOH.
6. Embrulhe os filhotes em uma fina camada de gaze e enterrá-los completamente em gelo para conseguir um estado anestésico. Filhotes são cryoanesthetized por 5 min. Certifique-se de que os filhotes são suficientemente anestesiados para injeção, realizando uma pitada de cauda toe sem resposta. Isto rende aproximadamente 15 min de um estado anestésico.
7. Coloque o filhote no Monte cabeça, esterilizar a superfície da cabeça com iodo e, etanol (três vezes) e depois seque com uma limpeza sterile (isopropanol ou 70% EtOH).
8. Lambda de marcar com um marcador preto e gravar as coordenadas em lambda usando o instrumento estereotáxica. Medir a distância de lambda para a borda do olho e início das coordenadas estereotáxicos de lambda calcular a distância de 2/5 da lambda a olho (para ambos os hemisférios, se você está injetando ambos).
9. Re-Verifique a profundidade anestésica antes da criação de um buraco para o local da injeção. Use uma agulha de calibre 26 cuidadosamente e superficialmente perfurar o couro cabeludo e o crânio no local da injeção (o crânio é muito suave em neonatos) para criar uma abertura para a agulha de injeção.
10. Abaixe a agulha de injeção o local perfurado e uma vez que a agulha quebrou apenas a pele, calcular uma profundidade de 1 mm para o local da injeção (ventrículo lateral) usando o instrumento estereotáxica.
11. Uma vez que a agulha é abaixada até a profundidade de injeção, programar o microinjector para injetar: 1 µ l de vírus, a uma taxa de 10 nL/s, injetando aproximadamente 1 µ l mais de 1,5 min (~ 1 μl 3.4 x 10⁵ TCID50/mL ZIKV).
12. Quando termina a injeção, espere 30 s e retrair a agulha em incrementos de 0,5 mm, rodando o parafuso (dorsalmente), esperando 30 s após cada incremento.
    Nota: Isso reduz o vazamento de vírus injetado.
13. Uma vez removido, ou carregar rapidamente a agulha e a seringa com mais vírus (vírus diferentes ou controles de simulação devem ser carregadas na seringas/agulhas separadas) ou remover o filhote da montagem da cabeça para a câmara previamente aquecida e umidificada. Monitore o filhote em poucos minutos para avaliar a recuperação. Substitua os filhotes com sua ninhada.

3. adulta inoculação Intracerebral de vírus Zika

1. Injecte ratos adultos intraperitonealmente com cloridrato de cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg), diluídos em solução salina estéril para induzir anestesia. Injete buprenorfina-SR (0.5-1.0mg/kg) por via subcutânea para induzir analgesia. Dedo do pé/cauda beliscar o mouse para garantir seu estado anestésico e posteriormente montá-lo no instrumento estereotáxica (com uma almofada de aquecimento) para imobilizar a cabeça durante a cirurgia.
2. Adicione pomada oftálmica nos olhos para evitar os olhos do rato sequem durante a cirurgia. Raspe o couro cabeludo começando atrás dos olhos para o início das orelhas. Esterilizar a pele exposta com iodo e 70% EtOH três vezes. Alternam as toalhitas de iodo e álcool; Limpe em um movimento circular, longe do local cirúrgico.
3. Re-Verifique a profundidade anestésica antes da incisão da pele. Usando um bisturi, faça uma incisão de 0,5 cm ao longo da linha sagital medial da cabeça no local esterilizado, expondo o bregma. Usando um movimento de rolamento com um cotonete, limpe a superfície do crânio dos tecidos meníngeos, enquanto simultaneamente, empurrando a pele longe dos locais de injeção.
4. A partir de bregma, alinhe o bocado de broca cirúrgica e identificar os locais de injeção, utilizando as seguintes coordenadas: AP-0,50 mm, ML: + /-1,5 mm. usando o pedal de controle, furar o crânio lentamente quanto apenas perfurar o osso até um buraco foi liberado para a agulha.
5. Substitua a broca com a bomba de microinjector e seringa hermética (volume de 10 µ l) sobre o estereotáxica. Deixando uma bolha de ar pequena entre o vírus e a solução salina, desenhar ~ 4-5 µ l de vírus. Determine o código do tipo de dispositivo para o volume da seringa específica (ou seja, D para seringa de volume 10 μL). Abaixe a agulha para DV:-1,50 mm da superfície do cérebro. Para injetar 1 µ l de vírus, programe uma taxa de 10 nL/s, injetando aproximadamente 1 µ l mais de 1,5 min.
6. Quando termina a injeção, espere 30 s e remova a agulha em incrementos de 0,5 mm, esperando 30 s após cada turno. Isto reduz o refluxo e escapamento do vírus injetado.
7. Quando os injection(s) está acabados, use fórceps para soltar a pele e recuperar o crânio exposto. Sutura no couro cabeludo de volta juntos usando 4,0 suturas e remova o mouse do instrumento estereotáxica. Lugar o mouse em uma gaiola parcialmente descansando sobre uma almofada de aquecimento para permitir que o mouse para escapar a uma área não aquecida, se necessário e monitorar enquanto eles recuperar (1-2h) de anestesia.

Resultados

Imagens representativas de nossos métodos de injeção para a inoculação de ZIKV do cérebro embrionário são mostradas em diagramas com injeções intracerebrais (figura 1A) e intra-uterina e injeções de intraplacental (figura 1B), ilustrando a maneira a barragem grávida e embriões devem ser vistos e orientados para a cirurgia (protocolo de inoculação embrionárias). Figura 2A apresenta in...

Discussão

Descrito aqui é um método de inoculação intracerebral do ZIKV em fases embrionárias, Neonatais e adultos para a investigação de danos ZIKV-induzida no desenvolvimento do cérebro. Embora simples, há algumas considerações que os investigadores devem tomar para garantir a qualidade do estudo e a segurança dos envolvidos.

DENV está intimamente relacionado com a ZIKV do gênero flavivirus. DENV não tem sido associada causalmente com desordens cerebrais pediátricos nos seres humanos. ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor	Leica	39416001
Mouse Stereotax	Kopf	04557R
Micro4 Microsyringe Pump Controller	WPI	SYS-MICRO4
UMP3 UltraMicroPump	WPI	UMP3
Modulamp	Schott	-
Luer-lock tubing (19-gauge)	Hamilton	90619
Melting Point Capillary	Kimble	34500-99	Glass needle
Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres	Thermo Scientific	R25	No dilution; Use for practice injections
10 µL, Model 1701 LT SYR	Hamilton	80001	for embryonic inoculation
10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2	Hamilton	80030	for neonate/adult
4-0 Ethilon Nylon Sutures	Ethicon	-
Mineral Oil	VWR	-
micropipette puller	Sutter Instruments	P-1000
Micropipette Grinder	Narishige	EG-44
Fastgreen FCF Dye	Sigma	F7252	inject with 0.5% Dye
Antibodies
Flavivirus group antigen antibody	Millipore	MAB10216	ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3)
Pax6	DBHB	Pax6-s	ms IgG1 1:20