Fractionnement subcellulaire pour l’Activation de ERK par traitement de peptides dérivés mitochondriale

Résumé

Ce protocole décrit comment stimuler les cellules avec des peptides dérivés mitochondriale et évaluer la signalisation cascade et la localisation des phospho-protéines.

Résumé

Peptides dérivés mitochondrial (AMD) sont une nouvelle classe de peptides qui sont codées par des cadres de lecture ouvert petit au sein d’autres gènes connus du génome mitochondrial. Les AMD ont une grande variété d’effets biologiques tels que la protection des neurones contre l’apoptose, l’amélioration des marqueurs métaboliques et protégeant les cellules de la chimiothérapie. Humanin a été le premier MDP à découvrir et est la plus étudiée peptide parmi la famille des MDP. Les récepteurs membranaires et les voies de signalisation en aval de humanin ont été soigneusement caractérisés. Les AMD supplémentaires telles que des MOTS-c et SHLP1-6 ont été découvertes plus récemment et les mécanismes de signalisation n’ont pas encore à élucider. Nous décrivons ici une méthode fondés sur la culture de cellules pour déterminer la fonction de ces peptides. En particulier, les techniques de fractionnement cellulaire en combinaison avec western blot permettent la détermination quantitative de l’activation et la translocation de la molécule de signalisation importante. Bien qu’il existe d’autres méthodes de fractionnement cellulaire, celle décrite ici est une méthode simple et directe. Ces méthodes peuvent être utilisées pour élucider plus loin le mécanisme d’action de ces peptides et d’autres agents thérapeutiques.

Introduction

Nouvelles études montrent que les peptides dérivés mitochondriale (AMD) jouent des rôles importants de cytoprotection et métabolisme^1,2,3. Comprendre la voie de transduction de signal en présence d’AMD nous donne un aperçu du mécanisme par lequel les AMD modulent diverses fonctions. Le premier MDP identifié, humanin, a été montré pour augmenter la kinase de signal-réglée extracellulaire 1/2 (ERK1/2) phosphorylation par l’intermédiaire de son récepteur liaison^4,5. Cependant, l’effet en aval de l’activation de ERK1/2 est toujours sous-explorée.

La cascade de ERK1/2 sert de médiateur essentiel dans une variété de processus cellulaires comme la prolifération, la migration cellulaire, métabolisme cellulaire, la survie et l’apoptose^6,7,8. Pour orchestrer tous ces processus cellulaires distincts, l’activité et la localisation subcellulaire de ERK1/2 sont étroitement contrôlées par des phosphatases et échafaudage protéines^9,10. En plus des modifications post-traductionnelles, la dynamique de la navette de ERK1/2 réglemente également sa signalisation fonction, activité et spécificité^11,12. ERK1/2 est principalement localisée dans le cytosol¹³. Un ensemble de protéines d’ancrage et échafaudage aident à retenir ERK1/2 dans les éléments du cytosquelette, sur la surface des organites ou diffus dans le cytoplasme¹³. Lors de la stimulation, ERK1/2 est phosphorylé et devient dissocié de ses protéines d’ancrage, ce qui permet la translocation de ERK1/2 aux autres compartiments subcellulaires, y compris le noyau, mitochondries, Golgi et lysosomes^{14, 15 , 16}.

Humanin est connu pour activer la ERK1/2 voie de signalisation, l’activation de ERK1/2 est observée seulement dans les lysats cellulaires totales. Comme décrit auparavant, car la localisation subcellulaire de ERK1/2 joue un rôle crucial dans son effet en aval, l’analyse de la localisation subcellulaire et les concentrations totales de phosphorylés ERK1/2 est nécessaire pour fournir une compréhension globale d’activation de ERK1/2 induite par le humanin et l’activation des cibles en aval.

Pour comprendre les organites cibles de ERK1/2 activé, fractionnement subcellulaire suivi par western blot pour phosphorylés ERK1/2 a été réalisé. Cette méthode peut être facilement mis en œuvre comme il utilise des réactifs et matériel de laboratoire standard. Les compartiments subcellulaires isolés sont d’une grande pureté, permettant que les résultats être interprété de façon directe. Immunomarquage de ERK1/2 peut produire des résultats similaires. Toutefois, certains compartiments subcellulaires sont relativement difficiles à visualiser et exigent des méthodes spéciales de fixation et perméabilisation. ERK1/2 niveaux varient dans les compartiments subcellulaires, et cette variation pourrait provoquer de faux positifs et fausses négatifs signaux quand on regarde les lysats de cellules entières. Par conséquent, un immunoblot utilisant des compartiments subcellulaires isolés nous donne une meilleure compréhension de la localisation de ERK1/2.

La polyvalence de la méthode permet aux modifications du protocole à examiner les effets d’autres stimulants, y compris les autres AMD ou translocation d’autres molécules de signalisation tels que STAT3. Récemment découverts petits humanin-like peptides (SHLPs) sont codés de la région d’ARNr 16 s où humanin est codé, et elles ont des propriétés similaires mais distinctes contre HN¹⁷. Par exemple, SHLP2 et SHLP3 activent ERK1/2 après que 8 h bien que humanin active ERK1/2 dans 5 min. examen localisation subcellulaire de ERK1/2 en réponse à différents peptides nous donnera une meilleure compréhension de la biologie de ces peptides. Des preuves nouvelles, ont montré que la localisation subcellulaire de molécules de signalisation joue un rôle crucial dans leurs effets en aval. Par exemple, STAT3 est traditionnellement connu pour être localisés principalement dans le cytosol des cellules au repos, et ensuite il translocation dans le noyau pour activer l’expression des gènes en réponse à des cytokines¹⁸. Stat3 également translocation aux mitochondries et régule le cycle de Krebs et ATP production¹⁹. Concernant le règlement de l’autophagie, différente localisation subcellulaire de STAT3 module autophagie dans diverses manières²⁰. Par exemple, nucléaire STAT3 transcriptionnellement régule les gènes liés à l’autophagie et agit comme un modulateur de l’autophagie. Cytoplasmique STAT3 inhibe constitutivement autophagie en interagissant avec autophagie molécules de signalisation. Mitochondrial STAT3 inhibe et empêche mitophagy en supprimant le stress oxydatif induit par autophagie. Par conséquent, cette méthode d’isolation compartiment subcellulaire est cruciale pour comprendre le rôle des autres molécules de signalisation ainsi que les ERK1/2.

Protocole

1. traitement de peptide aux cellules

1. plaque 2 millions SH-SY5Y ou cellules HEK293 (2 x 10 ⁶) dans un 10 cm plat et cultivent pour 2 jours
2. (facultatif) l’autre jour, laver les cellules avec sans sérum Dulbecco ' s mise à jour le Eagle media moyen (DMEM) une fois et incuber avec sérum DMEM gratuit du jour au lendemain si le traitement doit être fait dans les médias libres sériques.
3. Le jour 3, dissoudre les peptides S14G-humanin à 0,2 µm filtrée, l’eau distillée et reconstituer leur solution stock de 1mM.
   Remarque : Les peptides doivent être dissous dans le solvant approprié, qui peut être déterminé par les caractéristiques de la séquence du peptide (par exemple, la charge globale) et peut-être être fourni par le fabricant si les peptides sont disponibles dans le commerce. Par exemple, S14G-humanin, SHLP2 et SHLP6 et MOTS-c se dissolvent dans l’eau. Aliquote les peptides dans un volume approprié (par exemple, 50 μL) pour éviter le gel et dégel des cycles. Une fois décongelé, ne pas les utiliser à nouveau.
4. Partie aliquote du pré chauffé contenant du sérum ou des milieux sans sérum dans un 50 mL conique tube et ajouter la solution mère de 1 mM de température ambiante pour en faire une concentration de travail (par exemple, 1 µM, 10 µM).
5. Remplacer les médias avec 6 mL de solution de peptide de l’étape 1.4. et incuber les cellules pendant le laps de temps approprié.
   Remarque : Choisir le temps d’incubation selon votre état de santé qui active ERK.

2. Fractionnement subcellulaire de Cytosol et le noyau

1. laver les cellules deux fois avec 10 mL de PBS glacee, gratter les cellules de la plaque dans 5 mL de PBS glacée et transférer la suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL.
2. Centrifuger les cellules à 500 g pendant 5 min à 4 ° C.
3. Aspirer le PBS et Resuspendre le culot dans 200 µL de tampon de fractionnement glacee, (pH HEPES 10 mM = 7,6, 3 mM MgCl ₂, 10 mM KCl, 5 % (v/v) de glycérol, 1 % tensioactif non ionique (C ₁₃ H ₂₂ O (C ₂ H ₄ O) (_n), inhibiteurs de la protéase/phosphatase).
   NOTE : Pour garder les protéines dans leur état de phosphorylation, inhibiteur de la phosphatase comme ainsi que la protéase inhibiteur doit être fraîchement ajouté et échantillon devra être conservé sur la glace à tout moment. Répétition de gel et dégel cycles d’échantillons doivent être évitées. Aliquotes échantillons en petite quantité (p. ex. 50 μg) avant de les congeler à -80 ° C.
4. Incuber le culot remises en suspension sur la glace pendant 15 min et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C.
5. Recueillir le surnageant comme la fraction cytoplasmique et garder le culot pour la fraction nucléaire.
6. Centrifuger le surnageant pour supprimer les débris cellulaires et autres contaminants à 18 000 x g pendant 10 min à 4 ° C et ensuite transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge. Il s’agit de la fraction cytosol.
7. Resuspendre le culot dans 200 μL glacée de tampon de lavage (pH HEPES 10 mM = 7,6, 1,5 mM MgCl ₂, 420 mM NaCl, 25 % (v/v) de glycérol, 0,2 mM EDTA, inhibiteurs de la protéase/phosphatase) et centrifuger à 250 x g pendant 5 min à 4 ° C
8. Enlever le surnageant et Resuspendre le culot dans tampon d’extraction glacee, nucléaire 100 μL (pH HEPES 20 mM = 7,6, 1,5 mM MgCl ₂, 420 mM NaCl, 25 % (v/v) de glycérol, 0,2 mM EDTA, inhibiteurs de la protéase/phosphatase) et laisser agir 10 fois (5 s, 10 s large, 30 % amp.) sur glace
9. Centrifuger à 18 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
10. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge. Il s’agit de la fraction nucléaire.
11. Quantifier la quantité de protéine à un dosage BCA

3. Fraction mitochondrique brute

1. laver les cellules dans chaque plat de 10 cm avec 10 mL de PBS glacée, ajouter 5 mL de PBS glacée et détacher les cellules à l’aide d’un grattoir de cellules.
   Remarque : Utiliser trois plats de 10 cm de cellules pour obtenir un bon rendement des mitochondries pour Western Blotting.
2. Transférer la suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL et combiner tous de trois plats de 10 cm dans un tube conique de 15 ml.
3. Centrifuger les cellules à 600 x g pendant 10 min à 4 ° C.
4. Aspirer le PBS et Resuspendre le culot dans 1 mL de tampon d’isolement des mitochondries glacé (10 mM Tris-MOPS, EGTA/Tris de 1 mM, 200 mM de Sucrose, ajuster le pH = 7,4).
5. Homogénéiser les cellules à 25 coups d’un homogénéisateur de 2 mL avec pilon enduit polytétrafluoroéthylène sur glace
   Remarque : Cette étape est essentielle pour maintenir l’intégrité mitochondriale et maximiser le rendement de la fraction mitochondriale. Le nombre de coups doit être optimisé pour chaque type de cellule. Refroidir l’homogénéisateur avant de commencer la procédure.
6. Transférer l’homogénat dans un tube de microcentrifuge et centrifuger à 600 x g pendant 10 min à 4 ° C et retirer les noyaux et ininterrompu de cellules il.
7. Recueillir le surnageant, transférez-le dans un nouveau tube de microcentrifuge et il centrifuger à 7 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
   Remarque : Le pellet est lâche, recueillir le liquide surnageant avec soin et essayez de ne pas déranger le culot.
8. Enlever le surnageant et Resuspendre le culot avec 200 μL de tampon d’isolement de mitochondries glacee transvaser la solution dans un nouveau tube de microcentrifuge. Centrifuger le tube à 7 000 x g pendant 10 min à 4 ° C.
9. Répéter l’étape 3,8 pour laver le culot. Il n’est pas nécessaire de transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge dans cette étape.
10. Supprimer le surnageant de la pastille lavée et remettre en suspension l’extrait concentré contenant des mitochondries avec 50 μL de tampon de RIPA.
11. Incuber la suspension sur la glace pendant 10 min.
12. Centrifuger la suspension à 16 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
13. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge. Il s’agit de la fraction mitochondriale.
14. Quantifier la quantité de protéine à un dosage BCA.

4. Western Blot pour les protéines spécifiques de la Phospho

1. réaliser une électrophorèse SDS-polyacrylamide (8-16 % premade gel) et la protéine de transfert d’une membrane PVDF ⁴.
2. Incuber la membrane avec 5 % de BSA dans TBST (0,1 % Polysorbate 20) pendant 30 min à température ambiante pour bloquer les sites de fond non-spécifiques.
   Remarque : Pour la détection de la protéine phosphorylée, bloquer la membrane avec BSA pas de lait. Le lait contient caséine, une phosphoprotéine abondante, qui se traduit par un signal non spécifique élevé.
3. Incuber la membrane avec l’anticorps primaire (anti-phospho-ERK1/2) à 4 ° C jusqu’au lendemain.
4. Le lendemain, lavez la membrane avec un mélange TBST (0,1 % polysorbate 20), trois fois pendant 5 min à température ambiante.
5. Incuber la membrane avec l’anticorps secondaire (anti-lapin HRP) pendant 1 h à température ambiante.
6. Laver la membrane avec un mélange TBST (0,1 % polysorbate 20), trois fois pendant 5 min à température ambiante.
7. Incuber la membrane avec une solution ECL et la membrane dans l’analyseur d’image d’image.
8. Bande de la membrane avec décapage tampon pendant 15 min à température ambiante et laver la membrane avec un mélange TBST trois fois pendant 5 min.
9. Répéter les étapes à l’aide de 4,2 à 4,7 l’anticorps de ERK1/2 anti-total.
10. Pour vérifier la pureté de chaque fraction, exécutez SDS-PAGE et effectuer des immunoblots utilisant des anticorps reconnaissant des marqueurs pour chaque compartiment (p. ex., Lamin B1 pour noyau, GAPDH pour cytosol et TOM20 des mitochondries).

Résultats

À l’aide de la procédure présentée ici, nous avons traité des cellules HEK293 et SH-SY5Y avec 1 μM et 100 μM S14G-humanin, un humanin puissant analogiques²¹, respectivement, dans toutes les médias pour les périodes indiquées (Figure 1A et Figure 1 B). nous avons ensuite examiné la forme totale et phosphorylée de ERK1/2 au Thr²⁰²/Tyr²⁰⁴ ...

Discussion

Ici, nous avons démontré que humanin induite par le peptide ERK1/2 activation se produit dans deux types de cellules différentes, et la localisation subcellulaire d’activées ERK1/2 peut être différente selon les conditions (p. ex., dose de peptide, point dans le temps et cellule type). Il a été démontré que humanin signaux par l’intermédiaire de deux récepteurs différents^22,23, qui peut expliquer les différences de signalisation entre l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
p44/42 MAPK (ERK1/2)	Cell signaling	9102	Dilution 1:1,000
phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)	Cell signaling	4370	Dilution 1:1,000
Lamin B1	Cell signaling	12586	Nuclear Marker, Dilution 1:1,000
GAPDH	Cell signaling	5174	Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000
Tom20	Santa cruz	SC-17764	Mitochondria marker, Dilution 1:2,000
anti-Rabbit-HRP conjugated	Cell signaling	7074	Dilution 1:30,000
RIPA Lysis and Extraction Buffer	ThermoFisher SCIENTIFIC	89900
100 mm Culture Dish	ThermoFisher SCIENTIFIC	12556002
HNG peptide	Genescript
25mm sylinge filter	ThermoFisher SCIENTIFIC	09-719A
HEPES	Sigma	H3375
MgCl2	Sigma	M8266
KCl	Sigma	P9333
Glycerol	Sigma	G9012
Triton X-100	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP151-100
EDTA	Sigma	3609
MOPS	Sigma	M1254
EGTA	Sigma	E3889
Sucrose	Sigma	S7903
Tris-base	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP152-1
HCL	Sigma	H1758
PBS	Lonza	17-512F
Cell Scraper	FALCON	353085
Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	ThermoFisher SCIENTIFIC	78440
Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles	Thomas Scientific	3432S90
Tween-20	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP337-500
BSA	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP1600-100
8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	BIO RAD	4561104
Mini Trans-Blot Module	BIO RAD	1658030
Trans-Blot Turbo Transfer System	BIO RAD	1704150
Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit	BIO RAD	1704272
Clarity Western ECL Blotting Substrates	BIO RAD	1705060
Restore Western blot stripping buffer	ThermoFisher SCIENTIFIC	21059
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher SCIENTIFIC	11965-092
Sonicator, Medel: FB120	ThermoFisher SCIENTIFIC	695320-07-12