Fraccionamento subcelular para activação de ERK tratamento de peptídeo derivado mitocondrial

Resumo

Este protocolo descreve como estimulam as células com peptídeos derivados mitocondriais e avaliar a cascata de sinalização e localização de fosfo-proteínas.

Resumo

Peptídeos derivados mitocondrial (MDPs) são uma nova classe de peptídeos que são codificados por frames de leitura abertos pequenos dentro de outros genes conhecidos do genoma mitocondrial. MDPs têm uma grande variedade de efeitos biológicos como protegendo os neurônios da apoptose, melhorando marcadores metabólicos e protegendo as células da quimioterapia. Humanin foi o MDP primeiro a ser descoberto e o peptídeo mais estudado entre a família MDP. Os receptores de membrana e vias de sinalização a jusante de humanin foram cuidadosamente caracterizadas. MDPs adicionais tais como MOTS-c e SHLP1-6 foram descobertos mais recentemente e os mecanismos de sinalização ainda precisa ser elucidado. Aqui nós descrevemos um método de cultura com base de célula para determinar a função destes peptides. Em particular, técnicas de fracionamento celular em combinação com mancha ocidental permitem a determinação quantitativa da ativação e translocação de importante molécula de sinalização. Embora existam outros métodos de fracionamento celular, o descrito aqui é um método fácil e simples. Estes métodos podem ser usados para elucidar ainda mais o mecanismo de ação desses peptídeos e outros agentes terapêuticos.

Introdução

Estudos emergentes mostram que peptídeos derivados mitocondriais (MDPs) desempenham importantes funções no metabolismo e cytoprotection^1,2,3. Compreensão da via de transdução de sinal na presença de MDPs nos dá insight sobre o mecanismo pelo qual o MDPs modular várias funções. O primeiro PDM identificado, humanin, foi mostrado para aumentar a quinase de sinal-regulado extracellular 1/2 (ERK1/2) fosforilação através de seu receptor ligação^4,5. No entanto, o efeito a jusante de ERK1/2 ativação é ainda underexplored.

A cascata de ERK1/2 serve como um mediador essencial em uma variedade de processos celulares, incluindo a proliferação, migração celular, metabolismo celular, sobrevivência e apoptose^6,7,8. Para orquestrar todos estes processos celulares distintos, a atividade e Localização subcellular de ERK1/2 estão fortemente regulamentados por fosfatases e proteínas de andaime^9,10. Além de modificação pós-traducional, o vaivém dinâmico de ERK1/2 também regula sua sinalização função, atividade e especificidade^11,12. ERK1/2 é principalmente localizadas no citosol¹³. Um conjunto de proteínas de ancoragem e andaime ajudar a reter ERK1/2 elementos do citoesqueleto, na superfície das organelas, ou difusa no citoplasma¹³. Após a estimulação, ERK1/2 é fosforilada e torna-se dissociado de suas proteínas de ancoragem, permitindo a translocação de ERK1/2 para outros compartimentos subcelulares, incluindo o núcleo, mitocôndrias, Golgi e lisossomos^{14, 15 , 16}.

Embora humanin seja conhecido para ativar a via de sinalização ERK1/2, a ativação de ERK1/2 só é observada no lisado celular total. Conforme descrito anteriormente, desde que a Localização subcellular ERK1/2 desempenha um papel crucial em seu efeito a jusante, a análise de tanto a Localização subcellular e os níveis totais de fosforilada ERK1/2 é necessário para fornecer uma compreensão abrangente de ativação induzida por humanin de ERK1/2 e a ativação dos destinos a jusante.

Para entender as organelas do alvo do ativado ERK1/2, realizou-se o fraccionamento subcelular seguido pela mancha ocidental para fosforilada ERK1/2. Este método pode ser implementado facilmente como ele utiliza reagentes e equipamentos laboratoriais padrão. Os compartimentos subcellular isolados são de alta pureza, permitindo que o resultado deve ser interpretado direta. Immunostaining de ERK1/2 pode produzir resultados semelhantes. No entanto, certos compartimentos subcellular são relativamente difíceis de Visualizar e requerem métodos especiais de fixação e permeabilização. ERK1/2 níveis variam em compartimentos subcelulares, e esta variação pode causar sinais falsos positivos e falsos negativos quando se olha para o lisado celular total. Portanto, um immunoblot usando compartimentos subcellular isolados dá-em uma melhor compreensão da localização ERK1/2.

A versatilidade do método permite modificações do protocolo para investigar os efeitos de outros estimulantes, incluindo outros MDPs ou translocação de outras moléculas de sinalização como STAT3. Recentemente descobertos pequenos humanin, como peptídeos (corsários) são codificados da região de rRNA 16S onde humanin é codificado, e eles têm propriedades semelhantes mas distintas em relação ao HN¹⁷. Por exemplo, SHLP2 e SHLP3 ativam ERK1/2 após 8 h embora humanin ativa ERK1/2 dentro de 5 min. Localização subcellular exame de ERK1/2, em resposta a diferentes peptídeos nos dará uma melhor compreensão da biologia destes peptides. Emergentes evidências mostraram que a Localização subcellular das moléculas de sinalização desempenha um papel crucial em seus efeitos a jusante. Por exemplo, STAT3 é tradicionalmente conhecida para ser localizada principalmente no citosol em células de descanso, e então ele translocates até ao núcleo para ativar a expressão gênica em resposta a citocinas¹⁸. STAT3 também translocates à mitocôndria e regula o ciclo TCA e de produção de ATP¹⁹. Sobre regulamento de autofagia, diferente Localização subcellular de STAT3 modula autofagia em várias maneiras²⁰. Por exemplo, nuclear STAT3 transcricionalmente regula genes relacionados autofagia e atua como um modulador de autofagia. Citoplasmáticos STAT3 constitutivamente inibe a autofagia interagindo com moléculas de sinalização de autofagia. Mitocondrial STAT3 inibe e impede mitophagy suprimindo o estresse oxidativo induzido por autofagia. Portanto, esse método de isolamento do compartimento subcellular é crucial para compreender o papel da outra sinalização moléculas bem como ERK1/2.

Protocolo

1. tratamento de peptídeos às células

1. placa 2 milhões SH-SY5Y ou células HEK293 (2 x 10 ⁶) em um 10 cm do prato e cultivá-las por 2 dias
2. (opcional) no outro dia, lave as células com Dulbecco isento de soro ' s modificada Águia mídia médio (DMEM) uma vez e incubar com soro DMEM livre durante a noite, se o tratamento deve ser feito em meios livres de soro.
3. No dia 3, dissolver peptídeos de S14G-humanin em 0,2 µm filtrado, água destilada e reconstituí-los como solução estoque de 1mM.
   Nota: Os peptídeos devem ser dissolvidos em solvente apropriado, que pode ser determinado pelas características sequência do peptide (por exemplo, carga geral) e pode ser fornecido pelo fabricante se os peptídeos são comercialmente disponíveis. Por exemplo, S14G-humanin, SHLP2 e SHLP6 e MOTS-c se dissolvem na água. Alíquota os peptídeos em um volume adequado (por exemplo, 50 μL) para evitar congelar e descongelar ciclos. Uma vez descongelado, não usar outra vez.
4. Alíquota do soro-contendo pré-aquecido ou media serum-free em um Erlenmeyer de 50 mL do tubo e adicionar 1 mM temperatura de solução para torná-lo em uma concentração de trabalho (por exemplo, 1 µM, 10 µM).
5. Substituir a mídia com 6 mL de solução de peptídeo da etapa 1.4. e incube as celulas para a quantidade adequada de tempo.
   Nota: Escolher o tempo de incubação, dependendo de sua condição que ativa ERK.

2. Fraccionamento subcelular para o citoplasma e núcleo

1. lavar as células duas vezes com 10 mL de PBS gelado, raspar as células no prato em 5 mL de PBS gelado e transferir a suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL.
2. Centrifugar as células a 500 x g por 5 min a 4 ° C.
3. Aspire a PBS e ressuspender o sedimento em 200 µ l de tampão de fracionamento gelada, (pH HEPES 10mm = 7,6, 3 mM MgCl ₂, 10 mM KCl, 5% (v/v) glicerol, 1% não iónico (C ₁₃ H ₂₂ O (C ₂ H ₄ O) _n), inibidores da protease/fosfatase).
   Nota: Para manter as proteínas no seu estatuto de fosforilação, o inibidor da fosfatase como bem como protease inibidor deve ser adicionado recentemente e as amostras devem ser mantidas no gelo em todos os tempos. Repetição de congelamento e degelo ciclos de amostras devem ser evitados. Amostras de alíquotas em pequena quantidade (por exemplo, 50 μg) antes de congelá-los a -80 ° C.
4. Incubar a pelota re-suspensa no gelo por 15 min e em seguida centrifugar a 250 x g por 5 min a 4 ° C.
5. Recolher o sobrenadante como a fração citoplasmática e manter a pelota para a fração nuclear.
6. De centrifugação o sobrenadante para remover restos celulares e outros contaminantes a 18.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C e depois transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugadora. Esta é a fração do citosol.
7. Resuspenda o pellet em tampão de lavagem gelada 200 μL (pH HEPES 10mm = 7,6, 1,5 mM de MgCl ₂, 420 mM de NaCl, 25% (v/v) glicerol, 0,2 mM EDTA, inibidores da protease/fosfatase) e centrifugar 250 x g por 5 min a 4 ° C
8. Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 100 μL gelada, nuclear solução tampão (pH HEPES 20 mM = 7,6, 1,5 mM de MgCl ₂, 420 mM de NaCl, 25% (v/v) glicerol, 0,2 mM EDTA, inibidores da protease/fosfatase) e proceda à sonicação 10 vezes (5 s, 10 s fora, 30% amp.) na Ice.
9. Centrifugar a 18.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
10. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugadora. Esta é a fração nuclear.
11. Quantify a quantidade de proteína usando um ensaio BCA

3. fração mitocondrial bruto

1. lavar as células em cada prato de 10 cm com 10 mL de PBS gelado, adicionar 5 mL PBS gelado e separar as células com uma espátula de celular.
   Nota: Use três pratos de 10cm de células para obter um bom rendimento da mitocôndria para Western Bloting.
2. Transferir a suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL e combinar tudo a partir de três pratos de 10 cm em um tubo cônico de 15 ml.
3. Centrifugar as células a 600 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
4. Aspire a PBS e ressuspender o sedimento em 1 mL de tampão de isolamento de mitocôndrias gelada (10 mM Tris-MOPS, 1 mM Tris/EGTA, 200 mM de sacarose, ajustar o pH = 7,4).
5. Homogeneizar as células com 25 golpes de um homogeneizador de 2 mL com pilão revestida de politetrafluoretileno na Ice.
   Nota: Este passo é fundamental para manter a integridade mitocondrial e maximizar o rendimento da fração mitocondrial. O número de traços deve ser otimizado para cada tipo de célula. Precool o homogenizador antes de iniciar o procedimento.
6. Transferir o homogeneizado para um tubo de microcentrifugadora e centrifugar, a 600 x g durante 10 minutos a 4 ° C para remover núcleos e células ininterrupta.
7. Recolher o sobrenadante, transferi-lo para um novo tubo de microcentrifugadora e centrifugá-lo em 7.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
   Nota: A pelota é solta, recolher o sobrenadante com cuidado e tente não perturbar a pelota.
8. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 200 μL de tampão de isolamento de mitocôndrias gelada, transferir a solução para um tubo de microcentrifugadora novo. Centrifugar o tubo a 7.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
Repita o passo 3.8 para lavar o sedimento de
9. . Não é necessário transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifuga nesta etapa.
10. Retire o pellet lavado o sobrenadante e ressuspender o sedimento contendo mitocôndria com 50 μL de tampão RIPA.
11. Incubar a suspensão no gelo durante 10 min.
12. Centrifugar a suspensão de 16.000 x g, durante 15 min a 4 ° C.
13. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugadora. Esta é a fração mitocondrial.
14. Quantificar a quantidade de proteína usando um ensaio BCA.

4. Mancha ocidental para Phospho-específicas proteínas

1. realizar uma eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (gel de 8-16% premade) e a proteína de transferência para uma membrana PVDF ⁴.
2. Incubar a membrana com 5% BSA em TBST (0,1% polissorbato 20) por 30 min à temperatura ambiente para bloquear sites de fundo inespecificas.
   Nota: Para a deteção de proteína fosforilada, bloquear a membrana com BSA não leite. O leite contém caseína, um phosphoprotein abundante, o que resulta em alto sinal inespecífico.
3. Incubar a membrana com o anticorpo primário (antifosfo-ERK1/2) a 4 ° C durante a noite.
4. No dia seguinte, lave a membrana com TBST (0,1% polissorbato 20) três vezes por 5 min à temperatura ambiente.
5. Incubar a membrana com anticorpo secundário (anticoelho HRP) por 1h à temperatura ambiente.
6. Lavar a membrana com TBST (0,1% polissorbato 20) três vezes por 5 min à temperatura ambiente.
7. Incubar a membrana com solução ECL e imagem da membrana no analisador de imagem.
8. Tira a membrana com descascamento de buffer para 15 min a temperatura e a lavagem da membrana com TBST três vezes durante 5 min.
9. Repita os passos 4.2 a 4.7 usando anticorpo anti-total ERK1/2.
10. Para verificar a pureza de cada fração, executar SDS-PAGE e executar immunoblots usando anticorpos reconhecendo marcadores para cada compartimento (por exemplo, B1 jesuina para núcleo, GAPDH para o citosol e TOM20 para as mitocôndrias).

Resultados

Usando o procedimento apresentado aqui, tratamos de células HEK293 e SH-SY5Y com 1 μM e 100 μM S14G-humanin, um potente humanin analógico²¹, respectivamente, em completa mídia para os períodos de tempo indicado (Figura 1A e Figura 1 B). em seguida examinamos a forma fosforilada e total de ERK1/2 em Thr²⁰²/Tyr²⁰⁴ de extratos de proteínas totais...

Discussão

Aqui, temos demonstrado que humanin mediada por peptídeo ERK1/2 ativação ocorre em dois diferentes tipos de células, e a Localização subcellular de ERK1/2 registrados pode ser diferente dependendo das condições (por exemplo, dose de peptídeo, ponto do tempo e célula tipo). Tem sido demonstrado que humanin sinais através de dois receptores diferentes^22,23, que pode explicar as diferenças na sinalização entre as linhas de duas células, bem c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
p44/42 MAPK (ERK1/2)	Cell signaling	9102	Dilution 1:1,000
phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)	Cell signaling	4370	Dilution 1:1,000
Lamin B1	Cell signaling	12586	Nuclear Marker, Dilution 1:1,000
GAPDH	Cell signaling	5174	Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000
Tom20	Santa cruz	SC-17764	Mitochondria marker, Dilution 1:2,000
anti-Rabbit-HRP conjugated	Cell signaling	7074	Dilution 1:30,000
RIPA Lysis and Extraction Buffer	ThermoFisher SCIENTIFIC	89900
100 mm Culture Dish	ThermoFisher SCIENTIFIC	12556002
HNG peptide	Genescript
25mm sylinge filter	ThermoFisher SCIENTIFIC	09-719A
HEPES	Sigma	H3375
MgCl2	Sigma	M8266
KCl	Sigma	P9333
Glycerol	Sigma	G9012
Triton X-100	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP151-100
EDTA	Sigma	3609
MOPS	Sigma	M1254
EGTA	Sigma	E3889
Sucrose	Sigma	S7903
Tris-base	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP152-1
HCL	Sigma	H1758
PBS	Lonza	17-512F
Cell Scraper	FALCON	353085
Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	ThermoFisher SCIENTIFIC	78440
Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles	Thomas Scientific	3432S90
Tween-20	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP337-500
BSA	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP1600-100
8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	BIO RAD	4561104
Mini Trans-Blot Module	BIO RAD	1658030
Trans-Blot Turbo Transfer System	BIO RAD	1704150
Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit	BIO RAD	1704272
Clarity Western ECL Blotting Substrates	BIO RAD	1705060
Restore Western blot stripping buffer	ThermoFisher SCIENTIFIC	21059
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher SCIENTIFIC	11965-092
Sonicator, Medel: FB120	ThermoFisher SCIENTIFIC	695320-07-12