Isolement des glandes mammaires de souris intacte, toute analyse d’Expression de la matrice extracellulaire et la morphologie de la glande

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des souris entière et intacte pour étudier l’expression de la matrice extracellulaire (ECM) et de la morphologie ductal des glandes mammaires. La souris #4 glandes abdominales ont été extraits des 8-10 semaines vieux nullipares les souris femelles, fixés dans du formol tamponné neutre, sectionnés et colorés par immunohistochimie pour protéines ECM.

Résumé

Cette procédure visait à récolter les #4 abdominale des glandes mammaires des femelles nullipares afin d’évaluer l’expression de l’ECM et architecture canalaire. Ici, une petite poche sous la peau a été créée à l’aide de ciseaux de Mayo, permettant une séparation des glandes dans le tissu sous-cutané de la péritoine sous-jacent. Visualisation des glandes ont été facilitée par l’utilisation de 3.5 loupes micro chirurgical x-R. La dépouille a été inversée et épinglé de retour permettant d’identifier les coussinets adipeux mammaires intacts. Chacune des glandes abdominales #4 a été carrément disséqué en faisant glisser la lame de bistouri Swann-Morton latéralement entre les glandes et la couche sous-cutanée. Immédiatement après la récolte, les glandes ont été placés dans 10 % de formol tamponné neutre pour le traitement des tissus ultérieures. L’excision de la glande entière est avantageuse car elle élimine principalement le risque d’exclure les tissus à l’échelle des interactions importantes entre les cellules épithéliales canalaires et autres populations cellulaires micro-environnementales qui pourraient manquer dans une biopsie partielle. Un inconvénient de la méthode est l’utilisation de coupes sériées de tissus fixés qui limite les analyses d’expression canalaire de la morphogénèse et la protéine à des endroits distincts au sein de la glande. Par conséquent, changements dans l’expression d’architecture et protéines canalaire en 3 dimensions (3D) n’est pas vérifiable. Dans l’ensemble, la technique est applicable aux études exigeant des glandes mammaires murins ensemble intacts pour les enquêtes en aval telles que le cancer morphogénèse ou du sein canalaire du développement.

Introduction

Le cancer du sein se caractérise par un degré important de tissu fibrose^1,2,3,4. Dénommé l’ECM, cette entité non cellulaire se trouve à des degrés divers dans tous les tissus et se compose principalement d’un réseau complex de collagènes fibrillaires et non fibrillaire, élastine et de glycoprotéines en plus de diverses molécules de signalisation qui sont séquestré dans cette matrice. Dans des conditions homéostatiques, la déposition et la dégradation de l’ECM est étroitement contrôlée. ⁵ au cours de la tumorigenèse mammaire, le solde du dépôt de l’ECM et la dégradation est perturbé. Ainsi, les tumeurs du sein ont été signalés pour exprimer les protéines ECM abondantes telles que les collagènes, fibronectine et ténascine C entre autres. ⁶ l’expression anormale de ces protéines en plus de patrons une augmentation de la réticulation à matrice a été documentée pour promouvoir du sein tumeur progression, métastases et thérapie résistance^{1,3, 4,7,8,9}.

Pour évaluer la composition de l’ECM et morphologie canalaire, isolement d’intact glande mammaire a été effectuée. Ici, nous avons utilisé des souris femelles nullipares déficients pour cavéoline-1, une protéine intégrale de membrane qui est reliée à un agressif du sein tumeur signature^10,11,12et contrôler les femmes nullipares B6 souris. Traitement et la souillure de ces tissus histologiques permis d’identifier plusieurs protéines ECM ainsi que la caractérisation de la morphologie canalaire.

Dans l’ensemble, l’isolement des glandes mammaires intacts, tout donne aux chercheurs la possibilité d’étudier les tissus à l’échelle des changements morphologiques ou cellulaires survenant en réponse à des facteurs exogènes ou endogènes. Inconvénients de la technique sont associés aux analyses de 2 sections de tissu de dimensions (2D) par opposition à une perspective 3D, ce qui donnerait une image plus complète de la morphologie complexe de l’arbre canalaire. Compte tenu de la complexité des interactions cellule-cellule et cellule-ECM qui se déroulent dans la glande mammaire, l’isolement des glandes entières et intactes est avantageuse pour analyser efficacement une expression morphologie et protéine canalaire dans diverses régions de la murine mammaire glande.

Protocole

procédures sur des sujets animaux au présent protocole ont été examinés et approuvés par le Comité de l’urbanisme de la faculté de médecine ostéopathique de Philadelphie et d’institutionnels animalier et toutes les techniques se sont déroulées sous stricte lignes directrices éthiques.

1. échantillon approvisionnement et traitement

1. Sélectionner la matière animale et la place dans une chambre de CO ₂. Pour cette expérience, utiliser 8-10 semaine vieille femelle B6 nullipares. CG-Cav1tmMIs/J et C57BI/6J.
2. Tour sur le débit de gaz de 30 à 40 %. Une fois que l’animal est visiblement inconscient après environ 2 min, ouvrir le robinet de gaz à pleine pression pendant un 5 min supplémentaires
   NOTE : Confirmer animale mort en observant les signes visibles de la respiration (par exemple le mouvement de la poitrine) pour une période de 10 min après la cessation de la livraison de CO ₂. Si l’animal est encore en vie, il peut être placé retour dans la chambre de CO ₂. Dislocation cervicale peut également être utilisée même si elle n’est pas recommandé, car le sang peut s’accumuler autour de la glande mammaire, interférant avec la dissection et les résultats.
3. Suite de sacrifice, épingler la carcasse dans une position en décubitus dorsal et saturer avec de l’éthanol à 70 %.
4. Pincer la peau juste au-dessus du pubis avec une pincette et nick avec des petits ciseaux chirurgicaux. Tourner les ciseaux, coupez la peau le long de la ligne de médiane ventrale moving caudale à crânienne.
5. Avec des grands ciseaux ou une pince hémostatique, carrément disséquer le fascia sous-cutané au niveau bilatéral, utilisation attention ne pas de perforation du péritoine. Couper le long des marges horizontales aux extrémités distales de l’incision.
6. Pin la peau volets ouvert et vaporiser avec l’éthanol à 70 %.
   Remarque : Bien que l’utilisation de l’éthanol à 70 % autorisée meilleure distinction visuelle entre la glande et le tissu sous-cutané environnant, veillez à éviter le séchage des tissus par suite de l’utilisation de cette solution. Pour éviter le séchage, retirer la glande dans un délai ne devant ne pas dépasser 4 min. Comme alternative à l’éthanol à 70 %, l’enquêteur peut également remplacer un tampon isolat général, tels que PBS 1 x, pour éviter le dessèchement des tissus.
7. Localiser les glandes mammaires d’intérêt, glissez une lame de bistouri #4 à l’intérieur des volets pelt, coupant la glande mammaire et associé adipeux cutané exempt de derme.
   NOTE : 3.5 x loupes micro chirurgicales peut aider à la visualisation plus facile des glandes.
8. Submerger immédiatement gland nouvellement isolé en tube à fond conique contenant 10:1 solution-tissu volume de 10 % de formol tamponné neutre pendant 24-48 h
   Remarque : Selon intention d’étude, nombreux fixatifs alternatifs peuvent être utilisés comme paraformaldéhyde, éthanol pour les études génomiques et RNA disponible dans le commerce, préserver les zones tampons.
9. Suivre les protocoles institutionnels pour l’enrobage de paraffine, soumettre des échantillons à un vendeur à la transformation, enrobage et tranchage/plaque de fixation. Section des tissus à 5 µm.
   Remarque : En raison des excès adipeuse glande environnante, envisager la suppression de 100 à 200 µm de tissu avant la coupe et la coloration.

2. Teinture de tissus

1. immunohistochimie
   1. diapositives Place à colorer sur bloc chauffant fixé à 58 ° c pendant 1 h faire fondre la paraffine.
      ATTENTION : Faire fondre la cire de paraffine peut-être exécuter hors diapositive. Suivre de près ou de placer sous glissière pour capturer la cire ruissellement.
      Remarque : Cette étape n’est pas indispensable et peut être ignorée. Si les résultats sont ne pas comme prévu, ajoutant ce recul peut améliorer les résultats.
   2. Incuber les lames dans une diapositive jar contenant 100 % de xylène pendant 30 min, garantissant une immersion complète. Répéter une fois.
      Remarque : À ce stade, inspection visuelle doit être effectuée pour s’assurer que les coupes de tissus sont libres de tissu adipeux et de paraffine. Si le tissu adipeux supplémentaire ou la cire est évidente, la diapositive se re-s’enfoncent dans le xylène. Soyez prudent pour minimiser l’exposition supplémentaire au xylène car ceci peut causer le rétrécissement du tissu.
   3. Tissus de réhydrater dans un bocal de diapositive contenant de l’éthanol à 100 % pendant 10 min. répètent une fois.
   4. Déplacer diapositives dans un bocal diapositive contenant 95 % d’éthanol pour 10 min. répètent une fois.
   5. Déplacer les diapositives une diapositive jar contenant 75 % d’éthanol pendant 5 min.
   6. Déplacer les diapositives une diapositive jar contenant 50 % d’éthanol pendant 5 min.
   7. , Bouillir 10 mM du citrate de sodium solution (pH 6.0) dans une plaque chauffante ou un four à micro-ondes et verser dans de Coplin.
      ATTENTION : Soigneusement surveiller la solution tout en chauffant et veiller à ne pas faire bouillir plus. Conteneur sera très chaud. Utiliser une protection pour éviter les brûlures.
   8. Lentement place glisse dans Coplin jar, assurer l’immersion complète et incuber à 100 ° C pendant 10 min récupérer les épitopes. Retirez et séchez soigneusement les diapositives.
   9. Dessiner une barrière autour de tissus avec un marqueur hydrophobe. Ajouter suffisamment inhibiteur de l’enzyme endogène (peroxyde d’hydrogène et de l’azide de sodium, disponible dans le commerce) pour couvrir le tissu et incuber pendant 10 min.
   10. Diapositives submerge dans le 1 phosphate x solution saline tamponnée (PBS) pendant 10 min.
   11. Ajouter assez sérum âne de 10 % dans du PBS 1 x à couvrir le tissu et incuber pendant 1 heure à température ambiante dans une chambre humidifiée.
       Remarque : L’expérience peut être suspendue ici en stockant les diapositives dans la chambre humidifiée à 4 ° C durant la nuit. Tandis que le sérum de l’âne a été trouvé pour donner des résultats optimaux de coloration, l’enquêteur pourra tester les sérums différents tels que l’albumine sérique bovine (BSA), sérum de chèvre ou de sérum de cheval pour déterminer un résultat optimal. Si vous utilisez BSA, l’enquêteur doit préparer ce frais avant utilisation.
   12. Décanter excès bloqueur de diapositives et ajoutez l’anticorps primaire correctement dilué à 1 % de sérum directement aux diapositives, veiller à ce que le tissu est uniformément couvert en solution. Incuber 30 min à température ambiante dans une chambre humidifiée.
       Remarque : Cette étape peut être poursuivie pour des durées plus longues avec chambre humide conservé à 4 ° C. Assurez-vous d’inclure des lames de bon contrôle négatif (par exemple une diapositive avec aucun anticorps primaire, appelé tissu négatifs, etc.) à cette étape.
   13. Soigneusement les lames par coule environ 1 mL de diH ₂ O sur tissu et incuber dans 1 changement de 1 x PBS pendant 5 min.
   14. PBS excès de décanter et ajouter suffisamment étiquette de peroxydase de raifort pour couvrir le tissu et incuber pendant 30 minutes dans une chambre humidifiée.
       NOTE : À cette étape, l’enquêteur voudra procéder à fluorescent coloration à l’aide d’anticorps secondaires conjugués fluorescent. Si cela est souhaité, les prochaines étapes décrites devront être modifiés en conséquence.
   15. Soigneusement les lames par coule environ 1 mL de diH ₂ O sur tissu et incuber dans 1 changement de 1 x PBS pendant 5 min.
   16. Faire la diaminobenzidine (DAB) plus solution chromogène selon le ratio suggéré du fabricant et mélanger par vortex.
       NOTE : De nombreux kits prêts à l’emploi sont disponibles dans le commerce en dehors de celle utilisée dans le présent protocole.
   17. Decant excès de tampon de diapositives et ajouter 2 à 3 gouttes (10-50 µL) de chromogène tache directement aux tissus et Incuber pendant 5 min dans la chambre humide. Laver soigneusement les diapositives qui coule environ 1 mL diH ₂ O sur tissus.
       ATTENTION : DAB chromogène est hautement toxique. Eviter le contact direct de tache avec peau et recueillir l’écoulement hors déchets dangereux.
2. Hématoxyline et éosine (H & E)
   1. après le rinçage final après incubation chromogène, submerger les diapositives à l’hématoxyline de Harris pour les diapositives de rinçage 2 à 2,5 min. doucement sous l’eau courante pendant 1-2 min.
      Remarque : veiller à ne pas jet direct de l’eau sur les tissus.
   2. Submerge glisse pour 2-3 s dans une solution de différenciation (0,25 mL d’acide chlorhydrique dans 100 mL d’éthanol à 70 %). Rincer les lames doucement sous l’eau courante pendant environ 1-2 min.
   3. Immerger diapositives dans agent bleu (carbonate de calcium 4,5 mg dans 100 mL d’eau robinet, pH ajusté à 9,4) pendant 60 s. diapositives de rinçage dans l’éthanol à 95 % pendant 30 s.
   4. Submerge diapositives d’éosine alcoolique Y pendant 2-3 min.
   5. Déshydrater le tissu en 2 changements d’éthanol à 95 % pendant 1 min de chaque.
   6. Tissu de la déshydratation en 1 changer d’éthanol à 100 % pendant 1 min.
   7. Sécher soigneusement les lames avec un chiffon non pelucheux. Déposer 1 goutte (environ 100-200 µL) de synthèse, non aqueux, médias de glisser et d’appliquer la lamelle couvre-objet de montage à base de résine.
      Remarque : Si une méthode de coloration différente a été élue, un support de montage différent peut être requis. Par exemple, si l’enquêteur a choisi un anticorps secondaire conjugué fluorescent, un montage aqueux serait plus idéal.
   8. Laisser lames définir toute la nuit à température ambiante.
3. Coloration de Picrosirius rouge (PSR)
   1. Sélectionnez diapositives pour colorer et suivre le protocole d’immunohistochemistry jusqu'à l’étape 6 (trempage de l’éthanol à 50 %).
   2. Diapositives de submerge dans PSR tachent pendant 1 h.
   3. Submerger les diapositives à l’acide acétique à 0,5 % pour 1-2 s, deux fois de différencier les tache.
   4. Déshydrater tissus 2 changements d’éthanol à 95 % pendant 1 min chaque.
   5. Tissus de la déshydratation en 1 changer d’éthanol à 100 % pendant 1 min.
   6. Effacer les diapositives en submergeant brièvement dans 100 % xylène pour tout 3-4 s.
   7. Sécher soigneusement les lames avec un chiffon non pelucheux. Déposer 1 goutte (environ 100-200 µL) de synthèse, non aqueux, médias de glisser et d’appliquer la lamelle couvre-objet de montage à base de résine.

3. Analyse de l’échantillon

1. 1. Sélectionnez l' Analyse canalaire lames colorées pour α-SMA. À l’aide d’un microscope optique équipé d’un objectif de caméra montée, recueillir des images représentatives à un grossissement de 20 X.
   2. Using ImageJ (NIH), distinguer et compter les conduits dans chaque image. Ils peuvent être énumérés manuellement ou on peut attribuer un score numérique aux conduits individuels. Pour attribuer un score numérique, ouvrez ImageJ et sélectionnez Plugins. Ensuite sélectionnez analyser et choisissez compteur de cellules dans le menu déroulant. Cliquez sur initialiser, puis mettez en surbrillance de Type 1 pour commencer le marquage des conduits. Lorsque vous avez terminé, sélectionnez les résultats pour afficher le nombre canalaire.
      Remarque : prenez soin de vérifier les structures sont canalaire et non vasculaires.
   3. Dans ' la valeur de mesure ' options, vérifiez ' périmètre ' et ' zone ".
   4. à l’aide de l’outil Polygone à main levée, tracer une ligne autour de chaque conduit au compartiment myoépithéliales (visibilité avec l’aide de α-SMA tache). Sélectionnez ' mesure ' et enregistrer le périmètre et l’aire.
   5. Encore une fois à l’aide de l’outil Polygone à main levée, dessiner une ligne le long du côté apical de l’épithélium canalaire à l’intérieur de la lumière. Sélectionnez ' mesure ' et enregistrer le périmètre et l’aire.
   6. Soustraire le périmètre du compartiment luminal du périmètre du compartiment myoépithéliales afin d’obtenir la circonférence de l’épithélium canalaire. Soustraire de la zone du compartiment luminale de la zone du compartiment pour obtenir la zone de l’épithélium canalaire myoépithéliales.
2. Analyse immunohistochimique
   1. Télécharger des images de fond clair à un logiciel d’analyse, par exemple ImageJ ou Fidji Suite.
      Remarque : Ce protocole décrit les étapes pour la coloration analyse ImageJ et le plugin IHC Toolbox.
   2. Ouvrir la boîte à outils de l’IHC dans le menu Plugin. Dans le " sélectionner un modèle " zone de liste déroulante que s’ouvre, sélectionnez tache approprié (c.-à-d. H-DAB, PSR, etc.). Sélectionnez le " couleur " option pour isoler la tache. Ceci ouvrira une fenêtre de résultats.
      Remarque : Cette méthode est appropriée si une protéine d’intérêt est située dans les espaces extracellulaires ou cytosoliques, ou est liée à la membrane plasmique. Si la protéine d’intérêt est nucléaire, sélectionnant " noyaux " invitera le plugin d’analyser l’image pour les noyaux positivement tachées.
   3. Utiliser le sélecteur de couleur glisser afin d’assurer une isolation correcte de la tache sans fond inclusion ou l’exclusion de l’excessive tache.
      Remarque : Si le mode automatique est incapable de détecter la tache ou ne débouche pas sur des images acceptables, dessinez un carré région d’intérêt (ROI) sur un identifiés teinté de région. Dans la fenêtre boîte à outils IHC, sélectionnez " Train " pour diriger le plugin à la cible appropriée.
   4. Convertir l’image en 16 bits. Aller à Image → Type → 16bits.
   5. Seuil de l’image. Aller à Image → ajuster → Auto seuil.
   6. Définir l’échelle de mesure d’image en traçant une ligne ROI directement au-dessus de la barre d’échelle dans l’image, puis assigner la longueur. Pour définir la barre d’échelle, allez à Analyze → échelle définie. Inscrire le nombre de pixels par l’unité de longueur (par exemple 120 pixels par 50 µm).
   7. Mesurer la surface résultante et gris valeur moyenne. Allez dans Analyze → définir des mesures et recueillir la mesure en cliquant sur Analyze → mesure.

Résultats

Des souris femelles ont 5 paires de glandes mammaires. Plus précisément, il y a une paire de ganglions cervicaux (#1), deux paires de glandes thoracique (#2 et #3), une paire de glandes abdominales (#4) et 1 paire de glandes inguinales (#5) (Figure 1A). Ici, nous avons isolé les glandes #4 où ils sont facilement identifiables. Dans certaines circonstances, les glandes fois #4 et #5 ont été isolés ensemble car la distinction entre les d...

Discussion

Dans le livre, nous avons décrit une technique pour isoler les glandes mammaires souris intactes pour les analyses histologiques en aval d’expression de l’ECM et morphologie canalaire. En ce qui concerne les analyses de morphologie canalaire, cette méthodologie permet l’enquête rapide d’architecture canalaire basé sur des coupes histologiques colorées. Autres méthodes d’analyse canalaire s’appuient sur des injections de colorants pour permettre la visualisation de l’arborescence canalaire, méthodes q...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Light Microscope	Olympus	BX43
Microscope Camera	Olympus	DP73
Image Analysis Software	Olympus	cellSens Entry software
	NIH	ImageJ
3.5x-R Surgical Micro Loupes	Rose Micro Solutions		Magnification at researcher's preference
Mayo Scissors	Medline	DYND04035
Staining Rack	Fisher Scientific	121
Staining Dish	Fisher Scientific	112
Coplin Jars	Fisher Scientific	19-4
Glass coverslips	Fisher Scientific	12-550-15	Size appropriate for tissue
IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+)	Dako	K400611-2
Picrosirius Red Kit	Abcam	AB150681
Eosin Y, alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110132
Harris Hematoxylin	Sigma-Aldrich	HHS16
Donkey Serum	EMD Millipore	S30
10% Neutral Buffered Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128
Xylenes, Reagent Grade	Sigma-Aldrich	214736
Ethanol, 200 proof	Sigma-Aldrich	792780	suitable for molecular biology
Phosphate Buffered Saline, 1x	Gibco	10010023
Sodium Citrate	Fisher Scientific	S279-500
Calcium Carbonate	Sigma-Aldrich	202932
Permanent Mounting Medium	Dako	S1964
Eukitt's Mounting Medium	Sigma-Aldrich	3989
Fibronectin antibody	Abcam	AB23750
Tenascin-C antibody	Abcam	AB108930
Alpha Smooth Muscle Actin antibody	Abcam	AB124964
Dako Envision Dual Link System HRP	Dako	K4065