Isolamento de glândulas mamárias de Mouse intacto, todo para a análise da expressão de matriz extracelular e morfologia da glândula

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação do rato inteiro, intacto, glândulas mamárias para investigar a expressão da matriz extracelular (ECM) e morfologia ductal. Mouse #4 glândulas abdominais foram extraídas dos ratos de 8-10 semanas nulíparas fêmeas, fixados em formalina tamponada neutra, seccionado e manchado usando imuno-histoquímica para proteínas de ECM.

Resumo

O objetivo deste procedimento foi colher as glândulas mamárias abdominal de #4 dos ratos fêmeas nulíparas a fim de avaliar a expressão de ECM e arquitetura ductal. Aqui, um pequeno bolso abaixo da pele foi criado com uma tesoura de Mayo, permitindo a separação das glândulas dentro do tecido subcutâneo do peritônio subjacente. Visualização das glândulas foi auxiliada pelo uso de 3.5 lupas micro cirúrgicas x-R. O pelt foi invertido e preso de volta que permite identificação das almofadas de gordura mamárias do intactas. Cada uma das glândulas abdominais #4 sem rodeios foi dissecada deslizando a lâmina de bisturi lateralmente entre a camada subcutânea e as glândulas. Imediatamente após a colheita, as glândulas foram colocadas em neutro formol a 10% tamponada para processamento subsequente do tecido. Excisão da glândula inteira é vantajosa porque principalmente elimina o risco de excluir importantes interações de todo o tecido entre as células epiteliais Ductais e outras populações celulares microenvironmental que podem ser perdidas em uma biópsia parcial. Uma desvantagem da metodologia é o uso de seções seriais de tecidos fixos que limita as análises de expressão ductal de morfogênese e proteína para locais discretos dentro da glândula. Como tal, mudanças na expressão de arquitetura e proteína ductal em 3 dimensões (3D) não é prontamente obteníveis. Em geral, a técnica é aplicável a estudos exigindo toda intactas murino as glândulas mamárias para investigações a jusante, tais como câncer de peito ou morfogênese ductal do desenvolvimento.

Introdução

Câncer de mama é caracterizado por um grau substancial de tecido fibrose^1,2,3,4. Conhecido como o ECM, esta entidade não celular encontra-se em diferentes graus em todos os tecidos e é composta principalmente de uma malha complexa de fibrillar e não-fibrillar colágenos, elastina e glicoproteínas, além de várias moléculas de sinalização que estão isolado nesta matriz. Sob condições homeostáticas, a deposição e a degradação de ECM é rigidamente controlado. ⁵ durante a tumorigênese da mama, o equilíbrio da deposição de ECM e degradação é interrompido. Como tal, tumores de mama têm sido relatados para expressar proteínas abundantes de ECM como colágenos, fibronectina e tenascin-C, entre outros. ⁶ a expressão anormal destas proteínas além de padrões de aumento de reticulação de matriz tem sido documentada para promover mama tumor progressão, metástase e terapia resistência^{1,3, 4,7,8,9}.

Para avaliar a composição de ECM e morfologia ductal, realizou-se o isolamento de intactas as glândulas mamárias. Aqui, usamos fêmeas nulíparas camundongos deficientes para caveolin-1, uma proteína integral de membrana que tem sido associada a um agressivo tumor assinatura^10,11,12de mama e controlar fêmeas nulíparas B6 ratos. Processamento histológico e coloração desses tecidos permitiu a identificação de várias proteínas de ECM, juntamente com a caracterização da morfologia ductal.

No geral, o isolamento de todo, intactos glândulas mamárias dá pesquisadores a oportunidade de investigar mudanças morfológicas ou celulares todo o tecido que ocorrem em resposta a fatores exógenos ou endógenos. Desvantagens da técnica são associadas com as análises de 2 secções de tecido de dimensão (2D) em oposição a uma perspectiva 3D, o que renderia uma imagem mais completa da morfologia complexa da árvore ductal. Dada a complexidade das interações célula-célula e célula-ECM que ocorrem na glândula mamária, o isolamento das glândulas inteira, intactas é vantajoso para analisar eficientemente ductal expressão morfologia e proteínas em várias regiões da mamária o murino glândula.

Protocolo

procedimentos envolvendo assuntos animais neste protocolo foram revistos e aprovados pelo Comité de utilização da faculdade de Medicina Osteopática de Filadélfia e institucional Cuidado Animal e todas as técnicas foram conduzidas sob rigorosas as diretrizes éticas.

1. amostra de aquisição e processamento de

1. selecione assunto animal apropriado e coloque em uma câmara de ₂ CO. Para este experimento, usar a semana de 8-10 velho fêmeas nulíparas B6. CG-Cav1tmMIs/J e C57BI/6-j.
2. Vez no fluxo de gás de 30-40%. Uma vez que o animal está visivelmente inconsciente após cerca de 2 min, abra a válvula de gás à pressão completa um adicional 5 min.
   Nota: Confirme a morte de animais, observando sinais visíveis de respiração (por exemplo, o movimento do tórax) durante um período de 10 min após a cessação do CO ₂ entrega. Se o animal ainda está vivo, podem ser colocado em câmara de CO ₂. Deslocamento cervical também pode ser utilizado, embora não seja recomendável como sangue pode acumular-se em torno de glândulas mamárias, interferindo com a dissecção e resultados.
3. Após o sacrifício, pino carcaça em posição supina e saturar com etanol a 70%.
4. Beliscar a pele logo acima do púbis usando fórceps e nick com pequena tesoura cirúrgica. Girando a tesoura, corte a pele ao longo da linha mediana ventral que movendo caudal ao craniana.
5. Com uma tesoura maior ou com uma pinça hemostática, sem rodeios dissecar a fáscia subcutânea bilateralmente, com cuidado para não perfurar o peritoneu. Corte ao longo das margens horizontais em ambas as extremidades distais da incisão.
6. Pino de peles retalhos abrir e borrife novamente com etanol a 70%.
   Nota: Embora permitida a utilização de etanol a 70% melhor distinção visual entre a glândula e o tecido subcutâneo, tenha cuidado para evitar a secagem do tecido como resultado da utilização desta solução. Para evitar a secagem, retire a glândula em um período de tempo não deve exceder 4 min. Como uma alternativa ao etanol a 70%, o investigador também pode substituir uma reserva geral isolada, como a PBS 1x, para evitar a dessecação do tecido.
7. Localizar as glândulas mamárias de interesse, deslize uma lâmina de bisturi #4 ao longo do interior dos flaps de pele, corte da glândula mamária e adiposo cutâneo associado livre da derme.
   Nota: 3.5 x lupas cirúrgicas micro pode ajudar na visualização mais fácil das glândulas.
8. Imediatamente submergir glândula recém isolada em tubo cônico contendo o volume de solução de 10:1-tecido de formol tamponado neutro a 10% por 24-48 h.
   Nota: Dependendo da intenção do estudo, muitos fixadores alternativos podem ser usadas como paraformaldeído, etanol para estudos genômicos e comercialmente disponível RNA preservando buffers de.
9. Seguem protocolos institucionais para a incorporação de parafina, enviar amostras a um fornecedor para transformação, incorporação e corte/montagem de slide. Secção de tecidos em 5 µm.
   Nota: Devido ao excesso adiposa circundante glândula, considere remover 100-200 µm de tecido antes do corte e coloração.

2. Coloração do tecido

1. Immunohistochemistry
   1. slides de lugar para ser manchado no bloco térmico fixado em 58 ˚ c por 1h derreter parafina.
      Cuidado: Derretimento da cera de parafina pode fugir de slide. Acompanhar de perto ou coloque compressa sob slide para capturar cera escoamento.
      Nota: Este passo não é essencial e pode ser ignorado. Se os resultados não são tão esperado, adicionar este passo atrás pode melhorar os resultados.
   Slides de incubar
   2. em um slide jar contendo xileno 100% por 30 min, garantindo a completa submersão. Repetir uma vez.
      Nota: neste ponto, inspeção visual deve ser realizada para garantir que cortes histologicos são livres de tecido adiposo e parafina. Se adicional de tecido adiposo ou cera é evidente, o slide deve ser re-submersa em xilol. Tenha cuidado para minimizar a exposição adicionada ao xileno, pois isso pode causar encolhimento do tecido.
   3. Tecidos de hidratar num frasco slide contendo 100% de etanol de 10 min. repetem uma vez.
   4. Mover slides para um frasco de slide contendo etanol a 95% durante 10 min. repetem uma vez.
   5. Mover slides um slide frasco contendo 75% de etanol por 5 min.
   6. Mover slides um slide frasco contendo 50% de etanol por 5 min.
   7. Solução de citrato de sódio de 10 mM (pH 6,0) em uma chapa quente ou um microondas de ferver e despeje em uma jarra de Coplin.
      Cuidado: Cuidadosamente monitorar solução ao aquecimento e tomar cuidado para evitar ferver sobre. O recipiente será muito quente. Use proteção para evitar queimaduras.
   8. Lentamente lugar slides em Coplin jar, garantindo a completa submersão e incubam a 100 ° C por 10 min recuperar os resumos. Retire e seque cuidadosamente slides.
   9. Desenhar uma barreira em torno do tecido com um marcador hidrofóbico. Adicionar suficiente bloqueador de enzima endógena (peróxido de hidrogênio e azida de sódio, disponível comercialmente) para cobrir o tecido e incubar durante 10 min.
   10. Slides de submergir em 1 fosfato x tampão salino (PBS) durante 10 min.
   11. Adicionar soro suficiente burro de 10% em PBS 1x para cobrir o tecido e incubar por 1h à temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
       Nota: O experimento pode ser pausado aqui armazenando os slides na câmara umidificada a 4 ° C durante a noite. Enquanto o soro burro foi encontrado para produzir óptimos resultados de coloração, o investigador pode desejar testar diferentes soros como albumina de soro bovino (BSA), soro de cabra ou soro de cavalo para determinar os resultados ideais. Se usando BSA, o investigador deve preparar este fresco antes da utilização.
   12. Decantar excesso bloqueador de slides e adicione anticorpo primário corretamente diluído em 1% de soro diretamente para slides, garantindo que o tecido é uniformemente coberto em solução. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
       Nota: Este passo pode ser continuado por períodos mais longos de tempo com câmara húmida armazenada em 4 ° C. Certifique-se de incluir slides adequado controlo negativo (por exemplo, um slide com nenhum anticorpo primário, conhecido antígeno negativo tecido, etc.) neste passo.
   13. Cuidadosamente lave slides fluindo cerca de 1ml de diH ₂ O sobre tecido e incubar em 1 troca de 1X PBS durante 5 min.
   14. Decantar excesso PBS e adicionar suficiente rótulo de peroxidase de rábano para cobrir o tecido e incube por 30 min em uma câmara umidificada.
       Nota: Neste passo, o investigador poderá proceder à fluorescente coloração usando anticorpos secundarios conjugados fluorescente. Se isto for desejado, os próximos passos descritos devem ser modificados em conformidade.
   15. Cuidadosamente lave slides fluindo cerca de 1ml de diH ₂ O sobre tecido e incubar em 1 troca de 1X PBS durante 5 min.
   16. Fazer diaminobenzidina (DAB) mais solução de cromogénio, de acordo com a proporção sugerida do fabricante e misture por vórtice.
       Nota: Muitos kits pré-fabricados são comercialmente disponíveis além de um usado neste protocolo.
   17. Decantar excesso de buffer de slides e adicione 2-3 gotas (10-50 µ l) de cromogénio mancha diretamente para os tecidos e incube durante 5 min em câmara úmida. Lavar cuidadosamente slides por fluxo cerca de 1 mL diH, ₂ O sobre tecido.
       Cuidado: DAB-cromogénio é altamente tóxico. Evitar contato direto da mancha com fluxo de pele e cobrar fora de resíduos perigosos.
2. Hematoxilina e eosina (H & E)
   1. após o enxágue final após incubação de cromogénio, submergir slides em hematoxilina de Harris para slides de 2 a 2,5 min. enxaguar delicadamente sob água da torneira por 1-2 min.
      Nota: tenha cuidado para evitar jacto directo de água sobre tecidos.
   2. Submergir desliza para 2-3 s em solução de diferenciação (0,25 mL de ácido clorídrico em 100 mL de etanol a 70%). Enxágue desliza suavemente sob água da torneira para cerca de 1-2 min.
   3. Submergir slides em agente azul (4,5 mg de carbonato de cálcio em 100 mL de água de torneira, pH ajustado para 9,4) para 60 slides de enxaguamento s. em etanol a 95% por 30 s.
   4. Slides de submergir em alcoólica eosina Y para 2-3 min.
   5. Desidratar o tecido em 2 trocas de etanol a 95% por 1 min cada.
   6. Desidratando tecido em 1 mudar de etanol 100% por 1 min.
   7. Slides cuidadosamente secos com uma limpeza de fiapos. Aplique 1 gota (aproximadamente 100-200 µ l) sintético, aquosos, resina à base de montagem de mídia para deslizar e lamela.
      Nota: Se um método de coloração diferente foi eleito, uma mídia de montagem diferente poderá ser necessária. Por exemplo, se o investigador escolheu um anticorpo secundário conjugado fluorescente, um monte de aquoso seria mais ideal.
   8. Permitir slides definir a noite à temperatura ambiente.
3. Coloração de Picrosirius vermelho (PSR)
   1. selecione slides para ser manchado e seguir o protocolo de imuno-histoquímica através do passo 6 (embeber de 50% de etanol).
   2. Slides de submergir no PSR macular durante 1 h.
   3. Submergir slides em 0,5% de ácido acético para s 1-2, duas vezes para diferenciar mancha.
   4. Desidratar tecidos em 2 trocas de etanol a 95% por 1 min cada.
   5. Desidratando tecidos em 1 mudar de etanol 100% por 1 min.
   6. Clara slides submergindo brevemente em 100% de xilol para sobre 3-4 s.
   7. Slides cuidadosamente secos com uma limpeza de fiapos. Aplique 1 gota (aproximadamente 100-200 µ l) sintético, aquosos, resina à base de montagem de mídia para deslizar e lamela.

3. Análise da amostra

1. Análise Ductal
   1. selecione lâminas coradas para α-SMA. Usando um microscópio óptico equipado com um câmera montada objetivo, coletar imagens representativas na ampliação de 20 X.
   2. Usando o ImageJ (NIH), distinguir e contar os dutos em cada imagem. Estas podem ser enumeradas manualmente ou se pode atribuir uma pontuação numérica às condutas individuais. Para atribuir uma pontuação numérica, abra o ImageJ e selecione Plugins. Em seguida selecione a analisar e escolher o contador de célula do menu drop-down. Clique em Initialize então destacar tipo 1 para começar a etiquetar dutos. Ao terminar, selecione resultados para exibir a contagem ductal.
      Nota: tenha cuidado para verificar estruturas são ductal e não vascular.
   3. Em ' conjunto de medição ' opções, verifique ' perímetro ' e ' área ".
   4. Usando a ferramenta polígono à mão livre, desenhar uma linha ao redor de cada duto no compartimento do mioepiteliais (visibilidade auxiliada pela mancha de α-SMA). Selecione ' medida ' e gravar o perímetro e área.
   5. Novamente usando a ferramenta polígono à mão livre, desenhe uma linha ao longo da parte apical do epitélio ductal no interior do lúmen. Selecione ' medida ' e gravar o perímetro e área.
   6. Subtrair do perímetro do compartimento luminal do perímetro do compartimento mioepiteliais para obter a circunferência do epitélio ductal. Subtrair da área do compartimento luminal da área do compartimento para obter a área do epitélio ductal mioepiteliais.
2. Análise imuno-histoquímica
   1. Upload de imagens brightfield para um software analítico, como o ImageJ ou FIJI Suite.
      Nota: Este protocolo descreve as etapas para coloração análise usando o ImageJ e o plugin de ferramentas IHC.
   2. Abrir o Toolbox de IHC no menu Plugin. Na " selecionar modelo " caixa de combinação que abre, selecione o apropriado mancha (ou seja, H-DAB, PSR, etc.). Selecione o " cor " opção para isolar a mancha. Isto irá abrir uma janela de resultado.
      Nota: Este método é apropriado se uma proteína de interesse situa-se nos espaços extracelulares ou citosol, ou está vinculada a membrana plasmática. Se a proteína de interesse é nuclear, selecionando " núcleos " solicitará o plugin para analisar a imagem para núcleos positivamente manchadas.
   3. Usar o deslize de seletor de cor para garantir um isolamento adequado da mancha sem fundo de inclusão ou exclusão de mancha excessiva.
      Nota: Se o modo automático é incapaz de detectar a mancha ou não resulte em imagens aceitáveis, desenhe um quadrado de região de interesse (ROI) sobre um identificados manchado a região. Na janela de ferramentas de IHC, selecione " trem " para direcionar o plugin para o destino apropriado.
   4. Converter a imagem de 16 bits. Vá para imagem → tipo → 16bit.
   5. Limite a imagem. Vá para imagem → ajustar → Auto limiar.
   6. Definir a escala de medição de imagem desenhando uma linha ROI directamente por cima da barra de escala da imagem, em seguida, atribuir o comprimento. Para definir a barra de escala, vá para Analyze → definir escala. O número de pixels pela unidade desejada de comprimento (por exemplo, 120 pixels por 50 µm) de entrada.
   7. Medir a área resultante e quer dizer valor cinza. Vá para Analyze → definir medidas e recolher a medição clicando Analyze → medida.

Resultados

Ratos fêmeas têm 5 pares de glândulas mamárias. Especificamente, há um par de glândulas do colo do útero (#1), dois pares de glândulas torácicas (#2 e #3), um par de glândulas abdominais (#4) e 1 par de glândulas inguinais (#5) (Figura 1A). Aqui, isolamos as glândulas #4 como eles são facilmente identificáveis. Em algumas circunstâncias, ambos #4 e #5 glândulas foram isoladas juntos como distinção entre os dois era difícil....

Discussão

No artigo, descrevemos uma técnica para isolar as glândulas mamárias rato intacta para análise histológica a jusante de expressão ECM e morfologia ductal. No que diz respeito a análises da morfologia ductal, esta metodologia permite a rápida investigação de arquitetura ductal baseada fora de cortes histológicos corados. Outros métodos de análises Ductais dependem de injeções de corantes para permitir a visualização da árvore ductal, métodos que podem ser tecnicamente desafiador e demorado.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Light Microscope	Olympus	BX43
Microscope Camera	Olympus	DP73
Image Analysis Software	Olympus	cellSens Entry software
	NIH	ImageJ
3.5x-R Surgical Micro Loupes	Rose Micro Solutions		Magnification at researcher's preference
Mayo Scissors	Medline	DYND04035
Staining Rack	Fisher Scientific	121
Staining Dish	Fisher Scientific	112
Coplin Jars	Fisher Scientific	19-4
Glass coverslips	Fisher Scientific	12-550-15	Size appropriate for tissue
IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+)	Dako	K400611-2
Picrosirius Red Kit	Abcam	AB150681
Eosin Y, alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110132
Harris Hematoxylin	Sigma-Aldrich	HHS16
Donkey Serum	EMD Millipore	S30
10% Neutral Buffered Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128
Xylenes, Reagent Grade	Sigma-Aldrich	214736
Ethanol, 200 proof	Sigma-Aldrich	792780	suitable for molecular biology
Phosphate Buffered Saline, 1x	Gibco	10010023
Sodium Citrate	Fisher Scientific	S279-500
Calcium Carbonate	Sigma-Aldrich	202932
Permanent Mounting Medium	Dako	S1964
Eukitt's Mounting Medium	Sigma-Aldrich	3989
Fibronectin antibody	Abcam	AB23750
Tenascin-C antibody	Abcam	AB108930
Alpha Smooth Muscle Actin antibody	Abcam	AB124964
Dako Envision Dual Link System HRP	Dako	K4065