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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Capillaires cérébraux isolés du tissu de cerveau humain peuvent servir comme un modèle préclinique pour étudier la fonction de barrière dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Nous présentons ici un protocole optimisé pour isoler les capillaires du cerveau du tissu de cerveau humain frais.

Résumé

Comprendre la fonction de barrière hémato - encéphalique dans des conditions physiologiques et physiopathologiques est essentielle pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques qui tiennent la promesse d’améliorer la livraison de drogue cerveau, améliorer la protection du cerveau et traiter le cerveau les troubles. Cependant, il est difficile d’étudier la fonction de barrière hématoméningée humaine. Ainsi, il y a un besoin crucial pour les modèles appropriés. À cet égard, capillaires de cerveau isolés à partir des tissus cérébraux humains représentent un outil unique pour étudier la fonction de barrière comme proche de la situation humaine in vivo que possible. Nous décrivons ici un protocole optimisé pour isoler les capillaires du tissu de cerveau humain à un rendement élevé et avec une pureté et une qualité constante. Capillaires sont isolés du tissu de cerveau humain frais utilisant la filtration, centrifugation de gradient de densité et homogénéisation mécanique. Après l’isolement, les capillaires du cerveau humain peuvent être utilisés pour diverses applications, notamment les tests de fuite, l’imagerie de cellules vivantes et analyses immunitaire pour étudier l’expression des protéines et la fonction, l’activité enzymatique ou signalisation intracellulaire. Cerveau humain isolé capillaires sont un modèle unique d’élucider la régulation de la fonction de barrière hématoméningée humaine. Ce modèle peut donner un aperçu de la pathogenèse du système nerveux central (SNC), qui contribuera à l’élaboration de stratégies thérapeutiques pour le traitement des troubles du SNC.

Introduction

La barrière hémato - encéphalique est une interface étroitement contrôlée entre le sang et le cerveau qui détermine ce qui se passe dans et sort du cerveau. Anatomiquement, cellules endothéliales composent la barrière hémato - encéphalique et forment un réseau capillaire complexe et continu. Physiologiquement, ce réseau capillaire alimente le cerveau en oxygène et en nutriments tout en simultanément élimination du dioxyde de carbone et les déchets métaboliques. Ce qui est important, la preuve étaye que les modifications apportées à la barrière contribuent à nombreuses pathologies comme la maladie d’Alzheimer, l’épilepsie et AVC1,2,3,4,5 , 6 , 7. cerveau cellules endothéliales servent également un obstacle au traitement en bloquant l’absorption de drogues dans le cerveau, par exemple., chimiothérapie du glioblastome multiforme suite tumeur résection8,9, 10. À cet égard, les capillaires du cerveau humain isolé représentent un modèle de barrière hémato - encéphalique unique ex vivo qui ressemble étroitement à barrière propriétés in vivo, qui permet l’étude de la fonction de barrière et de dysfonctionnement en santé et la maladie. Dans cet article, nous fournissons un protocole visant à isoler les capillaires du cerveau du cerveau humain à une qualité constante capillaire et le rendement afin d’étudier la barrière hémato - encéphalique.

En 1969, Siakotos et al. 11 ont été le premier à signaler l’isolement des capillaires de cerveau du tissu de cerveau bovines et humaines utilisant la densité gradient centrifugation et verre perle colonne séparation. Plus tard, Goldstein et al. 12 ce procédé amélioré en ajoutant plusieurs étapes de filtration pour diminuer la quantité de tissu nécessaire pour étudier les capillaires de cerveau isolées de rats, tout en maintenant l’activité métabolique du transport du glucose. Depuis lors, les chercheurs optimisé la technique d’isolation capillaire maintes fois, amélioration du procédé et cerveau modèle capillaire avec chaque itération13,14,15. Par exemple, airelles et al. 16 isolé bovines capillaires à l’aide de la digestion enzymatique et non homogénéisation mécanique et puis par la suite passé une suspension capillaire à travers un filtre à tamis 210 µm et une colonne de perle de verre. Ces modifications amélioré la tache d’exclusion bleu trypan des capillaires cérébraux isolés et ainsi, augmenter la viabilité des cellules endothéliales. Dans les années 1990, Dallaire et al. 17 isolées des bovins et rat des capillaires qui étaient claires de contamination neuronale et maintient l’activité métabolique des γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTase) et la phosphatase alcaline. En 2000, Miller et al. 18, utilisé isolé du rat et des capillaires de cerveau porcin en combinaison avec la microscopie confocale à montrer l’accumulation des substrats de transport dans la lumière des capillaires. Par la suite, notre laboratoire a continué d’optimiser la procédure d’isolement capillaire de cerveau et nous avons établi des essais de transport afin de déterminer la P-glycoprotéine (P-gp)19,20,21, le cancer du sein résistance à la protéine (BCRP)22,23et multirésistance protéine 2 (Mrp2) activité de transport de24 . En 2004, nous avons publié deux rapports où nous avons utilisé des capillaires de cerveau de rat isolé pour enquêter sur les différentes voies de signalisation. Hartz et al. 21, nous avons trouvé que le peptide de l’endothéline-1 rapidement et de façon réversible réduit fonction transport P-gp dans les capillaires de cerveau en agissant par l’intermédiaire du récepteur de l’endothéline récepteur B (ETB), l’oxyde nitrique synthase (NOS) et protéine kinase C (PKC). Dans Bauer et al. 19, nous avons démontré l’expression du récepteur récepteur nucléaire pregnane X (PXR) et montre PXR-modulation de la P-gp expression et transport fonction dans les capillaires du cerveau. Dans des expériences avec des souris transgéniques de PXR humanisés, nous avons élargi cette ligne de recherche et montré in vivo de serrage de la barrière de ses P-gp et hPXR activation25. En 2010, Hartz et al. 26 a utilisé cette méthode pour restaurer l’expression des protéines P-gp et transporter l’activité chez les souris de protéine (hAPP) précurseur de l’amyloïde humain transgénique qui surexpriment hAPP. En outre, rétablir la P-gp dans hAPP souris réduit significativement la bêta-amyloïde (Aß)40et taux bêta-amyloïdes dans le cerveau42.

En plus d’étudier les voies de signalisation, les capillaires cérébraux isolés peuvent être utilisés pour déterminer les changements dans la perméabilité capillaire que nous appelons une fuite capillaire. En particulier, le test de fuite de Texas Red est utilisé pour évaluer la fuite du colorant fluorescent Texas rouge de la lumière capillaire dans le temps et ces données sont ensuite utilisées pour analyser le taux de fuite. Les taux de fuite capillaire accrue par rapport à celles des capillaires de contrôle indiquent des changements dans l’intégrité physique de la barrière hémato - encéphalique2. C’est précieux parce qu’il y a de nombreux états pathologiques liés à la rupture de la barrière, par exemple., épilepsie, sclérose en plaques, la maladie d’Alzheimer et traumatisme cérébral lésion27,28,29, 30. Autres groupes ont également utilisé des capillaires isolées pour discerner les voies de signalisation qui régulent l’expression de la protéine et l’activité de transport des protéines31,32,33,34, 35,36,37. Enfin, nous avons continué à optimiser cette méthode pour l’isolement des capillaires du cerveau humain et, récemment, nous avons montré expression accrue de la P-gp à l’humaine barrière hémato - encéphalique chez les patients atteints d’épilepsie par rapport aux individus de témoin sans saisie38 . Pris ensemble, ces développements démontrent que les capillaires cérébraux isolés peuvent servir d’un modèle polyvalent pour étudier la fonction de barrière.

Divers in vivo, ex vivoet in vitro de barrière hémato - encéphalique modèles ont été utilisés en recherche fondamentale et de dépistage des drogues industrielle, principalement dans le but de tester des medicaments pour le cerveau39,,40,41 ,42,43,44. Outre isolés ex vivo le capillaires du cerveau, les modèles actuels de barrière hémato - encéphalique comprennent des modèles de in silico , in vitro culture cellulaire des cellules endothéliales des capillaires cérébraux isolés ou de lignées cellulaires immortalisées par divers espèces, la culture in vitro des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) qui se différencient en cellules endothéliales capillaires du cerveau et des modèles sur une puce microfluidique.

In silico modèles sont plus couramment utilisés dans le développement de médicaments pour la sélection des candidats-médicaments basés sur prédite d’absorption, distribution, métabolisme et excrétion (ADME) Propriétés. Méthodes telles que les modèles de relation (QSPR) quantitative structure-propriété et quantitative structure-activité (RQSA) sont des méthodes populaires utilisés dans le criblage à haut débit des bibliothèques pour prédire la pénétration de cerveau de candidats-médicaments 45 , 46. ces modèles sont utiles aux molécules d’écran des propriétés de barrière de la pénétration.

Betz et al. 47 a créé monocouches de cellules endothéliales des capillaires cerveau cultivé comme un système de modèle in vitro barrière hémato - encéphalique. In vitro cell cultures de modèles à l’aide de tissu frais ou lignées de cellules endothéliales immortalisées comme les cellules endothéliales des microvaisseaux cérébrale humaine (hCMECs) peuvent être un autre outil de criblage à haut débit pour la pénétration du cerveau ou des études mécanistes. Cependant, les modèles de culture de cellules endothéliales capillaires cerveau n’ont pas la contrainte de cisaillement physiologique du débit sanguin à l’intérieur de la lumière capillaire, sont limitées à une complexité biologique dans l’ensemble et subissent des changements dans l’expression et la localisation des composants de la barrière importante comme les protéines des jonctions serrées, ion, les transporteurs, les enzymes et les récepteurs de surface de canaux48,49,50. À l’inverse, monocouches endothéliales dérivé de hPSCs, présenter une perméabilité de saccharose faible par rapport aux cultures hCMEC/D3 et contenir l’expression polarisée de certains transporteurs de barrière hémato - encéphalique, molécules d’adhérence et de jonctions serrées51, 52. Cependant, ces cellules sont également sous réserve de modification des propriétés dans la culture et le système doit être validé pour sa récapitulation de in vivo de propriétés de barrière52.

Nouvelles tendances dans la recherche de la barrière hémato - encéphalique incluent utilisant des systèmes de culture de tissu 3D pour créer artificielles capillaires, utilisant la technologie de l’orgue-on-chip pour générer des dispositifs microfluidiques, ou utilisant les fibres creuses technologie53, 54 , 55. les capillaires artificiels, cependant, ont significativement plus grands diamètres (100 – 200 µm) que des capillaires de cerveau (3 – 7 µm). Par conséquent, les forces de cisaillement l’in vitro ne ressemblent pas entièrement à la situation in vivo . Ceci est abordé dans la microfluidique « blood-brain-barrier-on-a-chip », où les membranes artificielles forme « sang » et le « cerveau » compartiments et fluides sont pompés grâce à ces dispositifs de génération de forces de cisaillement microfluidique. De même, des cultures de cellules endothéliales dans différentes combinaisons avec les astrocytes et les cellules musculaires lisses vasculaires ont également été utilisés avec la technologie de fibres creuses pour recréer les paramètres rhéologiques présents sous in vivo des conditions56 , 57 , 58. Toutefois, on ignore comment ce modèle reflète les autres propriétés de la barrière hémato - encéphalique, tels que le transport, le métabolisme, de signalisation et d’autres. Ces modèles capillaire et puce artificiels ne conviennent pas pour le criblage à haut débit des médicaments, mais les cellules utilisées pour générer ces modèles sont également sujettes à modification durant la culture.

Tranches de cerveau gelé et fixe ou cerveau primitif des cultures de cellules endothéliales capillaires sont des modèles supplémentaires qui peuvent être utilisé pourétudier la microcirculation humaine5,59,60,61. Par exemple, immunohistochimie des tissus cérébraux fixe est utilisée pour déterminer la localisation des protéines et expression en bonne santé par rapport aux tissus malades.

En plus de modèles in vitro et de tranches de tissus capillaires du cerveau décrit ci-dessus, fraîchement isolées peuvent être utilisés pour étudier la fonction de barrière hémato - encéphalique. Limites de ce modèle capillaire isolé comprennent la difficulté pour obtenir des tissus du cerveau humain frais, absence d’astrocytes et les neurones et un processus relativement long isolement. Un avantage du modèle capillaires cérébraux isolés est que ce modèle ressemble beaucoup à la situation in vivo et, par conséquent, peut être utilisé pour caractériser la dysfonction et la fonction de barrière. Ce qui est important, il peut être également utilisé de discerner les mécanismes de signalisation à l’aide d’une multitude de tests et techniques moléculaires3,19,62,63.

Notre laboratoire a accès à ces deux tissus de cerveau humain frais et surgelés à travers le centre de Sanders-Brown sur le vieillissement (CISR #B15-2602-M)64. Dans ce contexte, les autopsies suivent un protocole standard, les cerveaux est obtenus en < 4 h et toutes les procédures sont conformes aux NIH recueillis de pratiques recommandées,65. Compte tenu de cet accès unique aux tissus du cerveau humain, nous avons établi et optimisé un protocole visant à isoler les capillaires du cerveau du tissu de cerveau humain qui se traduit par un rendement élevé des capillaires de cerveau humain intact et viables. Deux points de terminaison communes d’intérêt sont à déterminer l’expression de la protéine et l’activité. À cet égard, nous et autres avons établi divers tests qui peuvent être utilisés avec les capillaires cérébraux isolés pour étudier l’expression des protéines et des niveaux d’activité. Ces essais incluent Éponger occidental, dosage Simple Western, immuno enzymatique (ELISA), chaîne par polymérase transcription inverse (RT-PCR), PCR quantitative (qPCR), zymographie, tests d’activité de transport, et essais de fuite capillaire. Ces tests permettent aux chercheurs d’étudier des changements en fonction de la barrière dans des conditions pathologiques humaines, déterminer les voies qui régissent l’activité et l’expression de la protéine et identifier les cibles pharmacologiques pour le traitement de la barrière hémato - encéphalique associé maladies.

Prises ensemble, fraîchement capillaires cérébraux isolés peuvent servir de modèle robuste et reproductible de la barrière hémato - encéphalique. Surtout, ce modèle peut être associé à plusieurs différents dosages pour déterminer un large éventail de points de terminaison pour étudier la fonction de barrière.

Protocole

Les informations ci-dessous repose sur la sécurité actuelle et des normes de réglementation à l’Université du Kentucky, Lexington, KY, é.-u.. Par mesure de précaution, se référer au programme de biosécurité de l’institution et les plus récents règlements et recommandations avant de travailler avec les tissus humains.

ATTENTION : Le tissu humain peut être une source de pathogènes à diffusion hématogène, y compris le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), virus de l’hépatite B (VHB), virus de l’hépatite C (VHC) et d’autres. Travailler avec des tissus humains pose le risque d’infection par des pathogènes à diffusion hématogène. Par conséquent, certaines considérations réglementaires et de sécurité sont indispensables lorsque vous travaillez avec des tissus humains pour protéger le personnel de laboratoire. L’utilisation de tissus humains aux Etats-Unis exige un laboratoire de niveau 2 de biosécurité ainsi que de mesures de sécurité et de formation conformément aux NIH Section IV-B-7, Loi OSHA de 1970 Clause 5(a)(1) et programme de biosécurité institutionnels de l’utilisateur. En général, approbation Comité institutionnel de biosécurité et/ou Institutional Review Board doit être obtenue avant d’effectuer toute recherche impliquant le matériel humain (tissus, fluides corporels). La formation est nécessaire pour tout le personnel travaillant avec des matériaux humains et comprend la formation de sécurité de laboratoire de base, par exemple, chimique hygiène et sécurité en laboratoire, ainsi qu’une formation spécifique sur la sécurité biologique, déchets dangereux et l’homme agents pathogènes transmissibles par le sang. Tout le personnel travaillant avec des matériaux humains est fortement recommandé afin d’obtenir des vaccins contre l’hépatite B, avant de travailler avec le matériel humain. Le personnel est tenu de porter un équipement de protection individuelle spécifique tout en travaillant avec le matériel humain, par exemple., une blouse collerette et un visage de bouclier et porter des gants en tout temps. Tous les travaux dans une placard de biosécurité (classe 2). Tout le matériel qui vient en contact avec le matériel humain et tout déchet de matériel humain est géré adéquatement pour éviter la contamination ou infection du personnel. Tous les équipements et les surfaces sont nettoyées avec 10 % d’éthanol eau de Javel et 75 % après chaque procédure impliquant le matériel humain. Un déversement avec matériel humain doit être immédiatement nettoyé. Verrerie est stérilisé après chaque utilisation. Déchets, y compris les interprétations des tissus humains, sont recueillie dans un sac à déchets étiquetés biohazard et stérilisés à l’autoclave. Objets pointus ou tranchants sont recueillies dans un récipient et fuite-résistant à la perforation étiqueté comme biologiques dangereuses. Tous les déchets de matériel humain respect des normes de sécurité biologique de l’institution.

NOTE : Notre laboratoire obtient des échantillons frais de cortex frontal de personnes décédées à travers le centre de Sanders-Brown sur le vieillissement (CISR #B15-2602-M). Critères d’inclusion sont : inscription à l’étude de cohorte longitudinale autopsie UK-ADC et un intervalle Post-Mortem (PMI) ≤4 h64. Autopsies suivent un protocole standard et toutes les procédures sont conformes aux NIH recueillis de pratiques recommandées,65. Un PMI court de moins de 4 h est de la plus haute importance pour assurer la viabilité capillaire après l’isolement. Les tissus frais et congelés peuvent être utilisés. Si le gel est nécessaire, tissus cérébraux humains fraîchement obtenu devraient être choc congelés dans l’azote liquide et conservés à-80 ° C. Tissu fraîche ou décongelé devrait être stocké dans le tampon d’isolement (voir ci-dessous) et traité rapidement. Nous trouvons que 10 g de tissu humain frais fournit environ 100 mg des capillaires de cerveau (poids humide).

1. le programme d’installation

  1. Préparation du tampon
    Remarque : Le volume de tampon nécessaire dépend de la quantité de tissu. Tous les volumes de mémoire tampon dans le protocole suivant sont basés sur 10 g de tissus de cortex cérébraux humains.
    1. L isolement tampon : Utiliser 1,5 L de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (SPD ; 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 0,9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) et compléter avec le D-glucose (1,35 g 5 mM ) et pyruvate de sodium 1 mM (0,165 g). Après avoir ajouté du glucose et du pyruvate, ajuster le pH 7,4 avec l’hydroxyde de sodium. Laisser refroidir et stocker le tampon à 4 ° C avant de l’utiliser.
    2. L’albumine sérique bovine (BSA) : Ajouter 10 g de poudre de BSA à 1 L de tampon d’isolement à une concentration finale de BSA de 1 %. Remuez lentement pour éviter les bulles, ajuster le pH 7.4 et conserver à 4 ° C durant la nuit. Immédiatement avant utilisation, remuer doucement ; éviter la formation de bulles pour éviter la dénaturation de l’albumine.
    3. milieu de gradient de densité : peser 18 g de milieu de gradient de densité dans une bouteille en verre et ajouter un magnétique. Ajouter 60 mL de tampon d’isolement et agiter vigoureusement pendant 5 min jusqu'à ce que toute la poudre est suspendue. Magasin pendant la nuit à 4 ° C pour permettre le milieu de gradient de densité à dissoudre. Remuez pendant 10 min juste avant utilisation.
    4. Stocker tous les tampons à 4 ° C ; garder tous les outils et les tampons sur la glace lors de la procédure d’isolement complet. Mélanger tous les tampons avant utilisation.
  2. Montage expérimental
    1. Monter le pilon de la meuleuse de tissu Potter-Elvehjem sur l’agitateur électronique généraux. Placez le moulin de tissu de Potter-Elvehjem et l’homogénéisateur Dounce avec pilon sur la glace sous le capot. Préparer une maille de filtre de 300 µm (5 x 5 cm2), pliez-le à un cône et insérer et attachez-le à un 50 mL tube Falcon avec du ruban adhésif (Figure 1 a).
    2. Placez les bagues d’étanchéité raccordement et de filtres de souche de cellules (taille des pores : 30 µm) sur tubes Falcon de 50 mL. Préparer des sacs de déchets biologiques. Placer les équipements requis dans la prévention des risques biotechnologiques armoire (voir Table des matières).

2. préparation des échantillons de cerveau

Remarque : La Figure 1 a montre le diagramme de flux de travail de la technique d’isolation complet décrit ci-dessous. Le tissu de cerveau humain peut provenir de n’importe quelle partie du cortex et peut être utilisé frais ou congelés. Tissu cérébral congelés peut être décongelé à température ambiante (pas de mémoire tampon ; ~ 30 min pour 10 g). Pour obtenir des résultats comparables, le tissu cérébral devrait provenir de la même région du cerveau pour chaque expérience. Ce protocole est optimisé pour les frais (PMI < 4 h) cortex cérébral humain qui n’a pas été congelé.

  1. Préparation du tissu de cerveau humain : documenter le poids du tissu cérébral. Tous les numéros dans le protocole suivant sont appropriés pour 10 g de tissu cérébral humain frais. Placer le tissu cérébral dans une boîte de Pétri de 100 mm. Enlevez soigneusement toutes les méninges avec une pince. Utiliser un scalpel pour couper la matière blanche.
  2. Hacher du tissu cérébral humain : soigneusement découpé le tissu cérébral et il mâche avec un scalpel. Hacher finement pendant environ 5 min (morceaux de 2 à 3 mm). Transférer le tissu cérébral à la meuleuse de tissu de Potter-Elvehjem. Ajouter 30 mL de tampon de l’isolement.
    Remarque : Les morceaux de tissus hachées sont difficiles à voir car le tissu cérébral se transforme en bouillie par le processus de hachage.

3. homogénéisation

  1. Moulin de tissu Potter-Elvehjem (clairance : 150 – 230 µm) : homogénéiser chaque échantillon avec 100 coups à une vitesse d’homogénéiseur de 50 tr/min. Le document le temps chaque 25 coups et le temps total nécessaire pour 100 coups. Voir le tableau 1 pour un protocole proposé homogénéisation ; la durée totale de 10 g de cortex frontal humain l’homogénéisation est d’environ 22 min. Ne remuez pas dans l’air pour éviter les bulles.
  2. Dounce homogénéisateur (clairance : 80 – 130 µm) : transférer l’homogénat dans un homogénéisateur Dounce sur glace. Homogénéiser la suspension avec 20 coups (~ 6 s/course, total d’environ 2 min). Éviter les bulles.

4. centrifugation

  1. Distribuer l’homogénat de cerveau également dans quatre tubes de centrifugation de 50 mL et le volume total de l’homogénat de document. Distribuer 50 mL de tampon de gradient de densité dans les tubes de centrifugation (12,5 mL par tube). 10 mL de tampon d’isolement permet de rincer le pilon et l’homogénéisateur et distribuer dans les quatre tubes de centrifugation (~2.5 mL par tube).
  2. Bien fermer les tubes de centrifugeuse avec bouchons. Mélanger l’homogénat, milieu de gradient de densité et tampon en secouant vigoureusement les tubes. Centrifuger à 5 800 x g pendant 15 min à 4 ° C (rotor angle fixe) ; Sélectionnez une vitesse de décélération moyenne pour garder le culot au tube. Jeter le surnageant et remettre chaque culot en suspension dans 2 mL de 1 % de BSA.

5. filtration

NOTE : Pour séparer les capillaires de globules rouges et autres débris cellulaires, plusieurs étapes de filtration sont nécessaires.

  1. 300 µm maille : après re-suspension du culot, filtrer la suspension à travers les mailles de 300 µm. Capillaires sont filtrés à travers les mailles, considérant que les navires plus grands et plus gros débris de cerveau demeurent sur le maillage. Laver soigneusement la maille avec jusqu'à 50 mL, de 1 % de BSA. Jeter le filet.
    Remarque : Cette étape de filtration efface la suspension capillaire de plus gros navires ou morceaux de débris de cerveau.
  2. Filtre de 30 µM cellule souche
    Remarque : Cette étape de filtration sépare les capillaires des globules rouges et autres débris de cerveau.
    1. Distribuer le filtrat capillaire de l’étape 6.1 sur les filtres de déformation de cellule cinq 30 µm (environ 10 mL de filtrat capillaire par filtre de cellule souche). Capillaires sont freinés par ce filtre, tandis que les globules rouges monocellules et autres débris de petit cerveau passent par le filtre et sont rassemblés dans le filtrat.
    2. Lavez chaque filtre avec 25 mL de 1 % de BSA. Par la suite, tous les filtrats Napper le sixième filtre pour augmenter le rendement. Lavez chaque filtre avec 50 mL de BSA 1 % ; conserver la cellule souche filtres avec contenant les capillaires et d’ignorer le filtrat.

6. capillaire Collection

  1. Renversez les filtres et laver les capillaires avec 50 mL de BSA 1 % pour chaque filtre en tubes de 50 mL. Doucement, appliquer une pression avec la pointe de la pipette d’une pipette de 5 mL et déplacez-le dans le filtre pour éliminer les capillaires du cerveau.
  2. Assurez-vous de laver tous les capillaires de cerveau, en particulier de la jante du filtre. Éviter les bulles car cela complique le processus de filtration et augmente les risques de perte capillaire.

7. laver

  1. Après avoir recueilli les capillaires, centrifuger les échantillons à 1 500 x g pendant 3 min à 4 ° C (balancement seau rotor). Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans environ 3 mL de tampon d’isolement. Combiner tous les granulés resuspendues dans un échantillon dans un tube conique de 15 mL et remplissez-le avec le tampon de l’isolement. Centrifuger à nouveau à 1 500 g pendant 3 min à 4 ° C et laver deux fois plus.
  2. Le document la pureté capillaire avec un microscope (grossissement de X 100) et l’appareil photo (Figure 1 b).
    Remarque : Le rendement de capillaire de cerveau de 10 g de tissus cérébraux humains est habituellement environ 100 mg. Les capillaires cérébraux isolés peuvent maintenant être utilisés pour des expériences, transformés (p. ex.., lysat, isolation membrane), ou être congelés flash et stockées à-80 ° C dans des cryotubes pour un minimum de 6 à 12 mois (éviter de multiples cycles de gel-dégel).

Résultats

L’isolement des tissus cérébraux humains produire une suspension enrichie dans des capillaires de cerveau humain (Figure 1 b) avec de petites quantités de gros navires, globules rouges, autres cellules individuelles et quelques débris cellulaires. Certains capillaires sont ramifiés, et, dans certains cas, les globules rouges sont pris au piège dans les lumières du capillaires. Le capillaire typique a un 3 – 7 µm de diamètre et est environ 100 à ...

Discussion

Le présent protocole décrit l’isolement des capillaires de cerveau humain intact et viable de tissus frais. Dans cette section, nous discutons en détail de ce qui suit : 1) les modifications au protocole 2) dépannage des messages d’erreur, 3) les limites de la technique, 4) l’importance du modèle en ce qui concerne l’existant et des modèles alternatifs de barrière hémato - encéphalique, et 5). applications potentielles pour les capillaires du cerveau humain isolé.

Le protoco...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercier et remercier Dr Peter Nelson et Sonya Anderson à la Banque de tissus du cerveau UK-ADC permettant de cerveau humain tous les échantillons de tissus (numéro de licence de NIH : P30 AG028383 du National Institute on Aging). Nous remercions Matt Hazzard et Tom Dolan, Services informatiques, technologie universitaire et Engagement de faculté, Université du Kentucky pour assistance graphique. Ce projet a été soutenu par grant 1R01NS079507 numéro du National Institute of Neurological Disorders et accidents vasculaires cérébraux (à B.B.) et par grant 1R01AG039621 numéro du National Institute on Aging (à A.M.S.H).. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de la National Institute of Neurological Disorders et accident vasculaire cérébral ou l’Institut National sur le vieillissement. Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex MediumVWR, Radnor, PA, USA32916-636PPE
Disposable Protective LabcoatsVWR, Radnor, PA, USA470146-214PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposableThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA19460102PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20"Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA14-206-32to cover working areas
VWR Sharps Container SystemsThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA75800-272for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz.UK Supply Center, Lexington, KY, USA323775
Equipment
4 °C RefrigeratorThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA13-986-148
Accume BASIC AB15 pH MeterThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USAAB15
Heidolph RZR 2102 ControlHeidolph, Elk Grove Village, IL, USA501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR CentrifugeThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA75004521
Leica L2 Dissecting MicroscopeLeica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USAused to remove meninges
POLYTRON PT2500 HomogenizerKinematica AG, Luzern, Switzerland9158168
Scale P-403Denver Instrument, Bohemia, NY, USA0191392
Standard mini StirThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen DewarThermal Scientific, Mansfiled, TX, USA11-670-4Cused to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical BalanceOHAUS, Parsippany, NJ, USAVP214CN
ZEISS Axiovert MicrocopeCarl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USAused to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21377823T1wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1,000 µLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21377821T1resuspend pellet in BSA
Pipet BoyIntegra, Hudson, NH, USA739658
50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/csVWR, Radnor, PA, USA21008-951
EISCO Scalpel BladesThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USAS95938Cto mince brain tissue
PARAFILMVWR, Radnor, PA, USA52858-000to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21-377-304to wash capillaries off filter
60 mL syringe with Luer-LokThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USABD309653used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4Fine Science Tools, Foster City, CA, USA10060-13used for mincing
Dumont Forceps #5Fine Science Tools, Foster City, CA, USA11251-10used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue GrinderThomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA3431E2550 mL volume, clearance: 150-230 μm
Dounce HomogenizerVWR, Radnor PA USA62400-64215 mL volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm)Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA146424Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm)pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany43-50030-03
Connector RingpluriSelect Life Science, Leipzig, Germany41-50000-03reuse multiple time
1 L Volumetric Flaskfor preparation of Isolation Buffer
1 L Beakerfor preparation of 1% BSA
Stir Barfor preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 mL)for preparation of Ficoll®
Ice Bucketto keep everything cold
100 mm Petri dishfor mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell ScraperVWR, Radnor, PA, USA89260-222to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAA9647-500gprepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+HycloneSH30264.FSDPBS - part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAF4375Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAG7528Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard SolutionSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA71474to adjust pH of the DPBS
Sodium PyruvateSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAP2256Concentration: 1 mM

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