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요약

인간의 뇌 조직에서 분리 된 뇌 모세 혈관 장벽 기능 생리 및 병 태 생리 조건에서 공부 하는 전 임상 모델으로 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관을 분리 하는 최적화 된 프로토콜을 제시.

초록

생리 및 병 태 생리 조건 이해 혈액-뇌 장벽 함수는 두뇌 약물 전달 향상, 두뇌 보호, 개선 및 두뇌 치료 약속을 잡고 새로운 치료 전략의 개발에 대 한 중요 한 장애입니다. 그러나, 인간의 혈액-뇌 장벽 기능을 공부 하 고 도전 이다. 따라서, 적절 한 모델에 대 한 중요 한 필요는. 이와 관련, 뇌 모세 혈관 뇌 조직에서 분리 가능한 상황 인간의 vivo에서 가까운으로 장벽 기능을 공부 하는 독특한 도구를 나타냅니다. 여기, 우리는 일관 된 품질과 순도 높은 수확량에서와 인간의 뇌 조직에서 모세 혈관을 분리 하는 최적화 된 프로토콜을 설명 합니다. 모세 혈관에서 신선한 인간의 뇌 조직의 기계적 균질, 밀도 기울기 원심 분리, 여과 사용 하 여 격리 됩니다. 격리, 후 인간의 뇌 모세 혈관 단백질 표정 그리고 기능, 효소 활동, 또는 세포내 신호를 공부 하 누설 분석 실험, 라이브 셀 이미징 및 면역 기반 분석 등의 다양 한 애플리케이션에 사용할 수 있습니다. 고립 된 인간의 두뇌 모세는 인간의 혈액-뇌 장벽 기능의 규정 명료 하 독특한 모델입니다. 이 모델은 중앙 신경 조직 (CNS) 병 인, CNS 질환 치료를 위한 치료 전략의 개발에 도움이 될 것입니다에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

서문

혈액-뇌 장벽 혈액과 무슨 들어가는 및 두뇌에서 결정 하는 뇌 간의 긴밀 하 게 제어 인터페이스입니다. 해부학, 내 피 세포 혈액-뇌 장벽을 구성 하 고 복잡 한, 지속적인 모 세관 네트워크를 형성 한다. 순수,이 모 세관 네트워크는 동시에 이산화탄소와 대사 폐기물의 처분 하는 동안 산소와 영양소와 뇌를 제공 합니다. 중요 한 것은, 증거는 배리어에 변화 Alzheimer의 질병, 간 질, 및 뇌졸중1,2,3,,45 를 포함 하 여 수많은 병 리에 기여 지원 , 6 , 7. 뇌 내 피 세포도 예뇌에 약물 흡수를 차단 하 여 치료에 방 벽으로 봉사., 화학 요법 세포종 님 다음 종양 절제술8,9, 의 10. 이와 관련, 고립 된 인간의 뇌 모세 혈관 대표는 독특한 비보 전 혈액-뇌 장벽 모델을 밀접 하 게 유사한 방 벽 속성 vivo에서, 장벽 기능 및 건강 장애의 연구에 대 한 수 있는 그리고 질병입니다. 이 문서에서 우리는 프로토콜 일관 되 게 높은 품질을 모 세관에 인간의 뇌에서 뇌 모세 혈관을 분리 하 고 혈액-뇌 장벽 공부 항복을 제공 합니다.

1969 년에, Siakotos 외. 11 뇌 모세 혈관 밀도 그라데이션 원심 분리와 유리 구슬 열 분리를 사용 하 여 소 하 고 인간의 뇌 조직에서의 격리를 보고 하는 첫번째 이었다. 나중에, 골드 스 테 인 외. 12 조직의 포도 당 수송의 신진 대사 활동을 유지 하면서 쥐에서 고립 뇌 모세 혈관을 공부 하는 데 필요한 금액을 줄이기 위하여 여러 여과 단계를 추가 하 여이 메서드를 향상. 그 이후, 연구자 최적화 모 세관 격리 절차 여러 번, 각 반복13,,1415방법과 뇌 모 세관 모델을 개선. 예를 들어 Pardridge은 외. 16 소 모 세관 기계적 균질, 보다는 오히려 소화 효소를 사용 하 여 격리 하 고 이후에 전달 210 µ m 메쉬 필터와 유리 구슬 열을 통해 모 세관 서 스 펜 션. 이러한 수정 고립된 뇌 모세 혈관의 trypan 블루 제외 얼룩을 개선 하 고 따라서 내 피 세포 생존 능력을 증가. 1990 년대 초에, Dallaire 외. 17 격리 소 및 쥐 모 세관 신경 오염의 명확 했다 고 γ glutamyl transpeptidase (γ-GTase)와 알칼리 성 인산 가수분해 효소의 대사 활동을 유지. 2000 년에, 밀러 외. 18, 모세 혈관의 루멘으로 전송 기판의 축적을 보여 confocal 현미경 검사 법와 함께에서 고립 된 쥐와 돼지의 뇌 모세를 사용. 그 후, 우리의 실험실 뇌 모 세관 격리 절차를 최적화 하기 위해 계속 하 고 우리는 P-당단백질 (P-gp)19,,2021, 유방암을 결정 하기 위해 전송 분석 설립 저항 단백질 (BCRP)22,23, 그리고 다중 약물 저항 단백질 2 (Mrp2)24 전송 활동. 2004 년, 우리는 우리가 다양 한 신호 경로 조사 하기 위해 고립 된 쥐 뇌 모세 혈관을 사용 하는 두 가지 보고서 출판. 츠 외에 21, 우리는 펩 티 드 endothelin 1 신속 하 고 역 감소 뇌 모세 혈관 endothelin 수용 체 B (동부 표준시B) 수용 체, 산화 질소 synthase (NOS), 그리고 단백질 키 니 아 제 C 통해 행동에 의해 (PKC)에서 P의 gp 전송 기능 발견. 바 우 어 외 에 19, 우리 핵 수용 체 pregnane X 수용 체 (PXR)의 표현과 보였다 PXR 변조 뇌 모세 혈관에서 P의 gp 식 및 전송 기능을 시연 했다. 유전자 변형 인간 답게 PXR 마우스 실험에서 우리 연구의이 라인을 확장 하 고 hPXR 활성화25통해 upregulating P-gp에 의해 방 벽의 강화 vivo에서 보여주었다. 2010 년에 츠 외. 26 P gp 단백질 표정 복원 및 수송 행복해 overexpress 유전자 변형 인간 녹말 체 선구자 단백질 (행복해) 생쥐에서 활동이 접근이 방식을 사용. 또한, P의 gp 행복해 복원 마우스 크게 감소 녹말 체 beta (Aβ)40와 Aβ42두뇌 수준.

신호 경로, 공부 뿐만 아니라 모 세관 누설을 지칭 하는 모 세관 침투성에 있는 변화를 결정 하 고립 된 뇌 모세 혈관을 사용할 수 있습니다. 특히, 텍사스 레드 누설 시험 시간 및 이러한 데이터 모 세관 루멘에서 텍사스 레드는 누설 률을 분석 하는 데 사용 하는 형광 염료의 누출을 평가 하기 위해 사용 됩니다. 증가 모 세관 누설 률 제어 모 세관에서 그에 비해 혈액-뇌 장벽2의 물리적 무결성에 변화를 나타냅니다. 이것은 가치가 장벽 장애, 예를 들어와 관련 된 수많은 질병 상태 이기 때문에., 간 질, 다 발성 경화 증, 알 츠 하이 머 병, 그리고 외상 성 뇌 부상27,,2829, 30. 다른 그룹 또한 단백질 표정 및 단백질31,32,,3334의 전송 활동 신호 경로 분별 하 고립 된 모 세관 이용 35,,3637. 마지막으로, 우리는 인간의 뇌 모세 혈관의 격리에 대 한이 메서드를 최적화 하기 위해 지속적으로 그리고, 최근에, 우리가 보여주었다 증가 P gp 식 환자에서 인간의 혈액-뇌 장벽에서 간 질 발작-무료 제어 개인38에 비해 . 함께 찍은, 이러한 발전 고립된 뇌 모세 혈관 장벽 기능을 공부 하는 다재 다능 한 모델으로 사용할 수 있습니다 보여줍니다.

Vivo에서, ex vivo, 및 혈액-뇌 장벽 모델 생체 외에서 다양 한 기초 연구와 산업 약물 검사, 약물 전달 뇌39,40,41에 테스트 목적으로 주로 사용 된 ,42,,4344. 격리 된 비보 전 뇌 모세 혈관, 뿐만 아니라 현재 혈액-뇌 장벽 모델 포함 철에 모델, 체 외에서 세포 배양 고립된 뇌 모 세관 내 피 세포 또는 다양 한에서 불멸 하 게 셀 라인의 종, 뇌 모 세관 내 피 세포, 및 칩에 미세 모델으로 차별화 하는 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)의 생체 외에서 문화.

실리콘에서 모델 예측된 흡수, 분포, 대사, 배설 (ADME) 속성에 따라 약 후보자를 선택 하기 위한 약물 개발에 가장 일반적으로 사용 됩니다. 양이 많은 구조 재산 관계 (QSPR) 모델 같은 양이 많은 구조 활동 관계 (굽기) 모델은 라이브러리의 높은 처리량 검열에 사용 하는 약물의 뇌 침투를 예측 하는 인기 있는 방법 45 , 46.이 모델은 화면 분자 배리어 관통 속성에 대 한 유용.

베 츠 외. 47 는 생체 외에서 혈액-뇌 장벽 모델 시스템으로 교양된 뇌 모 세관 내 피 세포의 monolayers를 설립. 인간의 대뇌 microvessel 내 피 세포 (hCMECs) 등 신선한 조직 또는 불멸 하 게 내 피 세포를 사용 하 여 셀 문화 모델 생체 외에서 뇌 침투 또는 기계 론 적인 연구에 대 한 또 다른 높은 처리량 검열 도구 수 있습니다. 그러나, 뇌 모 세관 내 피 세포 문화 모델 모 세관 루멘 내의 혈의 생리 전단 응력 부족, 전반적인 생물 학적 복잡성에 제한 됩니다 및 식 및 중요 한 장벽 부품의 지역화에 변화를 받아야 꽉 접합 단백질 같은 표면 수용 체, 전송기, 효소, 그리고 이온 채널48,,4950. 반대로, 내 피 monolayers hPSCs에서 파생 된, hCMEC/D3 문화에 비해 낮은 자당 침투성이 있고 일부 혈액-뇌 장벽 전송기, 접착 분자, 그리고 단단한 접속점51, 의 편광된 식 포함 그러나 52., 이러한 셀 속성에에서 변경 될 수 있으며 시스템 장벽 속성52 vivo에서 의 재현 부에 대 한 유효성을 검사 해야 합니다.

혈액-뇌 장벽 연구의 최신 동향 등 인공 모세 혈관, 기관-온-칩 기술을 사용 하 여 미세 장치 생성 또는 빈 섬유 기술53, 를 활용 하 여 만드는 3D 조직 문화 시스템을 활용 하 여 54 , 그러나 55. 인공 모세 혈관,, 있다 뇌 모세 혈관 (3-7 µ m) 보다 훨씬 더 큰 직경 (100-200 µ m). 따라서, 전단 세력에는 생체 외에서 할 하지 완전히 닮은 vivo에서 상황. 이것은 "blood-brain-barrier-on-a-chip" 미세 장치, 미세 전단 힘을 생성 하는 이러한 장치를 통해 인공 막 형태 "피"와 "두뇌" 구획 및 유체 펌핑은 해결 되었습니다. 마찬가지로, 다양 한 조합 이다와 내 피 세포와 혈관 평활 근 세포의 공동 문화 또한 사용 되었습니다 빈 섬유 기술을 vivo 조건56 에서 존재 하는 유 변 학적 매개 변수를 다시 , 57 , 그러나 58., 그것은 불분명이 모델 혈액-뇌 장벽 교통, 신진 대사, 신호, 등 등의 다른 속성을 반영 하는 얼마나 잘. 이러한 인공 모 세관 및 칩 모델은 약물의 높은 처리량 검열에 적합 하지만 이러한 모델을 생성 하는 데 사용 되는 세포 문화 중 변경 될 수 있습니다.

고정 및 고정 뇌 조각 또는 모 세관 내 피 세포 배양인간 microvasculature 연구5,59,,6061하는 데 사용할 수 있는 추가 모델은 기본 두뇌. 예를 들어 고정된 뇌 조직의 immunohistochemistry 단백질 지역화가 결정 하는 데 사용은 고 식 건강 한 병에 걸리는 조직에 비해.

조직 조각 및 생체 외에서 모델 위에서 설명한, 갓 고립 뇌 모세 혈관 혈액-뇌 장벽 기능을 공부에 활용할 수 있습니다. 신선한 인간의 뇌 조직, 얻을 하는 데 어려움이 고립 된 모 세관 모델의 포함 이다 신경, 그리고 상대적으로 시간이 많이 걸리는 격리 프로세스의 부재. 격리 된 뇌 모 세관 모델의 한 장점은이 모델 밀접 하 게 비보에 상황을, 따라서, 장벽 기능 및 역 기능 특성을 사용할 수 있습니다. 중요 한 것은, 그것은 또한 신호 메커니즘을 사용 하 여 다양 한 분석 및 분자 기법3,19,,6263분별을 사용할 수 있습니다.

우리의 실험실 권한이 모두 신선 하 고 냉동 인간 두뇌 조직에 노화에 샌 더 스 브라운 센터를 통해 (IRB #B15-2602-M)64. 이러한 맥락에서 부검 표준 프로토콜에 따라, 두뇌에서 얻을 수 있습니다 < 4 h, 및 모든 절차 준수 NIH Biospecimen 최상의 연습 지침65. 인간의 뇌 조직에이 독특한 접근을 감안할 때, 우리는 설립 하 고 그대로, 가능한 인간의 두뇌 모세 혈관의 고수익에 결과 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관을 분리 하는 프로토콜을 최적화. 관심의 두 가지 일반적인 끝점 단백질 식 및 활동을 결정 하는. 이와 관련, 우리와 다른 단백질 표정 활동 레벨을 공부 하 고 격리 된 뇌 모세 혈관으로 사용할 수 있는 다양 한 분석을 설립 했다. 이 분석 실험 등 서 부 럽, 간단한 서양 분석 결과, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 반전 녹음 방송 연쇄 반응 (RT-PCR), 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량), zymography, 전송 활동 분석 실험, 그리고 모 세관 누설 분석 실험입니다. 이 분석 실험 허용 인간 pathologic 상태에서 장벽 기능에 변화를 공부 단백질 식 및 활동, 관리 하는 경로 확인 하 고 혈액-뇌 장벽 관련 치료에 대 한 약리학 적인 목표를 식별 하 연구원 질병입니다.

함께, 갓 찍은 고립된 뇌 모세 혈관 혈액-뇌 장벽의 강력 하 고 재현 가능한 모델로 사용할 수 있습니다. 특히,이 모델 다양 한 장벽 기능을 공부 하는 끝점을 확인 하기 위해 많은 다른 분석 실험 결합 될 수 있다.

프로토콜

아래 내용은 현재 안전 및 규제 표준 켄터키의 대학, 렉 싱 턴, 켄터키, 미국에서 기반으로 합니다. 안전 예방책으로 서 인간의 조직으로 작업 하기 전에 기관의 생물 안전 프로그램 최신 규정 및 권장 사항을 참조 하십시오.

주의: 인간의 조직 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), B 형 간염 바이러스 (HBV), C 형 간염 바이러스 (HCV), 및 다른 사람을 포함 하 여, 혈액을 매개로 병원 균의 원천이 될 수 있습니다. 인간의 조직 사용 혈액을 매개로 병원 체 감염의 위험을 포즈. 따라서, 특정 규제 및 안전 고려 사항은 실험실 직원을 보호 하기 위해 인간의 조직 작업할 때 필수적입니다. 미국에서 인간의 조직 작업 biosafety 수준 2 실험실 안전 조치 및 NIH 섹션 IV-B-7, 1970 절 5(a)(1) 및 사용자의 기관 생물 안전 프로그램의 OSHA Act에 따라 훈련을 요구 한다. 일반적으로, 인간의 물질 (조직, 체액)와 관련 된 어떤 연구를 수행 하기 전에 기관 Biosafety 위원회 및 기관 검토 위원회의 승인을 얻어야 합니다. 훈련과 인간의 재료를 사용 하는 모든 직원에 대 한 필요 포함 되어 기본적인 실험실 안전 교육, 예를 들어, 화학 위생 및 실험실 안전, 생물 안전, 유해 폐기물, 그리고 인간의 구체적인 훈련 혈액을 매개로 병원 균 인간의 재료를 사용 하는 모든 직원은 인간의 재료로 작업 전에 B 형 간염 예방 접종을 얻으려면 좋습니다. 인원은 인간의 물질, 예를 들어작업 하는 동안 특정 개인 보호 장비를 착용 하는 데 필요한., 수 갑을 차고 실험실 코트와 얼굴 방패, 그리고 항상 장갑을 착용. 모든 작업 biosafety 내각 (클래스 2)에서 수행 됩니다. 모든 장비에 인간의 재료와 접촉 하 고 어떤 폐기물에서 나오는 인간의 물질 오염 및 직원의 감염을 방지 하기 위해 적절 하 게 처리 됩니다. 모든 장비 및 표면 10% 표 백제와 75% 에탄올 인간의 재료를 포함 하는 각 절차에 따라 청소 됩니다. 인간의 자료 유출 즉시 청소 되어야 한다. 유리는 압력가 마로 소독 후 사용. 폐기물, 고정 되지 않은 인간의 조직를 포함 하 여 레이블이 지정 된 생물 학적 쓰레기 봉투에 수집 이며 압력가 마로 소독. Sharps로 유해 표시 펑크 및 누출 방지 용기에 수집 됩니다. 인간의 물질 로부터 모든 폐기물 기관의 생물 안전 규정에 따라 삭제 됩니다.

참고: 우리의 실험실 노후화에 샌 더 스 브라운 센터를 통해 고 인된 개인에서 신선한 담당 샘플을 얻습니다 (IRB #B15-2602-M). 포함 기준은: 영국-ADC 경도 부검 코 호트 연구와 사후 간격 (PMI) ≤4 등록 h64. 표준 프로토콜에 따라 부검 하 고 모든 절차 준수 NIH Biospecimen 최상의 연습 지침65. 4 h 보다는 더 적은의 짧은 PMI 격리 후 모 세관 생존 능력을 보장 하기 위해 가장 중요 한 것입니다. 신선 하 고 냉동 조직을 사용할 수 있습니다. 어 필요한 경우, 갓 얻은 인간의 뇌 조직 충격-액체 질소에서 냉동 고-80 ° c.에 저장 신선한 또는 해 동 조직 절연 버퍼 (아래 참조)에 저장 하 고 신속 하 게 처리 해야 합니다. 우리는 신선한 인간의 조직 수익률 뇌 모세 혈관 (젖은 중량)의 약 100 밀리 그램의 10 g을 찾으십시오.

1입니다. 설치

  1. 버퍼 준비
    참고: 필요한 버퍼의 양 조직의 크기에 따라 달라 집니다. 다음 프로토콜에서 모든 버퍼 볼륨 인간의 뇌 피 질 조직의 10 g를 기반으로 합니다.
    1. L 절연 버퍼: 사용 Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS; 2.7 m KCl, 1.47 m m KH2포4, 136.9 m NaCl, 8.1 m 나2HPO4m, 0.9 m m CaCl2, 0.49 m m MgCl2m m)의 1.5 L와 5 m D-포도 당 (1.35 g 보충 )와 1 m m 나트륨 pyruvate (0.165 g). 포도 당 및 pyruvate를 추가한 후 수산화 나트륨으로 pH 7.4에 조정 합니다. 쿨 하 고 버퍼 사용 하기 전에 4 ° C에 저장 합니다.
    2. 소 혈 청 알 부 민 (BSA): 1%의 최종 BSA 농도에 절연 버퍼의 1 l BSA 가루 10 g를 추가 합니다. 거품을 피하기 위해, pH 7.4, 조정 및 4 ° C에서 밤새 껏 저장를 천천히 저 어. 바로 이전에 사용 하 고, 부드럽게 저 어; 알 부 민 변성을 피하기 위해 거품을 형성 하지 마십시오.
    3. 밀도 그라데이션 매체: 유리 병에 밀도 그라데이션 매체의 18 g를 무게 그리고 자석 저 어 바 추가. 절연 버퍼의 60 mL을 추가 하 고 모든 분말 일시 중단 될 때까지 5 분 동안 적극적으로 악수. 저장소 밀도 그라데이션 중간 해산 있도록 4 ° C에서 하룻밤. 바로 사용 하기 전에 10 분 동안 저 어.
    4. 4 ° C에서 모든 버퍼 저장 전체 격리 절차 동안 모든 도구와 얼음에 버퍼를 유지. 사용 하기 전에 모든 버퍼를 저 어.
  2. 실험적인 체제
    1. 탑재 전자 오버 헤드 교 반기에 포터 Elvehjem 조직 분쇄기의 유 봉. 후드 아래 얼음에 유 봉과 포터 Elvehjem 조직 분쇄기와 Dounce 균질 화기를 배치 합니다. 300 µ m 필터 메쉬 (5 x 5 cm2)를 준비, 콘, 배 고 삽입 하 고 50ml 테이프 (그림 1A)와 팔 콘 튜브를 연결.
    2. 연결 고리를 놓고 긴장 필터 셀 (기 공 크기: 30 µ m) 50 mL 송 골 매 관에. 유해 쓰레기 봉투를 준비 합니다. 필요한 모든 장비는 biosafety 내각 장소 ( 테이블의 자료를 참조).

2. 두뇌 샘플 준비

참고: 그림 1A 아래 설명 하는 전체 격리 절차의 워크플로 차트를 보여 줍니다. 인간의 뇌 조직 피 부분에서 줄기 수 있습니다 그리고 신선 또는 냉동 사용할 수 있습니다. 고정된 뇌 조직 (아무 버퍼; ~ 30 분 10 g) 실 온에서 해 동 될 수 있습니다. 비교 결과 얻기 위해 뇌 조직 각 실험에 대 한 같은 뇌 영역에서 얻을 수 한다. 이 프로토콜은 신선한 최적화 (PMI < 4 h) 동결 되지 인간의 대뇌 피 질.

  1. 인간 뇌 조직의 준비: 뇌 조직의 무게를 문서화. 다음 프로토콜에서 모든 숫자는 10 g의 신선한 인간의 뇌 조직에 적합 합니다. 뇌 조직을 100 mm 페 트리 접시에에서 놓습니다. 집게와 모든 meninges를 조심 스럽게 제거. 메스를 사용 하 여 백색 질을 잘라.
  2. 인간의 뇌 조직의 닦지: 신중 하 게 자르고 뇌 조직을 메스로 말하다. 약 5 분 (2-3 m m 조각)을 말하다. 뇌 조직의 포터 Elvehjem 조직 분쇄기를 전송 합니다. 절연 버퍼의 30 mL를 추가 합니다.
    참고: 다진된 조직 조각은 뇌 조직의 고기 저 미는 과정 아니 셨 변신 이후 볼 어렵다.

3입니다. 균질

  1. 포터 Elvehjem 조직 분쇄기 (정리: 150-230 µ m): 50 rpm의 균질 화기 속도로 100 선으로 각 샘플을 균질. 모든 25 획과 100 타에 필요한 총 시간 시간을 문서화 합니다. 제안 된 균질 프로토콜; 표 1 을 참조합니다 인간의 전 두 엽 피 10 g을 조직에 대 한 총 시간은 약 22 분입니다. 공기 거품을 방지 하기 위해 저 어 하지 마십시오.
  2. Dounce 균질 화기 (정리: 80-130 µ m): 얼음 Dounce 균질 화기는 homogenate 전송. 20 획 (~ 6 s/스트로크, ~ 2 분의 총)와 정지 균질 거품을 하지 마십시오.

4입니다. 원심 분리

  1. 4 50 mL 원심 분리 관 및 문서는 homogenate의 전체 볼륨으로 뇌 homogenate를 동등 하 게 배포 합니다. 원심 분리 튜브 (12.5 mL 튜브 당) 50 mL 밀도 그라데이션 버퍼를 배포 합니다. 절연 버퍼의 10 mL를 사용 하 여 유 봉과 균질 화기, 린스와 4 개의 원심 튜브 (튜브 당 ~2.5 mL)로 배포.
  2. 단단히 원심 분리기 튜브 뚜껑을 닫습니다. 적극적으로 튜브를 떨고에 의해 homogenate, 밀도 그라데이션 중간, 그리고 버퍼를 믹스. 4 ° C (고정된 각도 터);에서 15 분 동안 5800 x g 에서 원심 튜브에 연결 된 펠 릿을 계속 중간 감속 속도 선택 합니다. 삭제는 상쾌한 고 1 %BSA 2 mL에 각 펠 릿 resuspend.

5입니다. 여과

참고: 모세 혈관 붉은 혈액 세포와 다른 세포 파편에서 별도로 여러 필터링 단계가 필요 하다.

  1. 300 µ m 메시: 펠 릿을 다시 중단 후 필터링 300 µ m 메시를 통해 서 스 펜 션. 반면 큰 배 및 더 큰 두뇌 파편 메쉬에 남아 모세 혈관 망, 통해 필터링 됩니다. 메시 1 %BSA 최대 50 mL를 조심 스럽게 씻는 다. 메쉬를 삭제 합니다.
    참고:이 여과 단계 어떤 큰 혈관 또는 뇌 파편의 덩어리에서 모 세관 정지를 지웁니다.
  2. 30 µ M 세포 변형 필터
    참고:이 여과 단계 적혈구와 뇌 파편 다른에서 모세 혈관을 분리합니다.
    1. 5 30 µ m 세포 변형 필터 (셀 스트레인 필터 당 모 세관 여과 액의 약 10 mL) 이상 단계 6.1에서에서 모 세관 여과 액을 배포 합니다. 반면 붉은 혈액 세포, 다른 단일 세포 및 작은 두뇌 파편 필터를 통과 하 고는 filtrate에 수집 되어 모세 혈관이이 필터에 의해 다시 개최 됩니다.
    2. 각 필터 1 %BSA 25 mL로 씻는 다. 나중에, 수확량을 증가 시키기 위해 6 필터 모든 filtrates 붓는 다. 1 %BSA; 50 mL와 각 필터 세척 셀 변형 필터는 모 세관을 포함 하 고는 여과 액을 버리고.

6. 모 세관 컬렉션

  1. 거꾸로 필터를 설정 하 고 각 필터에 대 한 1 %BSA 50 mL와 함께 모세 혈관 50 mL 튜브에 씻어. 부드럽게 피펫으로 팁 5 mL pipettor의 압력을 적용 하 고 필터를 씻어 뇌 모세 혈관에서 이동.
  2. 특히 필터의 테두리에서에서 모든 뇌 모세 혈관을 씻어 있는지 확인 하십시오. 이후이 여과 과정을 더 어렵게 만든다 모 세관 손실의 기회를 증가 거품을 하지 마십시오.

7입니다. 세척

  1. 모세를 수집한 후 원심 (양동이 터 스윙) 4 ° C에서 3 분 1500 x g 에서 모든 샘플. 상쾌한을 제거 하 고 다시 절연 버퍼의 약 3 mL에 펠 릿을 중단. 15 mL 원뿔 튜브에 하나의 샘플에서 모든 resuspended 펠 릿을 결합 하 고 절연 버퍼 채우기. 다시 4 ° C에서 3 분 1500 x g 에서 원심과 두 번 더 세척.
  2. 현미경 (100 X 배율)와 카메라 (그림 1B) 모 세관 순도 문서화 합니다.
    참고: 인간 뇌 조직의 10 g에서 뇌 모 세관 수확량은 일반적으로 약 100mg 이다. 격리 된 뇌 모세 혈관 실험, 처리에 대 한 지금 사용할 수 있습니다 (예., lysate, 막 분리), 또는 플래시-냉동 고에 최소 6-12 개월 (여러 freeze-thaw 주기 방지)에 대 한 cryotubes-80 ° C에 저장.

결과

인간의 뇌 조직에서 격리 큰 혈관, 적혈구, 다른 단 세포와 일부 세포 파편의 작은 양의와 인간의 뇌 모세 혈관 (그림 1B)에 농축 현 탁 액을 산출 한다. 일부 모 세관, 분기 하 고, 일부, 적혈구는 모 세관 루멘에서 속은. 일반적인 모 세관 3-7 µ m 직경을가지고 있으며 약 100-200 µ m 오픈 루멘;와 긴 대부분 모 세관 끝 축소 됩니다. Confocal 현미경 검사 법을...

토론

현재 프로토콜 신선한 조직에서 그대로 하 고 가능한 인간의 두뇌 모세 혈관의 격리를 설명합니다. 이 섹션에서 우리에 대해 자세히 다음: 1) 프로토콜, 2) 일반적인 오류 문제 해결, 3) 기술의 한계, 4) 기존 기준 모델 및 대체 혈액-뇌 장벽 모델의 중요성에 대 한 수정 및 5) 고립 된 인간의 뇌 모세 혈관에 대 한 잠재적인 응용 프로그램입니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 신선한 ...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

우리 감사 피터 넬슨 박사 소냐 앤더슨 모든 인간의 뇌 조직 샘플을 제공 하기 위한 영국 ADC 뇌 조직 은행에서 인정 하 고 (번호를 부여 하는 NIH: 노후화에 국가 학회에서 P30 AG028383). 우리 감사 매트 기능 및 톰 고 언, 정보 기술 서비스, 교육 기술 및 교직원 참여, 켄터키의 대학 그래픽 지원. 이 프로젝트는 (A.M.S.H.)에 노화 국립 연구소에서 보조금 번호 1R01AG039621와 부여 번호 1R01NS079507 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기 (B.B.)에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 노화에 대 한 신경 성 질환의 국가 학회 및 치기 또는 국립 연구소의 공식 견해를 대표 하지 않는다. 저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex MediumVWR, Radnor, PA, USA32916-636PPE
Disposable Protective LabcoatsVWR, Radnor, PA, USA470146-214PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposableThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA19460102PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20"Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA14-206-32to cover working areas
VWR Sharps Container SystemsThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA75800-272for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz.UK Supply Center, Lexington, KY, USA323775
Equipment
4 °C RefrigeratorThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA13-986-148
Accume BASIC AB15 pH MeterThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USAAB15
Heidolph RZR 2102 ControlHeidolph, Elk Grove Village, IL, USA501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR CentrifugeThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA75004521
Leica L2 Dissecting MicroscopeLeica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USAused to remove meninges
POLYTRON PT2500 HomogenizerKinematica AG, Luzern, Switzerland9158168
Scale P-403Denver Instrument, Bohemia, NY, USA0191392
Standard mini StirThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen DewarThermal Scientific, Mansfiled, TX, USA11-670-4Cused to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical BalanceOHAUS, Parsippany, NJ, USAVP214CN
ZEISS Axiovert MicrocopeCarl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USAused to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21377823T1wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1,000 µLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21377821T1resuspend pellet in BSA
Pipet BoyIntegra, Hudson, NH, USA739658
50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/csVWR, Radnor, PA, USA21008-951
EISCO Scalpel BladesThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USAS95938Cto mince brain tissue
PARAFILMVWR, Radnor, PA, USA52858-000to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mLThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA21-377-304to wash capillaries off filter
60 mL syringe with Luer-LokThermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USABD309653used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4Fine Science Tools, Foster City, CA, USA10060-13used for mincing
Dumont Forceps #5Fine Science Tools, Foster City, CA, USA11251-10used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue GrinderThomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA3431E2550 mL volume, clearance: 150-230 μm
Dounce HomogenizerVWR, Radnor PA USA62400-64215 mL volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm)Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA146424Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm)pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany43-50030-03
Connector RingpluriSelect Life Science, Leipzig, Germany41-50000-03reuse multiple time
1 L Volumetric Flaskfor preparation of Isolation Buffer
1 L Beakerfor preparation of 1% BSA
Stir Barfor preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 mL)for preparation of Ficoll®
Ice Bucketto keep everything cold
100 mm Petri dishfor mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell ScraperVWR, Radnor, PA, USA89260-222to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAA9647-500gprepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+HycloneSH30264.FSDPBS - part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAF4375Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAG7528Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard SolutionSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA71474to adjust pH of the DPBS
Sodium PyruvateSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAP2256Concentration: 1 mM

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