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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Réparation des cassures double brin de l’ADN est un processus dynamique, qui exige non seulement la formation de complexes de réparation sur les sauts, mais également leur résolution après que la lésion est adressée. Ici, nous utilisons la microscopie d’immunofluorescence pour les pauses bicaténaire transitoires et de longue durée comme outil de disséquer ce mécanisme de maintenance du génome.

Résumé

La réparation de bris double-brin (CDB) dans l’ADN est un processus hautement coordonné, ce qui nécessite la formation et la résolution de plusieurs protéines de réparation complexes. Ce processus est réglé par une myriade de protéines qui promouvoir l’association et de dissociation des protéines à ces lésions. Grâce en grande partie à la capacité d’exécuter des écrans fonctionnels d’une vaste bibliothèque de protéines, il y a une plus grande appréciation des gènes nécessaires à la réparation de pause l’ADN double brin. Écrans souvent knock-out ou chimique inhibiteur identifient protéines impliquées dans le processus de réparation à l’aide de toxicité accrue comme marqueur pour une protéine qui est nécessaire pour la réparation de l’ORD. Bien qu’utile pour l’identification de nouvelles protéines cellulaires impliqués dans le maintien de fidélité du génome, analyse fonctionnelle exige la détermination de la question de savoir si la protéine d’intérêt favorise la localisation, formation ou résolution des réparations complexes.

L’accumulation des protéines de réparation peut être facilement détectée comme foyers nucléaires distinctes par microscopie d’immunofluorescence. Ainsi, association et dissociation de ces protéines dans les sites des lésions de l’ADN sont accessibles en observant ces foyers nucléaires à intervalles représentatifs après l’induction de cassures double brin de l’ADN. Cette approche peut également identifier des protéines de réparation mal localisées de facteur, si les défauts de réparation ne se produisent pas simultanément avec des retards incomplètes en réparation. Dans ce scénario, les cassures de l’ADN double brin longue durée peuvent être conçues en exprimant une endonucléase coupe rares (p. ex., I-SceI) dans les cellules où le site de reconnaissance pour l’enzyme ladite a été intégré dans le génome cellulaire. La lésion qui en résulte est particulièrement difficile à résoudre car réparation fidèle réintroduira site de reconnaissance de l’enzyme, ce qui incite une autre série de clivage. Ainsi, les différences dans la cinétique de réparation sont éliminés. Si la réparation complexes ne sont pas formés, localisation a été entravée. Ce protocole décrit la méthodologie nécessaire pour identifier les modifications dans la cinétique de la réparation ainsi que réparation localisation des protéines.

Introduction

Chaque jour, chaque cellule dans le corps humain est bombardé par un estimé 10 000 lésions de l’ADN1. Cette menace existentielle nous met en péril pour les mutations, oncogenèse comme cellule mort. Pour protéger la fidélité du génome, cellules de mammifères ont évolué pour répondre aux lésions de l’ADN avec une série complexe d’associations de protéines et de modifications. Cette réponse est constituée de multiples voies, collectivement connus comme l’ADN des dommages réponse (DDR)2,3. La DDR est constitué de l’accumulation des protéines de réparation de l’ADN à des lésions de l’ADN, coordonnées la fois temporellement et spatialement. DDR induit souvent arrêt du cycle cellulaire afin d’éviter la propagation ou l’intensification des dommages qui peuvent survenir au cours de la réplication d’endommagés ADN2,4,5. À son tour, il est également nécessaire pour assurer la viabilité cellulaire désactiver l’arrêt du cycle cellulaire par la dissociation des complexes de réparation après que réparation est terminée.

Parmi les différents types de dommages à l’ADN, CDB est les plus nocives. Pour réparer la CDB peut entraîner dans les réarrangements chromosomiques ou des destructions à grande échelle tels que la perte des bras chromosomiques ensemble. La réparation des CDB est divisée en deux voies6,7,8. Recombinaison homologue (HR) nécessite une sœur chromosome à utiliser comme une matrice d’ADN et ainsi se limite à fin phases S et G2/M du cycle cellulaire9,10. Fin non homologue rejoindre (NHEJ) n’a pas ces restrictions, mais peut causer des destructions de petites lors de la réparation DSBs11,12.

DSB réparer spécifiquement et la DDR sont en général des zones actives de l’enquête. Malgré organisées en parcours idéalement séparés, il y a beaucoup de redondance. En effet, beaucoup de protéines (BRCA1, BRCA2 et l’APR complexe par exemple) est impliqués dans plusieurs voies13,14,15,16. La réparation d’une lésion par une voie, peut conduire à un intermédiaire de dommages qui doit être réparé par une autre voie14. L’entrelacement de ces voies, combinées à leur tâche complexe de recruter les protéines juste à la bonne place pour le montant précis du temps nécessaire, requiert un processus de réglementation à plusieurs niveaux.

Un récent rapport met en évidence les subtilités de la DDR en démontrant que réparation complexant, résolution et la localisation peuvent chacun séparément être altérée17. L’objectif global du protocole suivant consiste à disséquer définitivement la capacité des cellules pour réparer les ORD. À l’aide de la microscopie en immunofluorescence, accumulation de protéines de réparation sur les sites des dommages peut être visualisée aux points représentatifs de temps après l’induction de la CDB.

Cette technique présente plusieurs avantages aux approches couramment utilisés. Réparation est souvent étudiée à des moments unique et incapable de représenter le processus dynamique de regroupement et de dissociation des complexes de réparation. Observant la totalité de la réparation de l’activation initiale à la pleine résolution assure qu’un retard dans la réparation n'est pas confondu avec une inhibition complète. À l’inverse, il assure que l’induction d’une réponse de réparation qui ne peut inactiver ladite réponse n'est pas confondu avec la normale ou l’activation excessive.

Formation d’un complexe protéique retardée et la mauvaise localisation des protéines de réparation, cependant, ne peuvent pas clairement distinguer grâce à cette approche. Pour déterminer si les protéines de réparation sont mal localisées contre retardés dans leur localisation, une « longue durée » ORD peut être introduit par clivage enzymatique de l’ADN cellulaire. La lésion qui en résulte est retaillée chaque fois qu’il est réparé, ce qui entraîne un accent distinct grande réparation nucléaire et supprimant la restriction temporelle du recrutement. Ceci peut être réalisé en modifiant l’approche existante à l’aide d’une endonucléase coupe rares (p. ex., I-SceI) pour induire une ORD de longue durée. La longévité des CDB permet la visualisation des protéines de réparation insaisissable par la microscopie en immunofluorescence. L’abondance accrue pourrait aussi améliorer la visualisation quand la détection est entravée par la limitation de la qualité de l’anticorps, une caractéristique qui pourrait être utile lorsque le moindre protéines étudiées sont identifiés comme ayant un impact sur la réparation de l’ADN.

En particulier, nous fournissons des instructions explicites pour un logiciel gratuit d’images traitement et analyse (p. ex., ImageJ). Cela supprime un obstacle financier important en analyse d’images, l’interrogatoire de réparation de l’ADN à un public plus large d’ouverture.

Protocole

Veuillez noter que ce protocole est écrit pour U2OS cellules contenant un I-SceI reconnaissance site18. Les cellules ne sont pas nécessairement U2OS, mais doivent contenir le site I-SceI. Le protocole peut devoir être ajustée (p. ex., nombre de cellules ensemencées et temps d’incubation) selon le type de cellules utilisées.

1. la définition de la cinétique de la Formation d’un complexe réparation ORD

  1. La croissance de cellules U20S-DRGFP sur une plaque de culture de tissu de 10 cm jusqu'à 85-90 % confluentes.
  2. Retirez le support et laisser incuber à température ambiante (RT) dans 3 mL d’EDTA pendant 2 min.
  3. Remplacer l’EDTA avec 1 mL de trypsine et incuber à 37 ° C pendant 5 min. veiller à ce que les cellules sont détachent de la surface de la plaque par Regarde un sous un microscope. Neutraliser la trypsine avec 5 mL de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline/streptomycine.
  4. Déterminer la concentration de cellules en suspension à l’aide d’un hémocytomètre et la méthode d’exclusion bleu de trypan.
  5. Graines de 6 x 103 cellules/puits dans 200 µL d’une plaque de 96 puits de fond en verre. Alternativement, les semences 4 x 106 cellules en 8 mL sur 12 mm lamelles placés dans la plaque de 10 cm.
    Remarque : Chaque puits ou la lamelle couvre-objet représente un moment unique, y compris le contrôle.
  6. Cultiver les cellules durant la nuit à 37 ° C et 5 % de CO2.
  7. Induisant la CDB
    1. Remplacer le support de la plaque de 96 puits/10 cm plat avec H2O2 diluée à une concentration de 25 µM avec DMEM + 10 % FBS et incuber à 37 ° C pendant 1 h.
    2. Laver les cellules 3 x avec 1 x PBS et remplacez-les par des frais DMEM additionnés de 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine. Incuber les cellules à 37 ° C de 0, 1, 4, 8, 24 et 48 h. veiller à ce que les dilutions frais de H2O2 sont utilisées pour chaque expérience.
      Remarque : Pour éviter de tuer les cellules à la concentration de2 H2O utilisé ici, s’assurer que la dose de dégâts est faible, assez de sorte que la majeure partie des cellules permettra d’éviter l’apoptose et la sénescence. Il est essentiel d’observer le processus de récupération. Ceci est mieux réalisé en mesurant la sensibilité à un éventail de doses. Effectuer un test MTT ou autre analyse de viabilité de cellules afin de déterminer la concentration minimale du peroxyde d’hydrogène qui peut être utilisé.
  8. Fixation et perméabiliser les cellules
    1. Laver les cellules 3 fois avec du PBS 1 x. Retirer un lamelle couvre-objet de la plaque de 10 cm pour chaque point dans le temps et le placer dans un seul puits d’une plaque 24 puits de fixation. Utilisez l’aiguille et une pince pour retirer délicatement la lamelle couvre-objet et éviter de rayer les cellules de la surface de la lamelle couvre-objet.
    2. Fixer les cellules en incubant pendant 15 min avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) à désigné fois après 1 h d’exposition de2 H2O et frais remplacement DMEM (0, 1, 4, 8, 24 et 48 heures).
    3. Laver les lamelles fixes 3 fois avec du PBS. Permeabilize les cellules avec un détergent non ionique 0,5 % dilué dans une solution 1 PBS x. Incuber pendant 15 min à ta, avant de se laver 3 fois avec du PBS.
      Remarque : Après perméabilisation, stockage des lamelles couvre-objet est possible dans du PBS à 4 ° C pendant au moins une semaine.
  9. Réparation de visualisation complexe
    1. Bloquer la plaque de 96 puits/lamelles dans une solution de 3 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,1 % de détergent non ionique dilué dans du PBS 1 x (solution à 3 % BSA) pendant 1 h à température ambiante.
    2. Incubez avec des anticorps primaires qui ciblent la protéine réparation d’intérêt, dilué selon les spécifications du fabricant dans une solution BSA 3 % pendant 1 h à RT, avant de se laver 3 fois avec du PBS 1 x.
    3. Incuber les plaques 96 puits/lamelles avec l’anticorps secondaire dilué selon le protocole du fabricant dans la solution de BSA de 3 %. Confirmer que les fluorophores secondaires n’ont pas de chevauchement d’excitation ou de spectres d’émission.
    4. Après avoir lavé les cellules avec PBS 3 fois ajouter DAPI, dilué selon les spécifications du fabricant en 1 x PBS et incuber à RT pendant 5 min.
    5. Monter les lamelles sur glissières avec une goutte de l’agent de montage en s’assurant que les faces latérales de la cellule vers le bas. Pressez les lamelles avec précaution et s’imprégner de tout agent de montage excédentaire avec une lingette.
    6. Sceller les lamelles couvre-objet avec rapide-séchage de vernis à ongles transparent et assurer une étanchéité complète de la lamelle avec la diapositive.
    7. Prendre les images de microscope confocal en mettant l’accent sur le canal DAPI, avant les autres chaînes (avec des signaux de gène de réparation d’ADN d’intérêt) pour éviter d’introduire un biais dans l’expérience.
    8. Alternativement, des images peuvent être acquises en prenant les profilés en Z de la région désirée et condensation de l’image en un seul plan pour visualiser tous les foyers détectables.
      Remarque : Si l’ORD résolution ou la protéine d’intérêt n’est pas observée aux moments choisis, déterminent quand DSBs résoudre en sélectionnant un large éventail de points dans le temps initialement (0 à 48 h après induction de l’ORD). Les points d’intérêt dans le temps variera selon la méthode d’induction de l’ORD et la réparation de protéine d’intérêt.
  10. Logiciel gratuit de ImageJ permet de définir les noyaux dans les images de microscopie d’immunofluorescence.
    Remarque : Pour ouvrir des images de microscope, le Bio-Formats plugin doit être installé dans ImageJ.
    1. Ouvrez les images confocales (.czi ou .tif) en faisant glisser le fichier image dans la fenêtre de ImageJ, ou en sélectionnant « Bio-Formats importateur » de la barre d’outils « Plugin » dans ImageJ.
      Remarque : La fenêtre « Option Bio-Formats d’importation » s’affiche.
    2. Sélectionnez « Chaînes de Split » pour diviser l’image en DAPI constitutif et fluorescents images dans la fenêtre « Option Bio-Formats d’importation ».
    3. Dans « Options de couleur » dans le menu déroulant, sélectionnez « Colorisée ». Sélectionnez « OK » pour ouvrir le DAPI et Histone H2AX (H2AX) images comme séparer windows et choisissez l’image DAPI.
    4. Sélectionnez la barre d’outils « Image » et l’option « Ajuster le seuil » pour sélectionner les noyaux.
      NOTE : Une fenêtre de « Seuil » s’affiche.
    5. Régler le seuil de l’image en faisant glisser la barre inférieure de la fenêtre de « Seuil » complètement vers la droite. Ajuster la barre du haut jusqu'à ce que les noyaux apparaissent complètement rouges avec contours distincts et le fond noir. NE sélectionnez pas appliquer. Fermez la fenêtre « Ajuster le seuil ».
    6. Sélectionnez la barre d’outils « Analyser » et option « Analyser les particules ». Voir une fenêtre de « Analyser les particules » apparaissant à l’écran.
    7. La taille minimale d’un noyau de l’entrée.
      Remarque : Les particules inférieures à la taille entré ne seront pas comptés comme noyaux.
    8. Dans le menu déroulant « Afficher », sélectionnez « Contours ». Sélectionnez l’option « Ajouter à Manager ». Cliquez sur « OK » pour ouvrir une fenêtre « Gestionnaire de ROI ».
      Remarque : Les contours des noyaux apparaîtra dans une fenêtre séparée.
    9. Affecter des numéros aux noyaux qui peuvent être sélectionnés dans la fenêtre « Gestionnaire de ROI ».
  11. ImageJ permet de quantifier des foyers de H2AX dans images de microscopie d’immunofluorescence.
    1. Sélectionnez la fenêtre de foyers « H2AX » (colorée avec des anticorps secondaire conjugué fluorescent). Ensuite, sélectionnez la barre d’outils « Processus » et choisissez « Trouver Maxima » pour trouver les foyers dans les noyaux.
      NOTE : Une fenêtre de « Trouver des Maxima » s’ouvrira.
    2. Choisissez l’option « Single Points » dans le menu déroulant « Type de sortie » et sélectionnez « Sélection du point Aperçu » pour visualiser les maxima/foyers. Entrez une valeur de « Bruit tolérance » selon l’intensité de la fluorescence de l’image (Figure 1). Vérifier l’apparition d’une fenêtre blanche avec petits points noirs.
      Remarque : Ces points représentent les foyers H2AX/maxima qui ont été détectés. La valeur de tolérance de bruit doit être maintenue constante pour toutes les images en cours d’analyse. Une tolérance basse/haute bruit décrire les trop nombreux/quelques-uns maxima (foyers) dans le noyau et ne sera pas une représentation exacte des foyers dans le noyau.
    3. Sélectionnez les noyaux pour lequel H2AX foyers doivent être quantifiés pour partir de la fenêtre « Gestionnaire de ROI ». Sélectionnez tous les noyaux en cochant l’option « Afficher tout ».
    4. Sélectionnez « Mesure » pour mesurer le nombre de maxima/foyers dans les noyaux sélectionnés.
      Remarque : Le nombre de maxima/foyers apparaître comme des multiples de 255, c'est-à-dire, une maximale a une lecture de « RawIntDen » (densité intégrée) de 255.
    5. Copier les valeurs de « RawIntDen » et les coller dans le logiciel d’analyse des données.

2. analyse de localisation d’une rupture de l’ADN Double-brin de longue durée

  1. Cellules de semence sur 96 puits plaques/lamelles couvre-objet tel que décrit dans les sections 1.1 et 1.2.
  2. Induction de cassures double brin de l’ADN
    1. Transfecter les cellules avec le vecteur d’expression d’I-SceI à l’aide d’un réactif de transfection à base de lipides selon les spécifications du fabricant. Attendre 24 à 72 h après la transfection d’optimiser l’expression de l’endonucléase. Déterminer si la transfection était réussie en repérant des cellules avec un accent singulier grand nucléaire γ-H2AX.
  3. Acquisition d’images
    1. Difficulté, permeabilize, bloquer et laver la plaque 96 puits/lamelles comme décrit dans la section 1.8.
    2. Incuber les cellules avec un anticorps dirigé contre la γ-H2AX et la réparation de protéine d’intérêt (ici, un anticorps primaire contre RAD51 servait) dilué selon les spécifications du fabricant en solution à 3 % BSA.
    3. Laver la plaque de 96 puits/lamelles 3 fois avec du PBS 1 x. Incuber les plaques 96 puits/lamelles avec l’anticorps secondaire dilué selon le protocole du fabricant dans la solution de BSA de 3 %. Confirmer que les fluorophores secondaires n’ont pas de chevauchement d’excitation ou de spectres d’émission.
    4. Identifier les cellules qui ont un foyer grand γ-H2AX nucléaire. Seulement prendre des photos de ces cellules pour éviter le biais.
  4. Analyse de longue durée I-SceI induite par foci
    1. Analyser manuellement, les foyers de longue durée en comptant le nombre de cellules qui ont la grande γ-H2AX foyers et foyers co localisées de la réparation de protéine d’intérêt.

Résultats

La figure 1 illustre la sélection de la discrimination de bruit correct pour la quantification de maxima/foyers utilisant ImageJ. Les images fusionnées de DAPI et la réparation de protéine d’intérêt sont sur le panneau de gauche. Figure 1 a montre une discrimination de bruit de 90 et marque le nombre exact de foyers. Sur le bord (représenté par une flèche rose) et les foyers à l’extérieur des noyaux (représentés ...

Discussion

L’analyse de l’ADN endommagent la réparation en général et la réparation des cassures double brin de l’ADN est précisément un domaine actif de recherche parce que ses conséquences s’étendent de tumorigenèse biologie fondamentale6,20. Détails de ce manuscrit une approche qui dissèque avec précision l’apport de protéines RAD51 et γ-H2AX à la résolution des CDB par HR. hâte, cette méthode peut servir à élucider les fonctions supplément...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Joel Sanneman et Dr Philine Wangemann du noyau microscopie confocale, financé par la Kansas State University College of Veterinary Medicine, pour leur appui des efforts déployés pour développer cette technique. pCBASceI est un cadeau de Maria Jasin (Addgene plasmide # 26477) 30. Les cellules U2OS DR-GFP ont été un gentil cadeau de Maria Jasin18.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm CoverslipsVWR89015-725
16% Paraformaldehyde (PFA)ThermoFisher Scientific28908
24-well plateVWR82050-892
96-well glass bottom plateCellvisP96-1.5H-N
Anti-H2AX Alexa488EMD Millipore05-636-AF488
Anti-Rad51 (D4B10) Cell Signaling Technology8875S
Bio-formats plugin for ImageJNational Institute of Health (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
Bovine Serum Albumin (BSA)VWR97061-416
DAPIThermoFisher ScientificD1306
DMEM, High GlucoseThermoFisher Scientific12100046
EDTAInvitrogen15576-028
Fetal Bovine Serum (FBS)VWR89510-194
Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594ThermoFisher Scientific A-11012 
Hydrogen Peroxidesigma-Aldrich216763-100ML
ImageJ SoftwareNational Institute of Health (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/
I-SceI Expression VectorAddgene26477
Nail Polish- Insta DriSally and HansenClearly Quick (103)
Phosphate Buffered Saline (PBS)Bio BasicPD8117
ProLong Gold Antifade ReagentLife TechnologiesP36930
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4049-500ML
TurboFect Transfection ReagentThermoFisher ScientificR0531
Tween-20Fisher ScientificBP337-500

Références

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