면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

요약

이중 가닥 DNA 틈의 수리 후 병 변 해결 뿐만 아니라 휴식, 하지만 또한 그들의 해상도에 선 단지의 형성을 필요로 역동적인 과정 이다. 여기, 사용 면역 형광 검사 현미경 검사 법 과도 하 고 오래 견 딘 더블-좌초 휴식을 위한 도구로 서이 게놈 유지 관리 메커니즘을 해 부 합니다.

초록

더블-좌초 틈 (DSBs) DNA의 복구는 매우 조정된 과정, 형성 및 다중 단백질 수리 단지의 해상도 필요로. 이 프로세스는 협회를 홍보 하는 단백질의 무수 한와이 병 변이 단백질의 분열에 의해 통제 된다. 단백질의 광대 한 도서관의 기능 화면 수행 하는 능력에 큰 부분에 감사 합니다, 이중 가닥 DNA 틈 수리에 필요한 유전자의 큰 감사 이다. 종종 녹아웃 또는 화학 억제 물 스크린 DSB 수리에 필요한 단백질에 대 한 표식으로 증가 독성을 사용 하 여 복구 프로세스에 관련 된 단백질을 식별 합니다. 하지만 게놈 충실도 유지에 관련 된 식별 소설 세포질 단백질에 대 한 유용한 기능 분석 관심사의 단백질 지역화, 형성, 또는 수리 복합물의 해결책을 촉진 하는 여부의 결정을 필요로 합니다.

수리 단백질의 축적 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 고유 핵 foci로 쉽게 감지 수 있습니다. 따라서, 협회 및 DNA 손상의 사이트에이 단백질의 분열 이중 가닥 DNA 틈의 유도 후 이러한 핵 foci 대표 간격으로 관찰 하 여 액세스할 수 있습니다. 이 방법은 또한 수리 결함 수리에서 불완전 지연으로 동시에 발생 하지 않습니다 경우 잘못 지역화 된 복구 요소 단백질를 식별할 수 있습니다. 이 시나리오에서는 긴-지속 이중 가닥 DNA 휴식 했다 효소에 대 한 인식 사이트 세포 게놈으로 통합 되어 셀에 드문 절단 endonuclease (예를 들어, SceI)으로 표현 하 여 설계 수 있다. 결과 병 변 특히 충실 한 수리 효소의 인식 사이트, 분열의 또 다른 라운드를 메시지를 다시 것입니다 해결 하기 어렵다. 그 결과, 수리의 속도에 차이 제거 됩니다. 수리 단지 형성 하지는 경우 지역화 장애가 되어 있다. 이 프로토콜 수리 단백질 지 방화 뿐만 아니라 복구 속도 론 변경 내용을 식별 하는 데 필요한 방법론을 설명 합니다.

서문

매일, 모든 세포는 인체에는 약된 10, 000으로 포 격 된다 DNA 장애¹. 이 생존의 위협을 셀 뿐만 아니라 돌연변이, 발암에 대 한 위험에서 우리를 박 았 죽음. 게놈 충실도 보호 하기 위해 포유류 세포는 복잡 한 일련의 단백질 연결 및 수정 된 DNA 손상 응답 하 진화 했다. 이 응답은 여러 통로, DNA 손상 응답 (DDR)^2,3로 총칭으로 구성 됩니다. DNA 병 변, 일시적으로 그리고 공간 조정에 DNA 수 선 단백질의 축적은 DDR에 의하여 이루어져 있다. DDR 자주 전파 또는 손상 된 DNA^2,,45의 복제 하는 동안 발생할 수 있는 손상의 강화를 피하기 위해 세포 주기 검거를 유도 합니다. 차례 차례로, 그것은 또한 수리 완료 된 후 복구 단지를 분리 하 여 세포 주기 검거를 세포 생존에 필요한.

DNA 손상의 다양 한 종류 중에서 DSBs는 가장 해로운. DSBs 복구 실패 염색체 재배열 또는 전체 염색체 팔의 손실과 같은 대규모 삭제 될 수 있습니다. DSBs 수리 두 경로^6,,78으로 분할 된다. 동종 재결합 (HR) 필요 자매 염색체 DNA 템플렛으로 사용 하 여 따라서 늦은 S와 G2/M 단계의 세포 주기^9,10로 제한 됩니다. 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 이러한 제한에는 없습니다 하지만 DSBs^11,12복구 때 작은 삭제를 발생할 수 있습니다.

DSB 특히 수리와 DDR 일반적 조사의 활성 영역이 있습니다. 편리 하 게 분리 된 경로에 조직 되 고에 불구 하 고 중복의 큰 거래가 이다. 실제로, 많은 단백질 (BRCA1, BRCA2, 그리고 예를 들어 복잡 한 RPA) 여러 경로^13,14,,1516에서 포함 된다. 한 통로 의해 병 변의 수리는 다른 통로¹⁴에 의해 복구 해야 하는 중간 손상으로 이어질 수 있습니다. 필요한 시간의 정확한 금액에 대 한 올바른 위치에 올바른 단백질 보충의 그들의 복잡 한 작업을 함께 이러한 통로의 하나는 다중 계층 규제 프로세스를 필요 합니다.

최근 보고서는 수리 복잡 한 형성, 해상도 및 지역화 각각 별도로 수 장애인된¹⁷으로 DDR의 복잡 한을 강조 한다. 다음과 같은 프로토콜의 전반적인 목표는 DSB를 복구 하는 세포의 능력이 결정적으로 부. 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여, 손상의 사이트에서 수리 단백질의 축적 DSBs의 유도 따라 대표적인 시간 지점에서 구상 될 수 있다.

이 기술은 일반적으로 사용 되는 방법에 몇 가지 장점이 있습니다. 자주, 수리 한 번 포인트에서 조사 하 고 어셈블리의 동적 과정과 수리 단지의 분리를 나타내는 능력입니다. 전체 해상도로 초기 활성화에서 복구의 전체 범위를 관찰 하면 수리에서 지연 완전 한 금지로 오인 하지. 반대로, 그것은 했다 응답을 비활성화 수 있는 수리 응답의 감 응 작용 정상 또는 과도 한 정품 인증으로 오인 하지 보장 합니다.

그러나 지연된 단백질 복잡 한 형성 및 복구 단백질의 잘못 지역화, 수 없습니다 명확 하 게 구별 될이 방식으로. 확인 하려면 복구 단백질 대 잘못 지역화 된 그들의 지 방화에 지연, "오랫동안" DSB 세포질 DNA의 효소 분열을 통해 도입 수 있습니다. 결과 병 변 수리는, 뚜렷한 큰 핵 수리 초점 고 모집에서 시간 제한을 제거 때마다 recut 이다. 이 드문 절단 endonuclease (예를 들어, SceI) 오랫동안 DSB를 유발을 사용 하 여 기존 접근 방식을 수정 하 여 구현할 수 있습니다. DSBs의 장 수는 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 애매 수리 단백질의 시각화 수 있습니다. 또한 향상 된 풍부는 탐지 항 체 품질, 덜 공부 단백질 DNA 복구에 영향을 미치고로 식별 하는 경우 도움이 될 수 있는 기능에에서 제한에 의해 방해 된다 때 시각화를 향상 수 있습니다.

특히, 우리는 무료 이미지 처리 및 분석 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ)에 대 한 명시적인 지침을 제공합니다. 이미지 분석, DNA 손상 복구를 심문을 열고 주요 금융 장벽을 제거 합니다.

프로토콜

제발 참고,이 프로토콜은 작성 된-SceI 인식 사이트¹⁸를 포함 하는 U2OS 세포. 셀은 U2OS 필요가 없습니다 하지만-SceI 사이트를 포함 해야 합니다. 프로토콜 조정 (예를 들어, 셀 시드 및 보육 시간) 되도록 할 수 있습니다 사용 하는 세포의 종류에 따라.

1. 정의 DSB 수리 복잡 한 대형의 활동

1. Confluent 85-90%까지 10cm 조직 문화 접시에 U20S DRGFP 세포를 성장 한다.
2. 미디어를 제거 하 고 2 분에 대 한 EDTA의 3 mL에서 실 온 (RT)에서 품 어.
3. 트립 신 1 mL를 EDTA를 대체 하 고 5 분 확인 셀에서 현미경으로 접시의 표면에서 분리는 37 ° C에서 품 어. 5 mL의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 보충 된 트립 신을 무력화.
4. 이 정지는 hemocytometer trypan 블루 제외 메서드를 사용 하 여 셀의 농도 결정 합니다.
5. 시드 6 x 10³ 유리 하단 96 잘 접시 200 µ L에 셀/잘. 또는, 12 m m coverslips에 8 mL에 씨앗 4 x 10⁶ 전지 10 cm 접시에 배치합니다.
   참고: 각 잘 또는 coverslip 컨트롤을 포함 하 여 한 번 포인트를 나타냅니다.
6. 37 ° C, 5% CO₂에서 하룻밤 세포 성장.
7. 유도 하는 DSBs
   1. H₂O₂ DMEM + 10%와 25 µ M의 농도를 희석 96 잘 접시/10 cm 접시에서 미디어 바꿉니다 FBS와 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
   2. 워시 PBS x 1 3 x와 신선한 DMEM 바꿀 보충 10 %FBS 1% 페니실린/스 셀. 0, 1, 4, 8, 24, 37 ° C에서 48 h. 확인 H₂O₂ 의 신선한 희석 각 실험을 위해 사용 되는 셀을 품 어.
      참고: 여기에 사용 된 H₂O₂ 농도에서 세포를 죽이 피하기 위해, 충분히 apoptosis와 노화 세포의 대량 피할 것 이다 그런 손상의 복용량 낮은 인지 확인 합니다. 복구 프로세스를 관찰 하는 것이 중요 하다입니다. 이 최고의 복용량의 범위에 감도 측정 하 여 이루어집니다. MTT 분석 결과 또는 사용할 수 있는 과산화 수소의 최소 농도 결정 하기 위해 다른 세포 생존 능력 분석 실험을 수행 합니다.
8. 담합 및 셀 permeabilizing
   1. 3 번 1 x PBS로 세포 세척. coverslip 각 시간 지점에 대 한 10 cm 접시에서 제거 하 고 해결을 위한 24-잘 접시의 단일 우물에. 바늘과 포 셉을 사용 하 여 조심 스럽게 제거 하는 coverslip 고 coverslip 표면에서 세포를 긁힘 방지.
   2. H₂O₂ 노출 및 신선한 DMEM 교체 (0, 1, 4, 8, 24, 및 48 h)의 1 시간 후에 시간을 지정 하는 셀에 4 %paraformaldehyde (PFA)와 15 분 동안 배양 하 여 수정.
   3. 고정된 coverslips PBS로 3 회 세척. 1 x PBS에 희석 0.5% 비 이온 세제로 세포를 permeabilize. PBS 가진 3 배를 세척 하기 전에 RT에서 15 분 동안 품 어.
      참고: 후에 permeabilization, coverslips의 저장 가능 하다 PBS에 4 ° C에서 적어도 일주일 동안.
9. 복잡 한 시각화를 복구
   1. 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)과 0.1% 비 이온 세제 1 x PBS에 희석의 솔루션에 96 잘 접시/coverslips 차단 (3 %BSA 솔루션) 실시간에서 1 h
   2. 관심, RT에서 1 h 3 %BSA 솔루션에서 제조업체의 사양에 따라 1 x PBS로 3 회 세척 하기 전에 희석의 수리 단백질을 대상으로 1 차 항 체로 품 어.
   3. 이차 항 체 3 %BSA 솔루션에서 제조 업체의 프로토콜에 따라 희석 된 96 잘 접시/coverslips를 품 어. 확인 하는 보조 fluorophores 겹치는 구동 또는 없는 방출 스펙트럼.
   4. 셀 PBS 3 시간을 세척 후 추가 DAPI, 1 x PBS에 제조업체의 사양에 따라 희석 하 고 5 분 RT에서 품 어.
   5. 아래 셀 쪽 얼굴 확인 하 장착 에이전트의 드롭 슬라이드에 coverslips를 탑재 합니다. coverslips를 신중 하 게 누르고 닦기와 어떤 초과 설치 에이전트를 흡수.
   6. 투명 매니큐어 빠른 건조와 coverslips를 밀봉 하 고 슬라이드 coverslip의 완전 한 도장 합니다.
   7. 실험으로 편견을 소개 하는 피하기 위해 DAPI 채널 (관심사의 DNA 복구 유전자에서 신호)와 다른 채널 앞에 초점을 맞춤 으로써 confocal 현미경 이미지를 가져가 라.
   8. 또는, 이미지 Z-섹션의 원하는 영역을 복용 하 고 모든 감지 foci 시각화 하는 단일 평면에 이미지를 응축 하 여 취득 될 수 있다.
      참고: DSB 해상도 또는 관심사의 단백질은 시간 포인트 선택에 나타나지 않으면, 결정 DSBs 처음 시간 포인트의 넓은 범위를 선택 하 여 해결 하는 경우 (0-48 h 후 DSB 유도). 관심의 시간 포인트 DSB 유도 방법 및 관심사의 수리 단백질에 의해 달라 집니다.
10. ImageJ는 무료 소프트웨어를 사용 하 여 면역 형광 현미경 이미지에 핵을 정의.
    참고: 현미경 이미지를 열려면 바이오 포맷 플러그인 ImageJ에 설치 되어야 합니다.
    1. ImageJ의 "플러그인" 도구 모음에서 confocal 이미지 (.czi 또는.tif) ImageJ 창에 이미지 파일을 드래그 하거나 "바이오 형식 가져오기"를 선택 하 여 엽니다.
       참고: "바이오 형식 가져오기 옵션" 창이 나타납니다.
    2. "분할 채널" 제정 DAPI와 "바이오 형식 가져오기 옵션" 창에서 형광 이미지 이미지 분할을 선택 합니다.
    3. 드롭 다운 메뉴에서 "색상 옵션"에서 "Colorized"를 선택 합니다. DAPI와 히스톤 H2AX를 엽니다 "확인"을 선택 합니다 (H2AX)로 windows를 별도 영상과 DAPI 이미지를 선택 하십시오.
    4. "이미지" 도구 모음 및 핵을 선택 하는 "조정 임계값" 옵션을 선택 합니다.
       참고: "임계값" 창이 나타납니다.
    5. 오른쪽에 "임계값" 윈도우의 하단 표시줄을 완전히 밀어 이미지 임계값을 조정 합니다. 핵 뚜렷한 윤곽선과 배경 블랙 완전 빨간색 표시 될 때까지 가기 막대를 조정 합니다. 선택 하지 않으면 적용. "임계값 조정" 창을 닫습니다.
    6. "분석" 도구 모음 및 "입자 분석" 옵션을 선택 합니다. 화면에 나타나는 "입자 분석" 창을 참조 하십시오.
    7. 핵의 최소 크기를 입력 합니다.
       참고: 입력 크기 아래 입자 핵으로 계산 하지 않습니다.
    8. "보기" 드롭다운 메뉴에서 "설명"을 선택 합니다. "관리자 추가" 옵션을 선택 합니다. "ROI 관리자" 창을 엽니다 "확인"을 클릭 합니다.
       참고: 핵의 윤곽선은 별도 창에 표시 됩니다.
    9. "ROI 관리자" 창에서 선택할 수 있는 핵에 번호를 할당 합니다.
11. ImageJ를 사용 하 여 면역 형광 현미경 이미지에 H2AX foci 계량.
    1. "H2AX" foci 창 (물 붙일 활용 된 이차 항 체)를 선택 합니다. 다음, "프로세스" 도구 모음을 선택 하 고 "맥시 마 찾기"는 핵 내에서 포커스를 찾을 수를 선택 합니다.
       참고: "맥시 마 찾기" 창이 열립니다.
    2. "출력 형식" 드롭 다운 메뉴에서 "단일 포인트" 옵션을 선택 하 고 "미리 보기 위치 선택"을 선택 맥시 마/foci 시각화. "잡음" 허용치 이미지 (그림 1)의 형광 강도 따라 입력 합니다. 작은 검은 점 들과 흰색 창의 모양을 확인 합니다.
       참고:이 점을 고 H2AX foci/맥시 마 검색 된 나타냅니다. 소음 허용 오차 값 분석 되 고 모든 이미지에 대 한 상수 유지 되어야 합니다. 낮은/높은 소음 허용 오차는 핵 내에서 너무 많은/몇 맥시 마 (포커스)를 묘사 하 고 핵 내의 foci의 정확한 표현 되지 않습니다.
    3. 핵을 H2AX foci 해야 합니다 측정할 수에 대 한 "투자 수익 관리자" 창에서 선택 합니다. "모두 표시" 옵션을 선택 하 여 모든 핵을 선택 합니다.
    4. 맥시 마/foci 선택한 핵 내에서 수를 측정 하는 "측정"을 선택 합니다.
       참고: 맥시 마/foci 수 255, 즉의 배수로 표시, 하나의 최대 255의 "RawIntDen" (통합된 밀도) 읽기.
    5. "RawIntDen" 값을 복사 하 고 데이터 분석을 위한 소프트웨어에 붙여 넣어.

2. 오랫동안 이중 가닥 DNA 틈에 지역화 분석

1. 96 잘 접시/coverslips 설명 섹션 1.1와 1.2에 시드 셀.
2. 이중 가닥 DNA 틈의 유도
   1. 제조업체의 사양에 따라 지질에 기초를 둔 transfection 시 약을 사용 하 여-SceI 식 벡터와 셀 transfect. Transfection endonuclease 식 최대화 하기 후 24-72 h를 기다립니다. 단 수 큰 핵 γ-H2AX 초점 세포를 찾아 transfection는 성공 했는지 확인 합니다.
3. 이미지의 획득
   1. 수정, permeabilize, 차단, 그리고 1.8 섹션에 설명 된 대로 96 잘 접시/coverslips 세척.
   2. 공동 γ H2AX와 관심의 수리 단백질에 대 한 항 체와 세포를 품 어 (여기, RAD51에 대 한 1 차적인 항 체 사용) 3 %BSA 솔루션에서 제조업체의 사양에 따라 희석.
   3. 96 잘 접시/coverslips 1 x PBS로 3 회 세척. 이차 항 체 3 %BSA 솔루션에서 제조 업체의 프로토콜에 따라 희석 된 96 잘 접시/coverslips를 품 어. 확인 하는 보조 fluorophores 겹치는 구동 또는 없는 방출 스펙트럼.
   4. 큰 핵 γ H2AX 포커스가 있는 셀을 식별 합니다. 만을 편견을 피하기 위해 이러한 셀의 사진을 찍을.
4. 오랫동안 SceI의 분석 유도 포커스
   1. 큰 γ-H2AX foci 및 관심사의 수리 단백질의 공동 화 된 foci 있는 셀 개수를 계산 하 여 오랫동안 포커스를 수동으로 분석.

결과

그림 1 은 맥시 마/foci 정량화 ImageJ를 사용 하 여에 대 한 올바른 잡음 차별의 선택을 묘사 한다. DAPI의 병합 된 이미지 및 복구 단백질의 왼쪽된 패널에 있습니다. 그림 1A 90의 잡음 차별 보여준다 고 foci의 정확한 수를 표시 합니다. 핵 가장자리 (분홍색 화살표 표시)와 포커스 (노란색 화살표가 그려져) 핵 외부에 정량화 하는 동?...

토론

DNA의 분석 손상 수리 일반적 이며 이중 가닥 DNA 틈의 수리 구체적으로 연구의 활성 영역 그 결과 기본적인 생물학^6,20tumorigenesis 범위 때문에. 이 원고 세부 사항 정확 하 게 dissects 시간 기대,이 방법을 통해 DSBs 해상도 RAD51 및 γ-H2AX 단백질의 기여 하는 방식 명료 DSBs¹⁴수리 단백질의 추가 기능을 사용할 수 있습니다. 복구 활동의 비교와, ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mm Coverslips	VWR	89015-725
16% Paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher Scientific	28908
24-well plate	VWR	82050-892
96-well glass bottom plate	Cellvis	P96-1.5H-N
Anti-H2AX Alexa488	EMD Millipore	05-636-AF488
Anti-Rad51 (D4B10)	Cell Signaling Technology	8875S
Bio-formats plugin for ImageJ	National Institute of Health (NIH)		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	97061-416
DAPI	ThermoFisher Scientific	D1306
DMEM, High Glucose	ThermoFisher Scientific	12100046
EDTA	Invitrogen	15576-028
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	89510-194
Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594	ThermoFisher Scientific	A-11012
Hydrogen Peroxide	sigma-Aldrich	216763-100ML
ImageJ Software	National Institute of Health (NIH)		https://imagej.nih.gov/ij/
I-SceI Expression Vector	Addgene	26477
Nail Polish- Insta Dri	Sally and Hansen	Clearly Quick (103)
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Bio Basic	PD8117
ProLong Gold Antifade Reagent	Life Technologies	P36930
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
TurboFect Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	R0531
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500