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  • Résumé
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  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

L’objectif de cette technique consiste à préparer une culture fortement enrichie des motoneurones primaires (MNs) de moelle épinière murine. Afin d’évaluer les conséquences des mutations responsables de maladies MN, nous décrivons ici l’isolement de ces isolés MNs et leur transfection par magnétofection.

Résumé

Neurodégénérescence des motoneurones spinaux (MNs) est impliquée dans un large éventail de troubles neurologiques comme la sclérose latérale amyotrophique, maladie de Charcot-Marie-Tooth et amyotrophie spinale, qui sont tous associés à une atrophie musculaire. Les cultures primaires de MNs de la colonne vertébrale ont été largement utilisés pour démontrer l’implication des gènes spécifiques à ces maladies et de caractériser les conséquences cellulaires de leurs mutations. Cette culture de modèles une MN premier protocole dérivé de l’ouvrage fondateur de Henderson et ses collègues il y a plus de vingt ans. Tout d’abord, nous détaillons une méthode de dissection des cornes antérieures de la moelle épinière d’un embryon de souris et isoler la MNs de cellules à l’aide d’un gradient de densité voisines. Puis, nous présentons une nouvelle façon de transfectants efficacement MNs avec des plasmides d’expression à l’aide de magnétofection. Enfin, Nous illustrons comment réparer et réagissent primaire que mns. à l’aide des mutations de neurofilaments qui causent la maladie de Charcot-Marie-Tooth type 2, le présent protocole montre une approche qualitative pour exprimer les protéines d’intérêt et d’étudier leur implication dans Croissance de MN, entretien et la survie.

Introduction

Maladies neuromusculaires englobent une variété de pathologies cliniquement et génétiquement distinctes qui sont caractérisées par l’altération du muscle ou le système nerveux. En raison des progrès dans les technologies de séquençage, des centaines de gènes responsables de ces maladies rares ont été identifiées au cours de la dernière décennie (liste disponible à le Neuromuscular Disease Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). La variété des mutations identifiées indique que différentes mutations dans un gène unique peuvent provoquer différents phénotypes et maladies1,2,3 et que les mutations dans les gènes différents peuvent produire des phénotypes semblables 4 , 5. dans ce contexte, il y a des efforts pour développer des modèles cellulaires qui peuvent devenir de puissants outils pour analyser les conséquences de la mutation et de mécanismes pathologiques.

La colonne vertébrale MNs ont grands somas situés dans les cornes ventrales de la moelle épinière, les axones longs forme afin de cibler les fibres musculaires squelettiques et permettre des mouvements volontaires par le biais de la libération d’acétylcholine au niveau des jonctions neuromusculaires. Étant donné que les MNs sont affectés par des maladies neuromusculaires comme la sclérose latérale amyotrophique, maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) et l’atrophie musculaire spinale, Dr Henderson et ses collègues ont mis au point le premier protocole6 qui a permis à la culture de in vitro MNs de la colonne vertébrale et la découverte de neurotrophic factor GDNF7 (facteur neurotrophique dérivé de cellules gliales). Perfectionnements techniques depuis lors ont permis pour la purification plus précise de MNs de la colonne vertébrale et leurs sous-types utilisant FACS8, mais l’enrichissement par gradient de densité reste puissant et largement utilisé dans les laboratoires travaillent actuellement avec primaires MNs de la colonne vertébrale 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. par la suite, il est également possible d’obtenir un grade supérieur de purification MN par immunopanning en profitant du marqueur de surface p75(NTR)15,16,17.

La moelle épinière contient différents sous-types de MNs cervicales, thoraciques et lombaires, ainsi que des colonnes moteurs médians et latéraux qui varient selon leur situation dans la corne antérieure sur un axe dorso-ventral et parmi les cibles qu’ils innervent8, 18. les cultures primaires MN peuvent récupérer toutes ces sous-types de MN dans des proportions physiologiques. La principale limite de cette technique est le faible nombre de MNs obtenus à la fin de la procédure ; en fait, on peut s’attendre à obtenir environ 105 MNs de six embryons, qui convient pour la microscopie, mais limite pour des expériences de biochimie. D’effectuer des expériences avec plus standardisés sous-types et MNs abondantes (> 106 cellules), embryonnaire cellules souches dérivées MNs il faudrait18.

Transfection de sauvage-type/mutant transgènes ou gènes endogènes défiant dans MNs primaires est un outil rapid et utile pour décrypter les voies physiopathologiques, surtout quand les modèles de souris ne sont pas disponibles. Magnétofection est une technique pour la transfection neurones primaires, semblables à lipofection sans la neurotoxicité connexe. En outre, transfection peut être réalisée sur les neurones matures après plusieurs jours in vitro, à la différence des techniques basées sur l’électroporation9. Cependant, un inconvénient de cette technique est que les perles lient les acides nucléiques dans la culture, provoquant des bruits par marquage au DAPI. Infection virale est probablement la technique la plus efficace pour transfectant MNs ; Toutefois, magnétofection ne nécessite pas de certaines procédures de sécurité nécessaires à la production virale et cellulaire infection.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été acceptées par le Comité d’éthique de l’institution.

1. préparation de la solution

  1. Préparer 10 mL de 4 % BSA dialysée dans un milieu L-15.
    1. Dissoudre la poudre de l’albumine sérique bovine à 4 % (p/v) dans 10 mL de milieu de L-15.
    2. Ajouter la solution d’une cassette de dialyse de 20 mL avec un cut-off 20 kDa. Dialyser contre 500 mL de milieu de L-15 pendant 3 jours sous agitation à 4 ° C. Changer le support de L-15 tous les jours.
    3. Filtrer la solution à travers un 0,22 µm membrane et partie aliquote en tubes de 15 mL. Stocker les tubes à-20 ° C.
      Remarque : Ce protocole utilise les références suivantes : non modifié brut moyen de L-15 = L-15 moyen, milieu acide de L-15 = pH L-15 et milieu basique de L-15 = L-15 de Bicarbonate.
  2. Préparation de 200 mL de pH L-15.
    1. Ajuster le pH du milieu L-15 : tout d’abord, remplir un flacon laveur avec quelques morceaux de glace sèche. Injecter du gaz (CO2) dans le milieu de L-15 jusqu'à ce que la couleur devient orange (~ pressions pH 6,4 et environ 40). Le pH peut être également ajusté avec un pH-mètre standard.
    2. Filtrer le milieu à travers un 0,22 µm membrane et conserver à 4 ° C pendant un mois.
  3. Préparer 100 mL de Bicarbonate de L-15.
    1. Ajouter 2,5 mL de bicarbonate de sodium de 7 % à 97,5 mL de milieu de L-15 et de conserver à 4 ° C.
  4. Préparer les suppléments IPCS (insuline Putrescin Conalbumine Sélénite).
    1. Dissoudre 2,5 mg d’insuline dans 0,5 mL de 0,1 M HCl. ajouter 4,5 mL d’eau bidistillée.
    2. Dissoudre 8 mg de putrescine dans 5 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    3. Dissoudre 100 mg de conalbumine dans 10 mL de PBS.
    4. Dissoudre 1 mg de sélénite de sodium dans 19,3 mL d’eau, ajuster le pH à 7,4 et diluer la solution 10 fois.
    5. Mélanger 1 mL de solution d’insuline, 1 mL de solution de la putrescine, 1 mL de la conalbumine et 0,1 mL de solution de sélénite de sodium pour obtenir 3,1 mL de solution de complément de pisc. Conserver la solution à-20 ° C.
  5. Préparer une solution de progestérone de 0,02 mM.
    1. Dissoudre 1 mg de progestérone dans 1,6 mL d’éthanol à 80 %.
    2. Diluer la solution 100 fois à 100 % d’éthanol et de conserver à-20 ° C.
  6. Préparer 100 mL de milieu de L-15 complet.
    1. Ajouter 1,8 mL de solution de D-glucose (200 mg/mL) à 92 mL de pH L-15 d’obtenir une concentration finale de 3,5 mg/mL de glucose.
    2. Mélanger 1 mL de 100 x la pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL), 2 mL de sérum de cheval inactivés par la chaleur, 3,1 mL du mélange de pisc et 0,1 mL de solution de progestérone (2 x 10-5 M).
    3. Filtrer le milieu sur une membrane de 0,22 µm et conserver à 4 ° C.
  7. Préparer 5 mL de solution gradient de densité (concentration finale de 5,5 %) par l’expérience.
    1. Ajouter 476 µL de milieu dégradé 60 % densité commerciale à 4524 µL de L-15 (si possible, sans phénol rouge pour augmenter le contraste visuel à l’interphase ; taux de dilution de 1:10. 5).
    2. Conserver la solution à 4 ° C pendant 2 semaines ou le congeler à-20 ° C.
  8. Préparer 10 mL de milieu de culture.
    1. Ajouter 200 µL de milieu de supplément à 9,6 mL de milieu de culture cellulaire neurone.
    2. Ajouter 200 µL de sérum de cheval inactivés par la chaleur (qui tend à différencier les œuvres contre la prolifération et les précurseurs des cellules gliales) à 25 µL de glutamine et 10 µL de 2-mercaptoéthanol.
    3. Filtrer les médias à travers un filtre de 0,22 µm.
    4. Ajouter les facteurs neurotrophiques suivants : facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) à une concentration finale de 10 ng/mL et le facteur neurotrophique dérivé cerveau (BDNF) et facteur neurotrophique dérivé de cellules gliales (GDNF) à la concentration finale de 1 ng/mL.
    5. Stocker les médias à 4 ° C.
  9. Préparer 50 mL de médias de dissection.
    1. Ajouter 2,25 mL de glucose (200 mg/mL) à 47,05 mL de HBSS. Ajouter 700 µL de 1 M HEPES avec pH 7,4. Stocker les médias à 4 ° C.
  10. Préparer une solution PFA de 4 %.
    1. Dissoudre 20 g de l’IFP dans 500 mL de PBS.
    2. Sous une hotte chimique, chauffer la solution à 60 ° C et ajouter quelques gouttes de 1 NaOH M jusqu'à ce que la solution devienne claire.
    3. Filtrer la solution sur un papier filtre et ajuster le pH à 7,2. Conserver à-20 ° C.
      Remarque : Vous pouvez également autres solutions commerciales de PFA peuvent être utilisées et diluées à 4 % dans du PBS.
  11. Nettoyer les outils de dissection, y compris les pinces et ciseaux plats silicone avec l’éthanol à 70 % avant utilisation et avec du savon et l’eau claire après utilisation.

2. poly-ornithine/laminine (Po/L) plat enduit

Remarque : Les Volumes sont adaptés à manteau une plaque 24 puits.

  1. Si nécessaire, mettez un lamelle couvre-objet stérile 12 mm dans le puits.
  2. Recouvrir les puits avec 500 µL de solution de 10 µg/mL Poly-L-Ornithine, dissous dans l’eau.
  3. Laissez les puits à régler à la température ambiante pendant 1 h.
  4. Enlever la solution de la Poly-L-Ornithine et sécher à l’air pendant 30 min.
  5. Enrober les puits pendant une nuit à 37 ° C, avec 500 µL de 3 µg/mL laminine dans bicarbonate de L-15.
    Remarque : Les puits peuvent être stockés à 37 ° C pendant 7 jours dans l’incubateur. Pour longue d’incubation, ajout de PBS stérile entre les puits peut aider à éviter l’évaporation moyenne.

3. dissection

  1. Sacrifier une souris enceinte lorsque les embryons sont au stade embryonnaire E12.5. Nettoyer le ventre avec l’éthanol à 70 %.
  2. Enlever l’utérus en coupant les deux oviductes et le vagin et le mettre dans un plat de pétri bac à froid (sans Ca2 + Mg2 +).
  3. Recueillir tous les embryons et de les transférer aux frais, froid PBS (sans Ca2 + Mg2 +) dans une boîte de pétri.
  4. Mettre un embryon dans un plat recouvert de silicone et plein de médias de dissection (avec HBSS, 4,5 g/L de glucose et de 7 mM HEPES pH 7,4).
    NOTE : Dissection de l’embryon est réalisée sous microscope à l’aide de ciseaux et pinces fines propre. Alternativement, une boîte de pétri régulière sans silicone peut être utilisé pour la dissection.
  5. Enlever la tête, queue et viscères, à l’aide de pinces comme des ciseaux.
  6. Maintenir l’embryon avec le ventre contre le silicone avec une pince.
  7. Avec une deuxième paire de pinces, insérez l’un des conseils dans le canal central de la moelle épinière rostrale.
  8. Fermer la pince pour déchirer le tissu dorsal de quelques millimètres.
  9. Répétez cette opération vers le côté caudal jusqu'à ce que l’ensemble de la moelle épinière est ouverte (Figure 1 b).
  10. Détacher la partie rostrale de la moelle épinière (tronc cérébral) du corps.
  11. Tourner l’embryon afin de maintenir la colonne vertébrale ouverte contre le silicone.
  12. Pincez la partie rostrale de la moelle épinière et tirez l’embryon de la tête pour en extraire la moelle épinière.
    NOTE : Méninges et les ganglions rachidiens (DRGs) doivent rester attachés à l’embryon. Sinon, tirez doucement loin tout restant méninges DRGs encore attachés à la moelle épinière. À cette étape, DRGs pourraient également être collectées pour la culture de neurones sensibles (voir Discussion).
  13. Aplatir la moelle épinière sur le silicone et enlever la moitié dorsale de la moelle en coupant la ligne médiane de chaque côté à l’aide d’un scalpel. Couper la partie centrale en 10 morceaux à l’aide d’un scalpel et transférer les morceaux dans un nouveau tube.

4. Suspension de cellules de la moelle épinière de

  1. Répétez cette procédure de dissection pour 6 à 8 moelles épinières.
  2. Laissez la moelle épinière pièces recueillent au fond du tube et remplacement le HBSS avec 1 mL de milieu Ham-F10.
  3. Ajouter 10 µL de la trypsine (2,5 % w/v ; concentration finale 0,025 %). Incuber le tube pendant 10 min à 37 ° C.
  4. Pour arrêter la digestion enzymatique, transférer les fragments dans un nouveau tube de 15 mL contenant 800 µL de milieu L-15 complet, 100 µL de 4 % (p/v) BSA et 100 µL de DNase (1 mg/mL dans le milieu de L-15).
  5. Triturer deux fois en aspirant 1 mL à l’aide d’une pipette P1000. Laissez les fragments se contenter de 2 min. à frais virés le surnageant dans un tube frais 15 mL.
  6. Pour les fragments, ajouter 900 µL de milieu L-15 complet, 100 µL de 4 % (p/v) BSA et 100 µL de DNase (1 mg/mL dans le milieu de L-15).
  7. Triturer 6 fois en aspirant 1 mL à l’aide d’une pipette P1000. Laissez les fragments se contenter de 2 min. ajouter le surnageant dans le tube de 15 mL obtenu à l’étape 4.5.
  8. Pour les fragments, ajouter 900 µL de milieu L-15 complet, 100 µL de 4 % (p/v) BSA et 100 µL de DNase (1 mg/mL dans le milieu de L-15).
  9. Broyer 10 fois en aspirant 1 mL à l’aide d’une pipette P1000. Laissez les fragments se contenter de 2 min. ajouter le surnageant dans le tube de 15 mL obtenu à l’étape 4.5. Aller de l’avant avec le surnageant.
  10. À l’aide d’une pipette P1000, Placez délicatement un coussin de 4 % (p/v) de BSA 2 mL au fond du tube surnageant. Centrifuger à 470 x g pendant 5 min.
  11. Retirez le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 2 mL de milieu de L-15 complet.

5. MN enrichissement de densité de Gradient

  1. Diviser la suspension cellulaire en deux tubes de 15 mL (1 mL chacune). Ensuite, ajouter 2 mL de milieu de L-15 complet. Si à partir de 6 embryons, utilisez l’équivalent de 3 embryons par tube dans 3 mL de milieu.
  2. Ajouter 2 mL de solution de gradient de densité en ajoutant lentement la solution au fond de chaque tube pour obtenir une interface nette.
  3. Centrifuger à 830 x g pendant 15 min à température ambiante. Après cette étape, les petites cellules devraient être au fond du tube, que grandes cellules tels que MNs convient à l’interface de solution/médium gradient de densité.
  4. Recueillir les cellules à l’interface par l’aspiration de 1 ou 2 mL et transférez-les sur un tube frais 15 mL. Réglez le volume à 10 mL avec le milieu à pH L-15.
  5. Ajouter 2 mL de la bulle du BSA 4 % le fond du tube et centrifuger à 470 x g pendant 5 min à température ambiante.
  6. Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans 3 mL de milieu de L-15 complet.
  7. Répétez l’étape 5.5.
  8. Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans 2 mL de milieu de culture complet. Compter le nombre de cellules et de la viabilité dans un microscope à contraste de phase avec un hémocytomètre.
    NOTE : Pour 6 moelles épinières, le nombre de cellule devrait être environ 1 x 105 MNs.

6. MN Culture

  1. Diluer la MNs à la densité appropriée, habituellement de 5 000 à 10 000 cellules dans 500 µL de milieu de culture par puits dans une plaque 24 puits.
    Remarque : La densité de semis sont autour de 30 000 et 1 500 cellules pour 6 et 96-plats, respectivement.
  2. Enlever la solution de la laminine avec un P1000.
  3. Transférer immédiatement la MNs diluée dans le milieu de culture dans les plaques de revêtement afin d’éviter le séchage.
  4. Incuber la culture pendant 2 jours à 37 ° C.

7. Magnétofection de MNs

Remarque : Dans les étapes suivantes, les quantités utilisées sont destinées pour la transfection d’un puits d’une plaque 24 puits. S’il vous plaît se référer au protocole du fabricant pour un autre format.

  1. Pour la préparation de l’ADN, resuspendre 1 µg d’ADN dans 50 µL de milieu de culture neuronale et vortexer pendant 5 s.
  2. Pour la préparation du tube de perle, resuspendre 1,5 µL de perles dans 50 µL de milieu de culture neuronale.
  3. Ajouter le 50 µL de solution de perle à la solution d’ADN de 50 µL et incuber pendant 20 min à température ambiante (volume total = 100 µL).
  4. Durant cette incubation, retirer le puits ne sera transfecter 100 µL de milieu de culture.
    Remarque : Mettre la plaque magnétique dans l’incubateur pour le réchauffer à 37 ° C.
  5. Transférer 100 µL du mélange ADN/perle dans le puits et incuber la plaque 20 – 30 min sur la plaque magnétique à 37 ° C.
  6. Attendre au moins 24h avant la détection de l’expression de cDNA.

8. fixation et coloration

  1. Laver la culture 2 fois avec du PBS.
  2. Incuber la culture pendant 20 min à température ambiante dans 4 % PFA/PBS.
  3. Laver la culture 2 fois avec du PBS.
  4. Incuber la culture en 500 µL de tampon de blocage (PBS, 4 % de BSA, sérum normal de 2 %, 0,3 % Triton X-100, glycine de 0,1 M) pendant 1 h à température ambiante.
    Remarque : Un sérum Normal doit être dérivé de la même espèce que l’anticorps secondaire (p. ex., sérum de chèvre Normal).
  5. Incubez la culture pendant la nuit à 4 ° C avec l’anticorps primaire dilué dans 250 µL de tampon de blocage.
    NOTE : par exemple, TUJ1 est utilisé à 1/1000, SMI32 est utilisé à 1/1000, et Lc3b est utilisé à 1/200.
  6. Laver la culture 3 fois avec du PBS.
  7. Incubez la culture avec l’anticorps secondaires conjugué à un fluorophore dilués dans 250 µL de tampon de blocage pendant 1 heure à température ambiante.
  8. Laver la culture 3 fois avec du PBS.
  9. Monter sur des lames de verre à l’aide du milieu de montage.

Résultats

Après 24 heures dans la culture, motoneurones (MNs) devraient déjà montrer la croissance axonale significative (au moins 6 fois plus longue que la taille de soma). Dans les jours suivants, axones devraient continuer à croître et afficher la ramification (Figure 2). Il y aura différentes morphologies en raison des spécificités de sous-type. Par exemple, colonne médiane MNs qui innervent les muscles axiaux ont des axones plus courtes et plus ramifiés ...

Discussion

Un des points critiques de ce protocole est que les embryons de souris sont disséqués à une fenêtre de temps précis au cours du développement (E12.5) afin d’optimiser la quantité de MNs obtenus à la fin. En outre, pour un rendement optimal, la dissection doit être effectuée le matin ou tôt dans l’après-midi. Avant E12.5 (par exemple, à E11.5), la dissection est difficile, surtout en ce qui concerne l’élimination des méninges. Après E12.5, le nombre de MNs obtenus diminue significativement. ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier le « Association pour le développement de la neurogénétique » du Dr Jacquier bourse et AFM-Telethon pour son aide au moyen de MyoNeurAlp plan stratégique. Nous tenons aussi à remercier Dr Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr Brigitte Pettmann, Dr Cedric Raoul et Dr. Georg Haase, qui a participé à l’élaboration et l’amélioration de la technique et de diffuser leurs connaissances.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
Silicone dissection dishLiving systems instrumentationDD-90-S-BLK-3PKSylgard
round coverslipNeuVitro, Knittel glassGG-12-Pre12 mm
Slide a Lyzer cassettesThermoFisher Scientific6603020,000 MWCO ; 30 mL
Filter unitMilliporeSCGVU02RE
GP Sterile Syringe FiltersMilliporeSLGP033RS
4 well plateThermoFisher Scientific167063Nunclon Delta treated plate
forcepsFST by Dumont11252-20#5 forceps
scissorFST by Dumont14060-10fine scissors
scalpelFST by Dumont10035-20curved blade
scalpelFST by Dumont10316-14micro-knife scalpel
Petri dishGreiner663102ø x h = 100 x 15 mm
15 mL polypropylene tubeFalcon352096
filter paperWatman1001125circle, 125 mm diameter
glass chamber slideLab-Tek1545264 chambers
Plasmid pCAGENAddgene#11160
NameCompanyCatalog NumberComments
Solutions and mediums
Bovine serum albuminSigma-AldrichA9418
L-15 mediumThermoFisher Scientific11415056
L-15 medium, no red phenolThermoFisher Scientific21083027
InsulinSigma-AldrichI6634
PutrescineSigma-AldrichP5780
ConalbuminSigma-AldrichC7786
Sodium seleniteSigma-AldrichS5261
ProgesteroneSigma-AldrichP8783
Poly-DL-OrnithineSigma-AldrichP8638
LamininSigma-AldrichL2020
trypsin 2.5%, 10xThermoFisher Scientific15090046
DNAseSigma-AldrichDN25
PBS w/o Ca MgThermoFisher Scientific14190144without Mg2+ Ca2+
sodium bicarbonateThermoFisher Scientific25080094
Neuron cell culture mediumThermoFisher ScientificA3582901Neurobasal Plus medium
HBSSSigma-AldrichH6648-500ML
HEPES buffer 1 MThermoFisher Scientific15630056
Density gradiant mediumSigma-AldrichD1556Optiprep
supplement mediumThermoFisher ScientificA3582801B-27 Plus
Horse serum heat inactivatedThermoFisher Scientific26050-088
L-Glutamine 200 mMThermoFisher Scientific25030024
2-mercaptoethanolThermoFisher Scientific31350010
penicilline/streptomycineThermoFisher Scientific1514012210,000 U/mL
NameCompanyCatalog NumberComments
Immuno fluorescence
PBS, 10xThermoFisher ScientificX0515without Mg2+ Ca2+
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich441244
normal goat serumSigma-AldrichG6767
glycineSigma-AldrichG7126
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Choline Acetyl Transferase (CHAT)ChemiconAb144P
Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)BiolegendsSMI-32PIF at 1/1000
Islet-1DSHB40.2D6
Islet-2DSHB39.4D5
Hb9DSHB81.5C10
Vectashield mounting mediumVector LabH-1000
Beta3 tubulin (Tuj1 clone)Biolegends801201IF at 1/1000
Lc3bCell Signaling Technology#2775IF at 1/200

Références

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