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요약

이 기법의 목표는 murine 척수에서 기본 motoneurons (MNs)의 매우 풍부한 문화를 준비. 설명만 질병을 일으키는 돌연변이의 결과 평가 하려면 여기 이러한 격리 절연 MNs 및 그들의 transfection magnetofection에 의해.

초록

척추 motoneurons (MNs)의 Neurodegeneration 등 루 경화 증, Charcot Marie이 질병, 척추 근육 위축, 근육 위축과 모두 관련 된 신경 성 질환의 큰 스펙트럼에 연루 이다. 척추 MNs의 기본 문화 같은 질병에 특정 한 유전자의 관련을 설명 하 고 그들의 변이의 세포 결과 특성화에 널리 사용 되어 왔습니다. 이 프로토콜 모델 기본 미네소타 문화 파생 헨 더 슨과 동료의 정액 일에서 20 년 이상 전에. 첫째, 우리는 마우스 배아에서 척수의 앞쪽 뿔을 해 부하 고 밀도 그라디언트를 사용 하 여 셀을 이웃에서 MNs를 분리 하는 방법 선발. 다음, 우리는 효율적으로 magnetofection를 사용 하 여 식 플라스 미드와 MNs를 transfecting의 새로운 방법을 제시. 마지막으로, 우리는 수정 하는 방법과 immunostain MNs. Charcot Marie이 질병 유형 2 원인 neurofilament 변이 사용 하 여,이 프로토콜 하 관심사의 단백질을 표현 하 고 있는 그들의 관련을 공부 질적 방법을 보여 주 설명 미네소타, 유지 보수, 성장과 생존입니다.

서문

신경 근육 학 질병 근육 및 신경 시스템의 변경에 의해 특징은 임상 및 유전으로 명료한 pathologies의 다양 한을 포함 됩니다. 시퀀싱 기술 발전, 때문에 유전자가 희귀 질환에 대 한 책임의 수백 지난 10 년 동안 확인 되었습니다 (Neuromuscular 질병 센터에서 사용할 수 있는 목록 http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). 확인 된 돌연변이의 다양 한 다른 고기 및 질병1,,23 다른 돌연변이 단일 유전자에서 발생할 수 있습니다 나타내고 다른 유전자에 돌연변이 비슷한 고기를 생산할 수 있는 4 , 5. 이러한 맥락에서 돌연변이 결과 및 병 적인 메커니즘을 분석 하기 위한 강력한 도구가 될 수 있는 휴대 전화 모델을 개발 하는 노력 있다.

척추 MNs는 척수의 복 부 뿔 형태 긴 축 삭 골격 근육 섬유를 타겟으로하 고 신경 근육 접합부에서 아 세 틸 콜린의 출시를 통해 자발적인 움직임에 대 한 허용에 있는 큰 somas는. MNs는 루 경화 증, Charcot Marie이 질병 (CMT), 신경 근육 학 질병에 의해 영향을 때문에 척추 근육 위축, 닥터 헨 더 슨과 동료 의 재배에 대 한 허용 된 첫 번째 프로토콜6 개발 생체 외에서 척추 MNs 및 科의 발견 요소 GDNF7 (glial 세포 파생 된 neurotrophic 요인). 그 이후 기술 상세 척추 MNs 및 FACS8를 사용 하 여 그들의 하위의 더 정확한 정화에 대 한 허용 하지만 밀도 그라데이션에 의해 농축 남아 기본 척추 MNs 작업은 현재 실험실에서 강력 하 고 널리 사용 되 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. 그 후, 그것은 또한 표면 마커 p75(NTR)15,,1617의 활용 하 여 immunopanning 통해 높은 미네소타 정화 등급을 얻을 수.

척수 포함 dorso 복 부 축에 전방 경적에서 그들의 위치 사이에서 다른 중간과 측면 모터 열으로 자 궁 경부, 흉부, 요 추 MNs의 다른 하위 및 표적 중 그들은 자극8, 18. 주 미네소타 문화 생리 적인 비율에 이러한 미네소타의 모든를 복구할 수 있습니다. 이 기술의 주요 한계는 프로시저;의 끝에 얻은 MNs의 낮은 수 사실, 그것은 현미경 검사 법 그러나 생화학 실험에 대 한 제한에 대 한 적당 한 6 개의 배아에서 약 105 MNs를 얻을 것으로 예상 수 있습니다. 더 표준화 된 하위와 풍부한 MNs 실험을 수행 하기 위해 (> 106 셀), 배아 줄기 세포 유래 MNs18고려 되어야 한다.

기본 MNs로 야생-타입/돌연변이 transgenes 또는 최저의 내 생 유전자의 transfection는 특히 마우스 모델 사용할 수 없을 때 physiopathological 경로 해독에 대 한 신속 하 고 유용한 도구입니다. Magnetofection은 transfecting 기본 신경, 관련된 neurotoxicity 없이 lipofection와 비슷한 하나의 기술입니다. 또한, 몇 일 후 체 외에서electroporation9에 따라 기술 달리 성숙한 뉴런에 transfection은 수행할 수 있습니다. 그러나, 한이 기술의 단점은 구슬 DAPI 라벨에 잡음을 일으키는 문화에서 핵 산 바인딩입니다. 바이러스 감염 가능성이 transfecting MNs;에 대 한 가장 효율적인 기술 이다 그러나, magnetofection는 바이러스 생산 및 세포 감염에 필요한 특정 안전 절차를 필요 하지 않습니다.

프로토콜

동물 관련 된 모든 절차는 기관의 윤리 위원회에 의해 허용 했다.

1. 솔루션 준비

  1. 4% BSA L-15 매체에 dialyzed의 10 mL를 준비 합니다.
    1. L-15 매체의 10 mL에 4% (w/v)에 소 혈 청 알 부 민 분말을 용 해.
    2. 20 mL 투 카세트 20 kDa 커트 오프로에 솔루션을 추가 합니다. 4 ° c.에 동요에서 3 일 동안 L-15 매체의 500 mL에 대 한 dialyze L-15 매체 매일 변경 합니다.
    3. 0.22 μ m 막 및 15 mL 튜브에 약 수를 통해 해결책을 필터링 합니다. -20 ° c.에 튜브를 저장
      참고:이 프로토콜 사용 하 여 다음 참조: 수정 되지 않은 원시 L-15 매체 L-15 매체, 산 성 L-15 매체 = = pH L-15, 및 기본적인 L-15 매체 중 탄산염 L-15 =.
  2. PH L-15 200ml를 준비 합니다.
    1. L-15 매체의 pH 조정: 첫째, 드라이 아이스의 일부 조각을 세척 병 채우기. 색상 오렌지 변할 때까지 L-15 매체에 가스 (CO2)를 주입 (~ pH 6.4 고 ~ 40 압력). PH는 또한 표준 pH 측정기와 함께 조정할 수 있습니다.
    2. 한 달 동안 0.22 μ m 막 및 4 ° C에서 저장소를 통해 매체를 필터링 합니다.
  3. 100 mL 중 탄산염 L-15의 준비.
    1. L-15 매체의 97.5 mL를 7% 나트륨 중 탄산염의 2.5 mL을 추가 하 고 4 ° c.에 저장
  4. IPCS (인슐린 Putrescin Conalbumin Selenite) 보충제를 준비 합니다.
    1. 0.1 M HCl. 추가 이중 증 류 물 4.5 mL의 0.5 mL에 인슐린의 2.5 mg을 디졸브.
    2. 8mg putrescine 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 5 mL에 용 해.
    3. 10 ml PBS의 conalbumin의 100 밀리 그램을 디졸브.
    4. 분해 물 19.3 ml에서 나트륨 selenite의 1 밀리 그램, pH 7.4를 조정 하 고 솔루션을 10 배 희석.
    5. 인슐린 솔루션의 1 mL, putrescine 솔루션의 1 mL, conalbumin의 1 mL 및 IPCS 보충 솔루션의 3.1 mL를 나트륨 selenite 솔루션의 0.1 mL을 결합 합니다. -20 ° c.에 솔루션 저장
  5. 0.02 m m 프로 솔루션을 준비 합니다.
    1. 80% 에탄올의 1.6 ml에서 황 체 호르몬의 1 마그네슘을 디졸브.
    2. 솔루션 100에 100% 에탄올을 희석 하 고-20 ° c.에 그것을 저장합니다
  6. 완전 한 L-15 매체의 100 mL를 준비 합니다.
    1. PH 3.5 mg/mL의 최종 농도 포도 당을 얻기 위해 L-15 92 mL를 D-포도 당 솔루션 (200 mg/mL)의 1.8 mL를 추가 합니다.
    2. 100의 1 mL을 결합 하 여 페니실린 스 x (10000 U/mL), 열 비활성화 말 혈 청의 2 mL, IPCS 믹스의 3.1 mL 및 progesterone 솔루션 (2 x 10-5 M)의 0.1 mL.
    3. 0.22 μ m의 막에 매체를 필터링 및 4 ° c.에 그것을 저장합니다
  7. 실험 당 밀도 그라데이션 솔루션 (최종 농도의 5.5%)의 5 mL을 준비 합니다.
    1. 4524 µ L L-15의 상업 60% 밀도 그라데이션 매체의 476 µ L 추가 (interphase;에서 시각적 대비를 증가 붉은 페 놀 없이 가능 하다 면, 1:10. 5의 희석 비율).
    2. 2 주 동안 4 ° C에서 솔루션을 저장 또는-20 ° c.에 그것을 동결합니다
  8. 문화 미디어의 10 mL를 준비 합니다.
    1. 신경 세포 배양 매체의 9.6 mL를 보충 매체의 200 µ L를 추가 합니다.
    2. 글루타민의 25 µ L을 10 µ L 2-mercaptoethanol의 열 활동 되지 않 ㄴ 말 혈 청 (는 glial 세포 선구자 및 확산에 대 한 작품을 차별화 하는 경향이)의 200 µ L를 추가 합니다.
    3. 0.22 μ m 필터를 통해 미디어를 필터링 합니다.
    4. 다음 neurotrophic 요인 추가: 10 ng/mL의 최종 농도에 속눈썹 neurotrophic 요인 (CNTF) 및 두뇌 파생 된 neurotrophic 요인 (BDNF) 및 glial 세포 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF) 1 ng/mL의 최종 농도에.
    5. 4 ° c.에 미디어를 저장
  9. 해 부 미디어의 50 mL를 준비 합니다.
    1. HBSS의 47.05 mL를 포도 (200 mg/mL)의 2.25 mL를 추가 합니다. Ph 7.4의 1 M HEPES 700 µ L를 추가 합니다. 4 ° c.에 미디어를 저장
  10. 4 %PFA 솔루션을 준비 합니다.
    1. 500 ml PBS의 PFA의 20 g을 분해.
    2. 화학 후드에서 60 ° C에 솔루션을 열 하 고 솔루션 취소 될 때까지 1 M NaOH의 몇 방울을 추가 합니다.
    3. 필터 종이 통해 해결책을 필터링 하 고 pH 7.2 조정 합니다. -20 ° c.에 그것을 저장합니다
      참고: 또는, 다른 상용 PFA 솔루션 사용 고 PBS에서 4%로 희석.
  11. 집게가 위, 및 실리콘 요리 비누 사용 하기 전에, 70% 에탄올과 해 부 도구를 청소 하 고 사용 후 맑은 물.

2. 폴 리-ornithine/Laminin (포/L) 코팅 접시

참고: 볼륨 코트 24-잘 접시에 적응은.

  1. 필요한 경우, 살 균 12 mm coverslip 잘 넣어.
  2. 물에 녹아 10 µ g/mL 폴 리-L-Ornithine 솔루션의 500 µ L로 웰 스 코트.
  3. 실 온에서 1 h 정착 우물을 하자.
  4. 폴 리-L-Ornithine 솔루션을 제거 하 고 30 분 동안 건조.
  5. 탄산염 L-15에서에서 3 µ g/mL laminin의 500 µ L 37 ° C에서 하룻밤 웰 스 코트.
    참고: 웰 스 저장할 수 있습니다 37 ° C에 인큐베이터에서 7 일 동안. 긴 외피, 우물 사이 살 균 PBS 추가 중간 증발을 피하기 위해 도울 수 있다.

3입니다. 해 부

  1. E12.5 배아 단계에서 배아는 임신 마우스를 희생. 70% 에탄올과 배꼽 청소.
  2. 두 oviducts와 질을 절단 하 여 자 궁을 제거 하 고 차가운 PBS (없이 캘리포니아2 + Mg2 +)으로 가득 페 트리 접시에 넣어.
  3. 모든 배아를 수집 하 고 신선한에 그들을 전송 차가운 PBS (없이 캘리포니아2 + Mg2 +) 페 트리 접시에서.
  4. 실리콘 코팅 및 (HBSS와 포도 당 4.5 g/L, 7 mM HEPES pH 7.4) 해 부 미디어의 전체 접시에 하나의 배아를 넣어.
    참고: 배아 해 부 현미경으로 깨끗 한 고 운 집게와가 위를 사용 하 여 수행 됩니다. 또는 실리콘 없이 일반 배양 접시 해 부에 대 한 사용할 수 있습니다.
  5. 머리, 꼬리, 내장가 위 집게를 사용 하 여 제거 합니다.
  6. 집게와 실리콘에 대 한 배와 배아를 유지 합니다.
  7. 집게의 두 번째 쌍 rostral 척수의 중앙 채널에 삽입 팁 중 하나.
  8. 눈물 등 조직 몇 밀리미터에 집게를 닫습니다.
  9. 전체 척수 오픈 될 때까지 꼬리 쪽으로이 작업을 반복 (그림 1B).
  10. 시체에서 척수 (대뇌 간선)의 rostral 부분을 분리 합니다.
  11. 실리콘에 대 한 오픈 척수를 유지 하기 위해 배아를 설정 합니다.
  12. 척수의 rostral 부분을 꼬 집 고 머리 척수를 추출 하 여 태아를 당겨.
    참고: Meninges과 지 루트 신경 절 (Drg) 태아에 부착 되어 있어야 합니다. 그렇지 않으면, 조심 스럽게 빼냅니다 멀리 어떤 나머지 meninges과 Drg 여전히 척수에 연결 된. 이 단계에서 Drg 수 또한 민감한 신경 문화에 대 한 수집 될 (내용 참조).
  13. 실리콘에 척수를 평평 하 고 메스를 사용 하 여 각 면의 중앙을 따라 절단 하 여 코드의 등 절반을 제거 합니다. 메스를 사용 하 여 10 조각으로 중간 부분을 잘라내어 새로운 튜브 조각을 전송.

4. 척수 세포 현 탁 액

  1. 6 ~ 8 척수에 대 한이 해 부 절차를 반복 합니다.
  2. 하자 척수 조각 튜브의 하단에 수집 하 고 햄 F10 매체의 1 mL에는 HBSS 바꿉니다.
  3. 트립 신 (2.5 %w / v, 최종 농도 0.025%)의 10 µ L를 추가 합니다. 37 ° c.에서 10 분 동안 튜브를 품 어
  4. 효소 소화를 중지, 완전 한 L-15 매체, 4% (w/v) BSA 100 µ L DNase (L-15 중간에 1 mg/mL)의 100 µ L의 800 µ L을 포함 하는 새로운 15 mL 튜브에 파편을 전송.
  5. 두번 P1000 피 펫을 사용 하 여 1 mL 발음 하 여 triturate. 조각 2 분 수집 신선한 15 mL 튜브에 상쾌한 정착 하자.
  6. 조각을, 완전 한 L-15 매체의 900 µ L, 4% (w/v) BSA 100 µ L 및 DNase (L-15 중간에 1 mg/mL)의 100 µ L를 추가 합니다.
  7. 1 mL P1000 피 펫을 사용 하 여 발음 하 여 6 번 triturate. 조각 2 분 추가 15 mL 튜브에 상쾌한 단계 4.5에서에서 얻은 정착 하자.
  8. 조각을, 완전 한 L-15 매체의 900 µ L, 4% (w/v) BSA 100 µ L 및 DNase (L-15 중간에 1 mg/mL)의 100 µ L를 추가 합니다.
  9. 1 mL P1000 피 펫을 사용 하 여 발음 하 여 10 배 triturate. 조각 2 분 추가 15 mL 튜브에 상쾌한 단계 4.5에서에서 얻은 정착 하자. 상쾌한 진행.
  10. 부드럽게 장소 P1000 피펫으로 사용 하 여, 표면에 뜨는 튜브의 아래쪽 2 mL BSA 4% (w/v) 쿠션. 5 분 동안 470 x g에서 원심.
  11. 상쾌한을 제거 하 고 완전 한 L-15 매체의 2 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend.

5. 미네소타 농축 그라데이션 밀도

  1. 두 개의 15 mL 튜브 (각 1 mL)으로 세포 현 탁 액을 분할. 그런 다음 완전 한 L-15 매체의 2 개 mL를 추가 합니다. 6 배아에서 시작 해 서, 매체의 3 mL에 튜브 당 3 배아의 동등한을 사용 합니다.
  2. 천천히 날카로운 인터페이스를 각 튜브의 하단에 솔루션을 추가 하 여 밀도 그라데이션 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다.
  3. 실 온에서 15 분 동안 830 x g에서 원심. 이 단계 후 작은 셀 MNs 같은 큰 세포 밀도 그라데이션 솔루션/매체 인터페이스에 있어야 하는 반면 튜브의 하단에 있어야 합니다.
  4. 인터페이스에서 세포를 수집으로 1 또는 2 mL를 발음 하 고 신선한 15 mL 튜브에 그들을 전송. L-15 pH 매체와 10 mL을 볼륨을 조정 합니다.
  5. 튜브 및 실 온에서 5 분 동안 470 x g에서 원심 분리기의 바닥에 4 %BSA 쿠션의 2 개 mL를 추가 합니다.
  6. 상쾌한을 제거 하 고 완전 한 L-15 매체의 3 mL에 펠 릿을 resuspend.
  7. 5.5 단계를 반복 합니다.
  8. 상쾌한을 제거 하 고 완전 한 문화 매체의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 휴대폰 번호와 생존 한 hemocytometer와 위상 대비 현미경을 계산 합니다.
    참고: 6 척수에 대 한 셀 수 약 1 × 105 MNs 예상입니다.

6. 미네소타 문화

  1. 보통 5000 ~ 10000 셀 24-잘 접시에 잘 당 문화 매체의 500 µ L에 적절 한 밀도를 MNs 희석.
    참고: 각각 6-96 잘 접시, 30000 및 1500 셀 주위는 밀도 시드입니다.
  2. 한 P1000 laminin 솔루션을 제거 합니다.
  3. 즉시에 건조 하지 않도록 코팅 판으로 문화 매체에 희석 MNs 전송.
  4. 37 ° c.에 2 일 동안 문화를 품 어

7입니다. MNs의 Magnetofection

참고: 다음 단계에 사용 하는 수량 24-잘 접시의 한 우물의 transfection에 대 한 의미가 있다. 다른 형식에 대 한 제조 업체의 프로토콜을 참조 하십시오.

  1. DNA 준비를 위해 resuspend 1 µ g의 DNA 신경 문화 매체와 5 소용돌이의 50 µ L에서 s.
  2. 비드 튜브 준비, 대 한 신경 문화 매체의 50 µ L에서 구슬의 1.5 µ L을 resuspend.
  3. 50 µ L DNA 솔루션을 50 µ L 비드 솔루션을 추가 하 고 실 온에서 20 분 동안 품 어 (전체 용량 = 100 µ L).
  4. 이 부 화 하는 동안 페는 우물에서 문화 매체의 100 µ L를 철회.
    참고: 그것을 따뜻하게 37 ° c 배양 기에서 자기 접시를 넣어
  5. 잘, DNA/구슬 믹스 100 µ L를 전송 하 고 접시를 품 어 37 ° c.에 자기 접시에 20-30 분
  6. CDNA 식의 감지 하기 전에 적어도 24 시간을 기다립니다.

8. 고정 및 얼룩

  1. PBS로 2 회 문화를 씻어.
  2. 4%에서 실 온에서 20 분에 대 한 문화를 품 어 PFA/PBS.
  3. PBS로 2 회 문화를 씻어.
  4. 실 온에서 1 h 블로킹 버퍼 (PBS, BSA는 4%, 2% 정상 혈 청, 0.3% 트라이 톤 X-100, 0.1 m M 글리신)의 500 µ L에서 문화를 품 어.
    참고: 일반 혈 청 (예: 정상 염소 혈 청) 2 차 항 체로 동일한 종에서 파생 되어야 한다.
  5. 블로킹 버퍼의 250 µ L에 희석 하는 주 항 체와 4 ° C에서 하룻밤 문화를 품 어.
    참고: 예를 들어, TUJ1은 1/1000에 사용 SMI32 1/1000, 사용 되 고 Lc3b는 1/200에서 사용 됩니다.
  6. 3 회 PBS 가진 문화를 씻어.
  7. Fluorophore 활용 된 이차 항 체 실 온에서 1 시간 동안 블로킹 버퍼의 250 µ L에 희석 된 문화를 품 어.
  8. 3 회 PBS 가진 문화를 씻어.
  9. 설치 매체를 사용 하 여 유리 슬라이드에 탑재 합니다.

결과

24 시간 후 문화에서, motoneurons (MNs) 이미 상당한 axonal 성장 (적어도 6 시간 이상 소마 크기)을 표시 합니다. 다음 일에 축 삭 성장 분기 (그림 2)를 표시 하 고 계속 해야 합니다. 하위 특이성으로 인해 다른 형태학을 있을 것입니다. 예를 들어 중간 열 MNs 축 근육을 자극 하는 자극 다리 근육18측면 모터 열 MNs 보다 짧고 더 분기 축 삭을 ?...

토론

이 프로토콜에서 중요 한 포인트 중 하나는 마우스 배아는 개발 (E12.5) 끝에 얻은 MNs의 양을 최적화 하는 동안 정확한 시간대에 해 부입니다. 또한, 최적의 생산량에 대 한 해 부 수행 되어야 한다 아침 이나 이른 오후에. E12.5 (예를 들어, E11.5에서), 전에 해 부가 어렵습니다, 특히 meninges의 제거에 관한. E12.5, 후 얻은 MNs의 수는 크게 떨어진다. 개발의 배아 단계 제어, 성인 여성 및 남성 처음 배...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

우리는 "협회 부 르 지속 가능성 드 라 neurogénétique" 박사 Jacquier의 친목 및 AFM-텔 레 톤 MyoNeurAlp 전략적 계획을 통해 그것의 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 박사 크리스 헨 더 슨, 박사 윌리엄 Camu, 박사 Brigitte Pettmann, 박사 세 드 릭 라울, 누가 개발 하 고 기술 향상에 참가 하 고 그들의 지식을 전파 하는 박사 게오르그 세 감사 하 고 싶습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
Silicone dissection dishLiving systems instrumentationDD-90-S-BLK-3PKSylgard
round coverslipNeuVitro, Knittel glassGG-12-Pre12 mm
Slide a Lyzer cassettesThermoFisher Scientific6603020,000 MWCO ; 30 mL
Filter unitMilliporeSCGVU02RE
GP Sterile Syringe FiltersMilliporeSLGP033RS
4 well plateThermoFisher Scientific167063Nunclon Delta treated plate
forcepsFST by Dumont11252-20#5 forceps
scissorFST by Dumont14060-10fine scissors
scalpelFST by Dumont10035-20curved blade
scalpelFST by Dumont10316-14micro-knife scalpel
Petri dishGreiner663102ø x h = 100 x 15 mm
15 mL polypropylene tubeFalcon352096
filter paperWatman1001125circle, 125 mm diameter
glass chamber slideLab-Tek1545264 chambers
Plasmid pCAGENAddgene#11160
NameCompanyCatalog NumberComments
Solutions and mediums
Bovine serum albuminSigma-AldrichA9418
L-15 mediumThermoFisher Scientific11415056
L-15 medium, no red phenolThermoFisher Scientific21083027
InsulinSigma-AldrichI6634
PutrescineSigma-AldrichP5780
ConalbuminSigma-AldrichC7786
Sodium seleniteSigma-AldrichS5261
ProgesteroneSigma-AldrichP8783
Poly-DL-OrnithineSigma-AldrichP8638
LamininSigma-AldrichL2020
trypsin 2.5%, 10xThermoFisher Scientific15090046
DNAseSigma-AldrichDN25
PBS w/o Ca MgThermoFisher Scientific14190144without Mg2+ Ca2+
sodium bicarbonateThermoFisher Scientific25080094
Neuron cell culture mediumThermoFisher ScientificA3582901Neurobasal Plus medium
HBSSSigma-AldrichH6648-500ML
HEPES buffer 1 MThermoFisher Scientific15630056
Density gradiant mediumSigma-AldrichD1556Optiprep
supplement mediumThermoFisher ScientificA3582801B-27 Plus
Horse serum heat inactivatedThermoFisher Scientific26050-088
L-Glutamine 200 mMThermoFisher Scientific25030024
2-mercaptoethanolThermoFisher Scientific31350010
penicilline/streptomycineThermoFisher Scientific1514012210,000 U/mL
NameCompanyCatalog NumberComments
Immuno fluorescence
PBS, 10xThermoFisher ScientificX0515without Mg2+ Ca2+
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich441244
normal goat serumSigma-AldrichG6767
glycineSigma-AldrichG7126
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Choline Acetyl Transferase (CHAT)ChemiconAb144P
Neurofilament H non phosphorylated (SMI32)BiolegendsSMI-32PIF at 1/1000
Islet-1DSHB40.2D6
Islet-2DSHB39.4D5
Hb9DSHB81.5C10
Vectashield mounting mediumVector LabH-1000
Beta3 tubulin (Tuj1 clone)Biolegends801201IF at 1/1000
Lc3bCell Signaling Technology#2775IF at 1/200

참고문헌

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