Inverser la Dissection et données DiceCT Reveal autrement cachés dans l’évolution du visage de primates

Résumé

Les expressions faciales sont un mode de communication visuelle produite par les muscles mimétiques. Nous présentons ici les protocoles pour les nouvelles techniques de dissection inverse et DiceCT entièrement visualiser et évaluer les muscles mimétiques. Ces techniques combinées peuvent examiner les aspects morphologiques et physiologiques des muscles mimétiques afin de déterminer les aspects fonctionnels.

Résumé

Expressions faciales ou écrans faciaux, d’intention sociale ou émotionnelle sont produites par plusieurs taxons de mammifères comme un moyen de communiquer visuellement avec des congénères à une courte distance. Ces écrans sont atteints par la contraction des muscles mimétiques, qui sont des muscles squelettiques attachés dans le derme du visage. Inverser la dissection, retirer le masque facial complet du crâne et s’approcher des muscles mimétiques en sens inverse, est un efficace mais une manière destructive de révéler la morphologie des muscles mimétiques, mais il est destructeur. DiceCT est un nouveau mécanisme pour visualiser les muscles squelettiques, y compris les muscles mimétiques et isoler les faisceaux musculaires individuelles pour la mesure quantitative. En outre, DiceCT fournit un mécanisme non destructif pour la visualisation des muscles. Les combinaison des techniques de dissection inverse et DiceCT peuvent servir à évaluer la morphologie évolutive de musculature mimétique ainsi que potentiels de force de contraction et de vélocité de ces muscles. Cette étude montre que DiceCT peut être utilisé avec précision et fiabilité visualiser muscles mimétiques ainsi inverser la dissection et fournir une méthode non destructive pour l’échantillonnage des muscles mimétiques.

Introduction

La musculature mimétique ou musculature de l’expression du visage, est le muscle squelettique et peut être trouvée dans Mammalia¹. Alors que le muscle squelettique de mammifère plus attache aux repères osseux discrètes, musculature mimétique est unique dans ses attachements principalement dans la peau du visage, cuir chevelu et l’aspect ventrale du cou^{1,2,3, 4}. Contraction de la musculature mimétique déforme le « masque » dans des expressions ou éjaculation faciale affiche d’intention sociale et affective, modifie la taille et la forme des sphincters de le œil, cavité nasale et cavité buccale utilisé dans l’alimentation, la respiration et dans les cris, et fait partie du mécanisme de communication visuelle globale d’accostage trouvé parmi les la plupart mammifères^2,3,4,5. Dans l’ensemble de Mammalia, les écrans faciaux générées par les muscles mimétiques aident dans la régulation et le maintien des frontières territoriales, liens sociaux et le groupe social en début de leurs congénères sur les intentions émotionnelles et comportementales de l’expéditeur^{2, 5}.

Chez les mammifères, les primates sont caractérisés en partie en employant un niveau élevé de comportement social tout au long du cycle de vie avec toutes les espèces vivant dans un groupe social^2,5. Tandis que certains taxons, tels que les galagos nocturnes et Loris, puissent vivre en groupes constitués uniquement d’une mère et de progéniture, d’autres taxons, comme les macaques diurnes et les babouins, peut-être vivre en groupes de plus de 100 personnes,⁶. Peu importe la taille du groupe social, primates utilisent souvent des comportements sociaux stéréotypés associés à grade et territorialité et ces comportements comprennent généralement un composant d’affichage du visage. Affiche du visage font partie du processus du maintien des liens entre les membres des groupes sociaux, les hiérarchies de dominance, la reproduction et la communication qui fait partie de la vie quotidienne, en particulier dans les espèces diurnes^2,5,7 . Alors qu’il était clair depuis longtemps que la musculature faciale est utilisée pour créer ces écrans faciaux, il est récemment apparu que physiologie et forme la musculature faciale sont associés aux exigences fonctionnelles des variables sociales^{2, 8}. Des études antérieures sur les gammes diverses phylogénétiquement et comportemental des primates ont montré qu’espèce diurne vivant dans les grandes, groupes sociaux complexes ont tendance à avoir un grand nombre d’écrans faciaux discrets qui mettent l’accent sur le mouvement des lèvres, sourcils et paupières avec un grand nombre de muscles faciaux regroupés autour des lèvres et de la région orbitale⁹. En revanche, il y a eu peu d’études sur des espèces nocturnes, vivant en petits groupes, mais ces espèces ont un grand nombre de muscles faciaux discrètes avec pièces jointes autour de l’oreille externe et les lèvres, qui peuvent être associés aux mouvements de l’oreille et les lèvres (qui ont été documentés chez certaines espèces nocturnes agonistiques rencontres avec des congénères et la localisation des sons)^2,9,10,11. En outre, les humains ont un pourcentage relativement plus élevé de fibres lentes de la myosine dans la musculature mimétique que le macaque rhésus ou les chimpanzés, qui pourraient être liés à la « ralentir » la contraction de la musculature mimétique humaine autour des lèvres utilisé au cours de la production de phonèmes ou de capacités générales-résistance à la fatigue des muscles⁸.

Les humains sont, sans doute, le plus social de tous les primates et ont développé le langage comme une des composantes de la communication sociale. Encore, cependant, les humains utilisent l’expression faciale comme moyen de communication visuelle et j’ont le plus grand répertoire affichage du visage connu chez les primates. Pour tenter de comprendre plus complètement les variables entourant l’évolution des primates humains et générale des comportements sociaux, une meilleure compréhension de la morphologie et la physiologie de primate musculature mimétique sont hautement souhaitables. Parce que la musculature mimétique est attachée à la peau elle-même et peut, chez certaines espèces, être exceptionnellement fine et difficile à visualiser, nous avons développé une méthode unique de visualiser cette musculature pour les processus d’enregistrement brut de présence/absence et pièces jointes ainsi que l’échantillonnage pour la transformation microanatomical.

« Dissection inverse » est une méthode pour préserver la musculature mimétique en enlevant le masque du visage entier de la tête et en augmentant la visibilité des petits muscles. Dissection inverse étant un processus destructeur, des spécimens rares et précieux ne sont pas forcément disponibles pour cette méthode. DiceCT est une méthode efficace qui permet de visualiser plusieurs des muscles mimétiques de même espèce^12,13,14. Cette méthode peut être utilisée de concert avec dissection inverse ou dans les cas où des spécimens rares, précieux ne peuvent pas être disséqués et peuvent fournir beaucoup d’informations sans avoir à retirer le masque facial en « dissection inverse »^{12,13, 14}. Le présent protocole décrit un ensemble de méthodes permettant de combiner une dissection inverse et DiceCT afin d’examiner la musculature mimétique de primate.

Protocole

Parce que ces procédures utilisent des animaux qui sont morts de causes naturelles à des zoos ou ont été sacrifiés dans les laboratoires de recherche où ils faisaient partie des études indépendantes, ces protocoles ne nécessitent pas d’approbations IACUC.

1. inversez la Dissection

Remarque : Le protocole de dissection inverse est efficace pour les très petits mammifères, tels que des souris de laboratoire, tout le chemin à gros mammifères, tels que le cheval domestique. Les muscles mimétiques sont souvent les mieux conservés et mieux visualisés lorsque laissé avec le derme sus-jacent au lieu de les laisser sur le crâne. Voir la Figure 1-3.

1. Équipe responsable de la partie cervicale de la colonne vertébrale avant des procédures de dissection. Si le cadavre est gelé, laissez-le décongeler complètement avant de passer par cette étape.
   1. Quel que soit l’état de conservation, palper la région occipitale du crâne et l’apophyse épineuse de la deuxième vertèbre cervicale (C2). Notez que la première vertèbre cervicale (C1) ne dispose pas d’une apophyse épineuse, palpant donc C2 et la région occipitale du crâne donnera une localisation approximative de C1.
   2. À l’aide d’un scalpel, coupes horizontales entre la région occipitale du crâne et C2 afin de commencer à séparer le crâne de la colonne vertébrale à la C1. Continuer à faire des coupes jusqu'à ce que le crâne est désarticulée de la colonne vertébrale.
   3. Si le spécimen est fraîche et non fixées, 1.1.2-1.2 étapes doivent être exécutés dans un laps de temps relativement court. En outre, si le cerveau reste intact à l’intérieur de la cavité crânienne, nécrose du tissu neural peut procéder rapidement, donc il est fortement recommandé que le cerveau soit rayée du cadavre si l’échantillon doit rester non fixées.
      Remarque : Comme une étape facultative, l’échantillon peut être immergé dans du formol 10 % mis en mémoire tamponné pendant 24 heures afin de corriger le spécimen. Ceci permettra une procédure de collecte de données sans hâte.
   4. Si le spécimen est déjà fixé avec de l’alcool éthylique ou tampon de 10 % de formol, rincer pendant plusieurs heures avec de l’eau fraîche.
2. Faire des incisions pour libérer le masque facial de crâne. Si le cerveau et recouvrant la calotte cranienne ont été enlevés au cours de l’autopsie, faire une incision près de la région glabellaire du crâne et un autre le long de la face caudale du crâne où l’os crânien est intact.
   1. Une fois que le spécimen a été rincé pendant plusieurs heures, éponger avec des essuie-tout et transfert au travail station.
   2. Palper à la protubérance occipitale externe au bord caudal (ou arrière) du crâne. Il s’agit de la zone où le crâne rejoint la colonne vertébrale. En utilisant un scalpel #4 pour les gros spécimens ou un scalpel #3 pour les petits spécimens, pratiquer une incision de la ligne médiane commençant à la protubérance occipitale externe et rostralement (ou avant) à venir sur la région pariétale et frontale du crâne, au-dessus de la région orbitale et entre les yeux, vers le bas de la région nasale, tout au long de la zone nasale externe entre les narines.
   3. Faire une incision sur la mandibule entre les incisives inférieures, centrales et déplacer la direction caudale (ou l’arrière) vers la clavicule.
   4. Choisir un côté du masque pour retirer et laisser l’autre côté en place.
3. Libérer un côté du masque facial sur le crâne.
   1. À partir de la région occipitale, utiliser le scalpel pour découper le masque du visage, y compris la musculature mimétique, loin de l’OS occipital du crâne, tirant sur le masque rostralement (ou avant) et latéralement (à côté). Couper le muscle occipital loin du crâne, laissant une petite quantité du muscle derrière sur le crâne, ainsi que son attachement toujours peut être visualisée qu’une fois le masque facial a été supprimé. En laissant une partie du muscle derrière sur le crâne osseux/cartilagineux, pièces jointes peuvent être conservées pendant un enregistrement à une date ultérieure.
   2. Dès que l’oreille externe est frappée, localisez les muscles auriculaires. Couper à travers ces afin qu’une petite partie de chaque demeure avec le crâne. Couper à travers le cartilage élastique, y attacher l’oreille externe du crâne.
   3. Continuer à tirer le masque rostralement et libérer chaque muscle mimétique du crâne en laissant une petite partie de chaque muscle derrière sur le crâne.
   4. Dès qu’il y a un masque facial intact d’un côté du crâne, lui permettent de s’asseoir, exposées à l’air, pendant une heure (pour les petits spécimens comme un rat de laboratoire) pouvant atteindre trois heures (pour un grand spécimen comme un cheval domestique), avec le côté de la musculature vers le haut. Cette étape de dessiccation partie du tissu conjonctif sur le masque facial et augmente le contraste de couleur entre le muscle et le tissu conjonctif.
4. Enlever du tissu conjonctif suffisant pour visualiser la musculature.
   1. À l’aide de 3 # bistouri, pince et microciseaux, plumer loin du tissu conjonctif qui sépare la musculature mimétique de l’autre.
   2. Pour accéder à la couche superficielle de la musculature mimétique dans cette « dissection inverse », soulever délicatement et séparer la couche profonde de la musculature de la couche superficielle et retirer le tissu conjonctif entourant la musculature superficielle. Le masque facial qui en résulte peut être retourné au formol, et la procédure peut être suspendue ici avant de passer à autre dissection ou aux taches (étape 2). À chaque étape intermédiaire dans la dissection plus loin, laissez le masque facial sécher suffisamment pour que le tissu conjonctif peut facilement discerner de tissu musculaire.

2. processus de coloration pour DiceCT

NOTE : Spécimens doivent être fixés dans du formol 10 % mis en mémoire tamponné si DiceCT doit être utilisé afin de préserver le tissu pendant la longue procédure de coloration. Si l’échantillon n’a pas encore été fixée, placez-le dans un contenant assez formol 10 % tamponnée à submerger tous les tissus et laissez-le pendant 48 heures.

1. Faire 1,75 % (m/v) d’iode Lugol (j’ai₂KI) pour colorer le masque facial.
   Remarque : Assez j’ai fait₂KI solution pour immerger entièrement le masque dans le conteneur choisi. Rendre plus ou moins la solution de mise à l’échelle des valeurs des solutés et le solvant également aux étapes 2.1.1 et 2.1.2.
   1. Sous une hotte aspirante, ajoute 200 mL d’eau distillée dans un bécher de grand verre 3,50 g d’iodure de potassium (KI). Remuer à l’aide de verre tige jusqu'à ce qu’entièrement dissous d’agitation.
      Attention : iodure de Potassium (KI) peut causer des yeux, peau, irritation des voies respiratoires et/ou dommages. Porter des lunettes de protection et manipuler sous une hotte aspirante.
   2. Ajouter lentement 1,75 g de cristaux d’iode (j’ai₂), en remuant jusqu'à ce que complètement dissous. Cela va prendre plusieurs minutes.
      Attention : Cristaux d’iode (j’ai₂) peut causer des yeux, peau, irritation des voies respiratoires et/ou dommages. Porter des protections oculaires et cutanées et travailler sous une hotte de laboratoire lors de la manipulation de ce produit chimique.
   3. Filtrer la solution dans une bouteille en verre ambré à l’aide de papier filtre avec la taille des pores 11 microns pour enlever toute cristaux non dissous qui pouvait produire des taches incompatibles.
      Attention : Cette solution est très toxique pour la vie aquatique. Ne jetez pas de solution à égout. En cas de déversement, neutraliser le triiodure aqueux (j’ai₃^–) en iodure (I^–) avec du thiosulfate de sodium (Na₂S₂O₃) 5 % (m/v). Vérifiez les politiques institutionnelles d’élimination des déchets pour l’iodure et de disposer de ces déchets en conséquence.
2. Colorer le masque facial.
   1. Placez le masque facial, côté coupé vers le bas dans un verre ambré ou noirci de conteneur (pour garder la lumière) assez grand pour permettre le masque se reposer dans une forme naturelle et pour être complètement submergé.
   2. Napper le d’iode Lugol le masque jusqu'à ce qu’il soit totalement immergé. Un poids peut être nécessaire de garder le masque complètement submergé et empêcher de flotter vers le haut de la solution. Sceller le conteneur pour éviter l’évaporation et de garder la lumière.
   3. Agiter le récipient sans cesse sur une bascule électrique ou régulièrement à la main pour faciliter la même coloration et empêcher des cristaux de décantation pendant au moins deux semaines. Si un temps plus long est nécessaire pour colorer adéquatement les faisceaux musculaires, remplacez solution de Lugol solution fraîche.
   4. Après deux semaines, retirer le masque facial de la solution. Versez une petite quantité d’eau distillée sur les deux faces du masque à rincer. Envelopper le masque dans un essuie-tout humide et placer dans un sac plastique hermétique pendant au moins 24 heures afin de permettre un séchage léger avant de passer à l’étape suivante.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu pour une semaine. Assurez-vous que le masque reste légèrement humide pendant cette période.

3. DiceCT d’analyse

1. Se préparer à masque facial pour le balayage de CT.
   1. Monter les masques de visage sur un matériau de faible densité, tels que de la mousse florale, pour éliminer les plis dans le masque et à limiter le mouvement du masque comme le masque se dessèche légèrement lors de la numérisation. Fixez le masque facial à la mousse avec des cure-dents en bois.
2. Réglage des paramètres de balayage de CT et de numérisation.
   1. Utilisez une résolution élevée pour ces scans, car les petits fascicules sont obscurcis à résolution inférieure. Utilisez un espacement de tranche inter et inter distance pixel autour de 0,05 mm.
   2. Scannez le masque monté sur un Scanner de tomographie calculée à haute résolution des rayons x.
   3. Si fascicules n’arrivez pas à visualiser entièrement, à cause de trop de coloration, placer masque dans une solution de formol à 10 % ou thiosulfate de sodium 5 % à enlever une partie de la tache. Si fascicules ne sont pas suffisamment colorés, revenir de Lugol. Après le réglage de la coloration, renumériser le masque facial. Continuer à apporter les ajustements nécessaires et de numériser jusqu'à ce que les fascicules sont en mesure de visualiser entièrement.

4. préparer le masque facial pour la préservation à long terme.

1. Chimiquement, neutraliser la tache de l’iode dans le masque, retirer le processus de coloration de décoloration.
   1. Place teinté masque protecteur dans la solution de thiosulfate de sodium 5 % (m/v) pour neutraliser chimiquement spécimen. Cela peut prendre plusieurs heures ou jours. Agiter régulièrement pendant de décoloration.
   2. Masque facial détacher revenir en solution à 10 % de formol pour la préservation. Si tache toujours lixivier hors échantillon dans la solution, remplacez formol décoloré par le formol fraîche jusqu'à ce qu’il reste clair pour la préservation à long terme.

Résultats

Cette section présente des exemples de résultats sur la forme de la musculature faciale qui peuvent être obtenus à l’aide de « dissection inverse » en concert avec DiceCT à balayage. À l’aide de « dissection inverse » pour créer un masque facial, une représentation plus complète du muscle (du visage) mimétique parfois sont visibles que dans la méthodologie traditionnelle de dissection. Cette méthode fonctionne sur une gamme de tailles de corps depuis les primates m...

Discussion

Après les étapes de la dissection « inverse » protocole produit généralement un masque facial qui peut être lentement et méthodiquement disséqué pour révéler la musculature mimétique, quelle que soit la taille de la tête. Il est particulièrement important de circuler lentement et continuellement évaluer si les muscles ont été complètement couper à travers par inadvertance, surtout dans la plus petite des espèces valides.

Afin de déterminer où se trouve la musculature, ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nikon XTH 225 ST	Nikon		no catalog numbers
10% buffered formalin	Fisher Scientific	SF98-4
Iodine, ACS Grade	Lab Chem, Inc.	LC155901
Sodium thiosulfate	Acros Organics	AC450620010
Potassium Iodide	Alfa Aesar	A1270430